專利名稱：檢測dna樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的試劑盒、方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的試劑盒、引物組合、方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在特定位點(diǎn)形成突變是分子生物學(xué)實驗中常用的研究手段，可以有助于分析特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變對于基因功能的作用。通常而言，在構(gòu)建了目標(biāo)突變體后，如何對該位點(diǎn)是否正確發(fā)生了突變，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所面臨的問題。然而，目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中，對于特定位點(diǎn)突變的檢測仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的方法。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟使用擴(kuò)增引物對所述DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含所述預(yù)定位點(diǎn)；使用延伸引物以及ddNTP， 以所述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行寡核苷酸延伸反應(yīng)，以便獲得在所述延伸引物的3’端連接一個堿基的延伸產(chǎn)物，其中，所述延伸引物的3’端緊鄰所述預(yù)定位點(diǎn)；對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行分子量檢測，以便獲得所述延伸產(chǎn)物的分子量；以及基于所述延伸產(chǎn)物的分子量，確定所述預(yù)定位點(diǎn)的突變類型。由于延伸反應(yīng)是以包含預(yù)定位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，并且進(jìn)行延伸反應(yīng)的延伸引物的3’端緊鄰所述預(yù)定位點(diǎn)，并且在進(jìn)行延伸反應(yīng)時使用ddNTP作為原料， 因而可以保證延伸反應(yīng)可以僅延伸一個堿基，即對應(yīng)預(yù)定的位點(diǎn)，基于各個不同堿基的分子量存在較為顯著的區(qū)別，因而，通過對延伸產(chǎn)物的分子量進(jìn)行檢測，可以通過所獲得的延伸產(chǎn)物的分子量，來確定在預(yù)定位點(diǎn)是否發(fā)生了突變，以及所發(fā)生突變的類型。由此，可以廣泛應(yīng)用于分子生物領(lǐng)域，例如檢測是否成功構(gòu)建了相應(yīng)的突變體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的方法還可以具有下列附加技術(shù)特征根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述DNA樣品為人全基因組DNA。由此，可以有效地對人類中的基因突變進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述預(yù)定位點(diǎn)的突變?yōu)檫x自GJB2基因、GJB3基因、 SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變。由此，可以有效地檢測與耳聾相關(guān)的基因突變。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述GJB2基因的突變?yōu)檫x自35delG、167delT、 176-191dell6、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變?yōu)檫x自位點(diǎn) 538C > T和547G > A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變?yōu)檫x自^lC > T、589G > A、 919-2A > G、1174A > T、1226G > A、1229C > T、1975G > C、2027T > A、2162C > T、2168A > G和IVS15+5G > A的至少一種，以及所述mt DNA的突變?yōu)檫x自1494C > !“和1555A > G的至少一種。由此，可以有效地檢測遺傳性耳聾相關(guān)的基因突變。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述擴(kuò)增引物包括第一引物和第二引物，其中，針對所述GJB2基因的35deKi突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 1所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :2所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :33所示；針對所述GJB2基因的167delT突變， 所述第一引物為如SEQ ID NO :3所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :4所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:34所示；針對所述GJB2基因的176-191dell6突變，所述第一引物為如 SEQ ID NO :5所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 35 所示；針對所述GJB2基因的^9_300delAT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 7所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :36所示；針對所述GJB2 基因的235delC突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :9所示，所述第二引物為如SEQID NO 10所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:37所示；針對所述GJB3基因的538C>T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :11所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :12所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:38所示；針對所述GJB3基因的M7G > A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :13所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 14所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :39所示；針對所述SLC26A4基因的突變，所述第一引物為如SEQ ID NO: 15所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :16所示，所述延伸引物為如SEQID NO :40所示；針對所述SLC26A4 基因的589G> A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 17所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 18所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 41所示；針對所述SLC26A4基因的919-2A > G 突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :19所示，所述第二引物為如SEQ ID N0:20所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 42所示；針對所述SLC26A4基因的1174A > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 43所示；針對所述SLC26A4基因的> A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 44所示；針對所述SLC26A4基因的> T突變，所述第一引物為如SEQID NO 21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :45所示；針對所述SLC26A4 基因的1975G> C突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:47所示；針對所述SLC26A4基因的2027T>A 突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 48所示；針對所述SLC26A4基因的2162C > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :27所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 49所示；針對所述SLC26A4基因的2168A > G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 27所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J8所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:50所示；針對所述SLC26A4基因的IVS15+5G>A突變，所述第一引物為如SEQ ID N0:23所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 24所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 46所示；針對所述mtDNA 基因的1494C> T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO : 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :30所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :51所示；以及針對所述mt DNA基因的1555A> G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :31所示，所述第二引物為如SEQ ID N0:32所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:52所示。為方便表述，將上述引物組合分別總結(jié)與下表1和2中。
