專利名稱：鉑類藥物療效相關(guān)基因snp檢測特異性序列和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及鉬類藥物療效相關(guān)基因ERCC1、ERCC2、XRCCl和GSTPl的SNP檢測的特異性序列和液相芯片。
背景技術(shù)：
自從1967年順鉬的抗癌活性被發(fā)現(xiàn)以來，鉬類抗癌藥物的研究和應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。目前已發(fā)展出以卡鉬為代表的第二代，和以奧沙利鉬為代表的第三代鉬類藥物。 鉬類是目前常用的廣譜抗腫瘤藥，已成為癌癥化療中不可缺少的藥物。鉬類藥物的療效雖得到廣泛認(rèn)可，但患者用藥后藥效的個(gè)體差異很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系統(tǒng)毒性，常見為惡心、嘔吐，還可有腎毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神經(jīng)毒性較輕。鉬類藥物的抗腫瘤作用是通過作用于DNA，形成Pt-DNA結(jié)合物，導(dǎo)致DNA的鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成及復(fù)制。大量的臨床研究已經(jīng)證實(shí)，鉬類藥物的療效/毒副作用與患者體內(nèi)四個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)關(guān)系密切，即ERCC1、ERCC2、XRCCl和 GSTPl。ERCCl和ERCC2都是DNA核苷酸切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因，XRCCl是DNA堿基切除修復(fù)途徑中的重要因子。GSTPl是一種谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，它通過將有毒物質(zhì)的親電子基團(tuán)與谷胱甘肽結(jié)合，起到保護(hù)細(xì)胞大分子的作用。這四個(gè)基因通過參與DNA修復(fù)等生理過程，使受鉬類化合物破壞的DNA回復(fù)正?；蚴笵NA免受破壞，在腫瘤細(xì)胞中造成耐藥，而在正常細(xì)胞中則能夠減少毒副作用。因此，專家推薦患者在接受鉬類化療之前，進(jìn)行相關(guān)的基因SNP檢測，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè)體差異制定個(gè)體化用藥方案。這樣將明顯提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。大量臨床研究顯示，最常見的造成這四個(gè)基因功能減弱的多態(tài)性位點(diǎn)分別是 ERCCl 的 C19007T 和 C8092A，ERCC2 的 A2282C, XRCCl 的 G1301A,以及 GSTPl 的 A1578G。在中國人群中，ERCC1-C19007T、ERCC1-C8092A、ERCC2-A2282C 和 XRCC1-G1301A 的基因分布頻率分別約為21%、對％、5%和30% ；GSTP1-A1578G基因分布頻率約21%。大量研究表明， 在ERCC1、ERCC2、XRCC1這三個(gè)基因中攜有一個(gè)或以上功能減弱等位基因型的患者，在接受鉬類化療時(shí)，發(fā)生毒副作用的幾率明顯升高，以致治療效果較差。而GSTP1-A1578G基因多態(tài)性位點(diǎn)的情況正好相反，遺傳基因型為GA或GG的患者，在接受鉬類化療時(shí)，對鉬類藥物的反應(yīng)率較高、有較好的療效。因此，通過對這五個(gè)常見功能SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測，根據(jù)患者的基因型判斷是否采用鉬類藥物或制定個(gè)體化用藥方式，將能明顯提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。目前已建立了若干以PCR為基礎(chǔ)的檢測基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的技術(shù)，如直接測序法，半定量PCR技術(shù)，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測，以上技術(shù)具有靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高等缺點(diǎn)。普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性不能滿足臨床的需要。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進(jìn)行一種SNP位點(diǎn)的檢測，耗時(shí)費(fèi)力 ’傳統(tǒng)的固相芯片價(jià)格昂貴，而且敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差?；谛酒脑?，美國 Luminex公司開發(fā)出了以微球?yàn)檩d體的懸浮液相芯片技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺(tái)，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報(bào)告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex 閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強(qiáng)度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號(hào)分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度，再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測的要求，同時(shí)具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。我們采用x-Taq液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供與鉬類藥物療效密切相關(guān)的ERCC1、ERCC2、XRCCl和 GSTPl基因SNP檢測液相芯片。該液相芯片可用于單項(xiàng)或者并行檢測以下5個(gè)常見的SNP位點(diǎn)=ERCCl 的 C19007T 和 C8092A，ERCC2 的 A2282C, XRCCl 的 G1301A,以及 GSTPl 的 A1578G。一種鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，包括有1.針對每種型別的SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異ASPE引物對，每種 ASPE引物由3’端的針對目的基因SNP位點(diǎn)的特異性序列和5’端的tag序列組成，所述野生型及突變型特異性ASPE引物對分別選自=SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3及 SEQID NO. 4,SEQ ID NO. 5及 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7及 SEQ ID NO. 8、和 /或SEQ IDN0. 9 及 SEQ ID NO. 10 ；2.分別包被有特異的anti-tag序列1的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1) 中所選tag序列互補(bǔ)配對；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 11 SEQ ID N0. 20中的序列；優(yōu)選地，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；3.針對 ERCCl 基因的 C19007T、ERCC1 基因的 C8092A、ERCC2 基因的 A2282C、XRCC1 基因的G1301A、和/或GSTPl基因的A1578G SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物。優(yōu)選地，分別擴(kuò)增出五個(gè)具有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物選自SEQ ID N0. 21 SEQ ID N0. 