表1 針對上述20個耳聾基因突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物。
權(quán)利要求
1. 一種檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的方法，其特征在于，包括以下步驟使用擴(kuò)增引物對所述DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含所述預(yù)定位點(diǎn)；使用延伸引物以及ddNTP，以所述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行寡核苷酸延伸反應(yīng)，以便獲得在所述延伸引物的3’端連接一個堿基的延伸產(chǎn)物，其中，所述延伸引物的3’端緊鄰所述預(yù)定位點(diǎn)；對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行分子量檢測，以便獲得所述延伸產(chǎn)物的分子量；以及基于所述延伸產(chǎn)物的分子量，確定所述預(yù)定位點(diǎn)的突變類型，其中，優(yōu)選所述DNA樣品為人全基因組DNA，優(yōu)選所述預(yù)定位點(diǎn)的突變?yōu)檫x自GJB2基因、GJB3基因、SLU6A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，更優(yōu)選，所述 GJB2 基因的突變?yōu)檫x自35ddG、167delT、176-191dell6J99_300delAT 和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變?yōu)檫x自位點(diǎn)538C > !“和M7G > A的至少一種，所述 SLC26A4 基因的突變?yōu)檫x自 281C > T、589G > A、919_2A > G、1174A > TU226G > A、1229C > T、1975G > C、2027T > A、2162C > T、2168A > 6和 IVS15+5G > A 的至少一種， 以及所述mt DNA的突變?yōu)檫x自1494C > T和1555A > G的至少一種，所述擴(kuò)增引物包括第一引物和第二引物，優(yōu)選，針對所述GJB2基因的35deKi突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :1所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :2所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 33所示；針對所述GJB2基因的167delT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :3所示，所述第二引物為如SEQID NO :4所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :34所示；針對所述GJB2基因的176-191dell6突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :5所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :35所示；針對所述GJB2基因的 299_300delAT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :7所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 8 所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 36所示；針對所述GJB2基因的235delC突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :9所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 10所示，所述延伸引物為如 SEQ ID NO 37所示；針對所述GJB3基因的538C > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 11所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :12所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:38所示；針對所述GJB3基因的M7G>A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 13所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 14所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 39所示；針對所述SLC26A4基因的^1C>T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 15所示，所述第二引物為如SEQ ID NO: 16所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:40所示；針對所述SLC26A4基因的589G>A突變， 所述第一引物為如SEQ ID NO :17所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :18所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:41所示；針對所述SLC26A4基因的919-2A>G突變，所述第一引物為如SEQID NO :19所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :20所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 42所示；針對所述SLC26A4基因的1174A > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 21 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:43所示；針對所述SLC26A4基因的> A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :44所示；針對所述SLC26A4基因的> T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO: 22所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:45所示；針對所述SLC26A4基因的1975G>C突變， 所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 47所示；針對所述SLC26A4基因的2027T > A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 48所示；針對所述SLC26A4基因的2162C > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 27 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :49所示；針對所述SLC26A4基因的2168A > G突變，所述第一引物為如SEQID NO 27所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :50所示；針對所述SLC26A4基因的IVS15+5G>A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :23所示，所述第二引物為如SEQ ID NO : 所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :46所示；針對所述mt DNA基因的1494C > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO : 所示，所述第二引物為如SEQ ID N0:30所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:51所示；以及針對所述mt DNA基因的1555A > G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :31所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :32所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 52 所示，優(yōu)選所述第一引物和第二引物的5’端均具有標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為如SEQ ID NO 53所示，優(yōu)選在進(jìn)行所述寡核苷酸延伸反應(yīng)之前，進(jìn)一步包括使用堿性磷酸酶對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過MALDI-T0F質(zhì)譜檢測對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行分子量檢測，優(yōu)選在對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜檢測之前，進(jìn)一步包括對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，優(yōu)選利用陰離子樹脂對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化。