30中的序列，即針對 C19007T 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22，針對 C8092A 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24，針對 A2282C 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26，針對 G1301A 的 SEQ IDN0. 27 和 SEQ ID N0. 28，針對 A1578G 的 SEQ ID N0. 29 和 SEQ ID N0. 30。本發(fā)明的另一目的是提供用于鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測的特異性序列，該序列特性強(qiáng)，能準(zhǔn)確區(qū)分SNP的各種基因型。所述特異性序列為針對ERCCl基因的C19007T的SNP位點(diǎn)的SEQ ID N0. 31及SEQ IDN0. 32、針對 ERCCl 基因的 C8092A 的 SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34、針對ERCC2基因的A2282C的SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO. 35及SEQ ID NO. 36、針對XRCCl基因的 G1301A 的 SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38、和 / 或針對 GSTPl 基因的 A1578G 的 SNP 位點(diǎn)的 SEQID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達(dá)100%。所制備的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及 anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分SNP的各種
基因型。3.使用本發(fā)明所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片的檢測方法步驟簡單，可通過一步多重PCR即可完成五個(gè)具有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次 PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨
床需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷， 同時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片試劑盒，主要包括有一、特異性引物序列(ASPE引物)針對鉬類藥物療效相關(guān)基因的各5個(gè)常見SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異性的引物序列。 ASPE弓丨物由Tag+特異性引物序列組成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE弓丨物序列(Tag+特異引物)
權(quán)利要求
1.一種鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，包括有(1).針對XRCCl基因的G1301ASNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異ASPE引物對，每種ASPE引物由3’端的針對目的基因SNP位點(diǎn)的特異性序列和5’端的tag序列組成，所述野生型及突變型特異性ASPE引物對為SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ；(2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 18中的序列；(3).針對XRCCl基因的G1301ASNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，(3)中所述引物為針對 G1301A 的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
5.一種鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).針對每種型別的SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異ASPE弓丨物，每種ASPE 引物由3’端的針對目的基因SNP位點(diǎn)的特異性序列和5’端的tag序列組成，所述野生型及突變型特異性ASPE引物對為針對XRCCl基因的G1301A的SEQ ID NO. 7及SEQ IDN0. 8， 以及選自針對ERCCl基因的C19007T的SEQ ID NO. 1及SEQ ID N0. 2、針對ERCCl基因的 C8092A 的 SEQ ID N0. 3 及 SEQ ID N0. 4、針對 ERCC2 基因的 A2282C 的 SEQ IDN0. 5 及 SEQ ID N0. 6、和針對GSTPl基因的A1578G的SEQ ID N0. 9及SEQ ID NO. 10中的一對以上；(2).分別包被有特異的anti-tag序列的10種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對；所述 anti-tag 序列選自 SEQ ID NO. 11 SEQ ID N0. 20 中的序列；(3).擴(kuò)增出具有需要檢測的、相應(yīng)SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物對針對XRCCl基因的 G1301A 的 SEQ ID N0. 27 及 SEQ ID N0. 28，以及選自針對 ERCCl 基因的 C19007T 的 SEQ ID N0. 21 及 SEQ ID N0. 22、針對 ERCCl 基因的 C8092A 的 SEQ ID N0. 23 及 SEQ IDN0. 24、針對 ERCC2 基因 A2282C 的 SEQ ID N0. 25 及 SEQ ID N0. 26、和針對 GSTPl 基因的 A1578G 的 SEQ ID N0. 29 及 SEQ ID N0. 30 中的一對以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
8.一種用于鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測的特異性序列，其特征是，所述特異性序列包括有針對XRCCl基因的G1301A的SNP位點(diǎn)的SEQ ID N0. 37及SEQ ID N0. 38。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的鉬類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述特異性序列還包括有針對ERCCl基因的C19007T的SEQ ID N0. 31及SEQ ID N0. 32、針對ERCCl 基因的 C8092A 的 SEQ ID N0. 33 及 SEQ ID N0. 34、針對 ERCC2 基因的 A2^2C 的 SEQ ID N0. 35 及 SEQ ID N0. 36、和 / 或針對 GSTPl 基因的 A1578G 的 SEQ ID N0. 39 及 SEQ ID N0. 40。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鉑類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測特異性序列、液相芯片，所述液相芯片主要包括有選自SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQID NO.5及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、和/或SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10的野生型及突變型特異性ASPE引物對；分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列選自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的序列；擴(kuò)增SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。本發(fā)明所述檢測液相芯片及檢測方法的檢測靈敏度高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102312008SQ20111030172
公開日2012年1月11日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者何嘉英, 楊惠夷, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司