3.一種用于檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的系統(tǒng)，其特征在于，包括DNA樣品擴(kuò)增裝置，所述DNA樣品擴(kuò)增裝置，用于對所述DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含所述預(yù)定位點(diǎn)；擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置，所述擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置與所述DNA樣品擴(kuò)增裝置相連，以便從所述DNA樣品擴(kuò)增裝置接收擴(kuò)增產(chǎn)物，并且對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行寡核苷酸延伸反應(yīng)，以便獲得在所述延伸引物的3’端連接一個堿基的延伸產(chǎn)物，其中，所述延伸引物的3’端緊鄰所述預(yù)定位點(diǎn)；分子量檢測裝置，所述分子量檢測裝置與所述擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置相連，以便確定所述延伸產(chǎn)物的分子量；以及突變分析裝置，所述突變分析裝置基于所述延伸產(chǎn)物的分子量，確定所述預(yù)定位點(diǎn)的突變類型，其中，優(yōu)選所述DNA樣品擴(kuò)增裝置內(nèi)設(shè)置有擴(kuò)增引物對，所述擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置內(nèi)設(shè)置有延伸引物，優(yōu)選所述預(yù)定位點(diǎn)的突變?yōu)檫x自GJB2基因、GJB3基因、SLa6A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，更優(yōu)選所述GJB2基因的突變?yōu)檫x自35ddG、167delT、176-191dell6、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變?yōu)檫x自位點(diǎn)538C > !“和M7G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變?yōu)檫x自281C > T、589G > A、919_2A > G、1174A>T、1226G > A、1229C > T、1975G > C、2027T > A、2162C > T、2168A > G 和 IVS15+5G > A的至少一種，以及所述mt DNA的突變?yōu)檫x自1494C > T和1555A > G的至少一種，所述擴(kuò)增引物包括第一引物和第二引物，優(yōu)選針對所述GJB2基因的35deKi突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :1所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :2所示，所述延伸引物為如 SEQ ID N0:33所示；針對所述GJB2基因的167delT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 3 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :4所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :34所示；針對所述GJB2基因的176-191dell6突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :5所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :35所示；針對所述GJB2基因的 299_300delAT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :7所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 8 所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:36所示；針對所述GJB2基因的235delC突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :9所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 10所示，所述延伸引物為如 SEQ ID NO 37所示；針對所述GJB3基因的538C > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 11所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :12所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:38所示；針對所述GJB3基因的M7G>A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 13所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 14所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 39所示；針對所述SLC26A4基因的^1C>T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 15所示，所述第二引物為如SEQ ID NO: 16所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :40所示；針對所述SLC26A4基因的589G>A突變， 所述第一引物為如SEQ ID NO :17所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :18所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:41所示；針對所述SLC26A4基因的919-2A>G突變，所述第一引物為如SEQ IDNO 19所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :20所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 42所示；針對所述SLC26A4基因的1174A > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 21 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :43所示；針對所述SLC26A4基因的> A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :44所示；針對所述SLC26A4基因的> T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO: 22所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:45所示；針對所述SLC26A4基因的1975G > C突變， 所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 47所示；針對所述SLC26A4基因的2027T > A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 48所示；針對所述SLC26A4基因的2162C > T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 27 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :49所示；針對所述SLC26A4基因的2168A > G突變，所述第一引物為如SEQID NO 27所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :50所示；針對所述SLC26A4基因的 IVS15+5G > A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :23所示，所述第二引物為如SEQ IDNO 24所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:46所示；針對所述mt DNA基因的1494C > T突變， 所述第一引物為如SEQ ID NO : 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :30所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:51所示；以及針對所述mt DNA基因的1555A > G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 31所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 32所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 52所示，優(yōu)選進(jìn)一步包括擴(kuò)增產(chǎn)物凈化裝置，所述擴(kuò)增產(chǎn)物凈化裝置分別與所述DNA樣品擴(kuò)增裝置和所述擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置相連，以便對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凈化處理，并將經(jīng)過凈化的擴(kuò)增產(chǎn)物輸入至所述擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述分子量檢測裝置為MALDI-T0F質(zhì)譜裝置。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，進(jìn)一步包括延伸產(chǎn)物純化裝置， 其中，所述延伸產(chǎn)物純化裝置分別與所述擴(kuò)增產(chǎn)物延伸裝置和所述MALDI-T0F質(zhì)譜裝置相連，以便對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，并將經(jīng)過純化的延伸產(chǎn)物輸入至所述MALDI-T0F 質(zhì)譜裝置，優(yōu)選所述延伸產(chǎn)物純化裝置為陰離子樹脂。
6.一種診斷遺傳性耳聾的方法，其特征在于，包括以下步驟 提取懷疑患有遺傳性耳聾的受試者的DNA樣品；根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法對所述DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變進(jìn)行分析；以及基于所述DNA樣品中存在所述預(yù)定位點(diǎn)的突變，確定所述受試者患有遺傳性耳聾。
7.一種產(chǎn)前診斷遺傳性耳聾的方法，其特征在于，包括以下步驟分離胎兒的DNA樣品，優(yōu)選所述胎兒的DNA樣品是從絨毛膜、羊水或臍帶血取樣中提取的；根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法對所述胎兒的DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變進(jìn)行分析；以及基于所述胎兒的DNA樣品中存在所述預(yù)定位點(diǎn)的突變，推測所述胎兒患有遺傳性耳ο
8.一種預(yù)測電子耳蝸效果的方法，其特征在于，包括以下步驟 提取耳聾患者的DNA樣品；根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法對所述DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變進(jìn)行分析； 基于所述DNA樣品中存在所述預(yù)定位點(diǎn)的突變，確定所述耳聾患者患有遺傳性耳聾； 基于所述耳聾患者患有遺傳性耳聾，預(yù)測電子耳蝸對于所述耳聾患者有效。
9.一種引物組合，其特征在于，包括擴(kuò)增引物對，所述擴(kuò)增引物對適于對DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物， 所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含預(yù)定位點(diǎn)；以及延伸引物，所述延伸產(chǎn)物適于利用ddNTP，以所述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行寡核苷酸延伸反應(yīng)，以便獲得在所述延伸引物的3’端連接一個堿基的延伸產(chǎn)物，其中，所述延伸引物的 3’端緊鄰所述預(yù)定位點(diǎn)，所述預(yù)定位點(diǎn)的突變?yōu)檫x自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變?yōu)檫x自35delG、167delT、176_191del 16、 299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變?yōu)檫x自位點(diǎn)538C > T和M7G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變?yōu)檫x自281C > T、589G > A、919_2A > G、1174A>Τ、1226G > A、1229C > Τ、1975G > C、2027T > A、2162C > T、2168A > G 和 IVS15+5G > A 的至少一種，以及所述mt DNA的突變?yōu)檫x自1494C > T和1555A > G的至少一種，所述擴(kuò)增引物包括第一引物和第二引物，其中，針對所述GJB2基因的35deKi突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :1所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :2所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :33所示；針對所述GJB2基因的 167delT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :3所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :4所示， 所述延伸引物為如SEQ ID NO 34所示；針對所述GJB2基因的176_191dell6突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :5所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :6所示，所述延伸引物為如 SEQ ID NO 35所示；針對所述GJB2基因的^9_300delAT突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :7所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :36所示； 針對所述GJB2基因的235delC突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :9所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :10所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:37所示；針對所述GJB3基因的538C>T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 11所示，所述第二引物為如SEQ ID NO: 12所示， 所述延伸引物為如SEQ ID NO 38所示；針對所述GJB3基因的M7G > A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :13所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 14所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :39所示；針對所述SLC26A4基因的^1C>T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO: 15所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :16所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:40所示；針對所述SLC26A4基因的589G>A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 17所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :18所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :41所示；針對所述SLC26A4基因的919-2A>G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 19所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :20所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :42所示；針對所述SLC26A4基因的1174A > T 突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID N0:22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 43所示；針對所述SLC26A4基因的> A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 44所示；針對所述SLC26A4基因的> T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 21所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :22所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:45所示；針對所述SLC26A4基因的1975G > C突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :47所示；針對所述SLC26A4 基因的2027T> A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :25所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J6所示，所述延伸引物為如SEQ ID Ν0:48所示；針對所述SLC26A4基因的2162C>T 突變，所述第一引物為如SEQID NO :27所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 49所示；針對所述SLC26A4基因的2168A > G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :27所示，所述第二引物為如SEQ ID NO J8所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 50所示；針對所述SLC26A4基因的IVS15+5G > A突變，所述第一引物為如SEQ ID NO 23所示，所述第二引物為如SEQ ID NO : 所示，所述延伸引物為如SEQ ID N0:46所示；針對所述mt DNA基因的1494C> T突變，所述第一引物為如SEQ ID NO : 所示，所述第二引物為如SEQ ID NO 30所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO 51所示；以及針對所述mt DNA基因的1555A> G突變，所述第一引物為如SEQ ID NO :31所示，所述第二引物為如SEQ ID NO :32所示，所述延伸引物為如SEQ ID NO :52所示，優(yōu)選所述第一引物和第二引物的5’端均具有標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為如SEQ ID NO 53所示。
10. 一種試劑盒，其特征在于，包括 權(quán)利要求9所述的一種引物組合，優(yōu)選所述試劑盒用于選自檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變、診斷遺傳性耳聾、產(chǎn)前診斷遺傳性耳聾、以及預(yù)測電子耳蝸效果的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的引物、試劑盒、方法及應(yīng)用。檢測DNA樣品中預(yù)定位點(diǎn)的突變的方法包括以下步驟使用擴(kuò)增引物對DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，使用延伸引物以及ddNTP，以所述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行寡核苷酸延伸反應(yīng)，以便獲得在所述延伸引物的3’端連接一個堿基的延伸產(chǎn)物；以及基于延伸產(chǎn)物的分子量，確定所述預(yù)定位點(diǎn)的突變類型。可以有效地確定在預(yù)定位點(diǎn)是否發(fā)生了突變，以及所發(fā)生突變的類型。
文檔編號C12Q1/68GK102409089SQ20111030171
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者馮大飛, 劉興旺, 楊煥明, 汪建, 王俊, 王夏曼, 鄒婧 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司