一種美麗庫蠓特異基因及其分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及物種鑒定領(lǐng)域，具體設(shè)及一種庫朦的C0I基因序列及其分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 庫朦是我國Ξ大吸血朦之一，可傳播藍(lán)舌病、住球蟲病等多種人獸共患病，是一種 重要的病媒生物。因此，對(duì)吸血朦的鑒定和識(shí)別，是監(jiān)測與控制朦傳疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，也是 疾病預(yù)防控制領(lǐng)域的核屯、步驟。目前，對(duì)吸血朦的鑒定主要依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的分類學(xué)專家識(shí) 別形態(tài)學(xué)特征來實(shí)現(xiàn)，一旦遇到近緣種和形態(tài)特征掌握不全的標(biāo)本鑒定就很棘手;而且，對(duì) 吸血朦的形態(tài)鑒定需要通過制作玻片標(biāo)本來完成，操作步驟繁瑣、周期長、難度大，因此，亟 需尋求一種新的方法，W彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的缺陷。
[0003] DNA條形碼(DNA barcode)是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異 的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。DNA條形碼技術(shù)是利用生物體DNA中一段保守片段對(duì)物種 進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個(gè)行之有效的生物 鑒定手段，不僅可對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法作強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且因?yàn)槠涓陀^、準(zhǔn)確，突破W往對(duì) 經(jīng)驗(yàn)的過度依賴，有利于幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級(jí)階元的演化關(guān)系 等。
[0004] 作為DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)目的基因，一方面必須足夠保守，便于利用通用引物進(jìn)行 大范圍的擴(kuò)增;另一方面要有足夠的變異來區(qū)分不同物種。因此，鑒定不同的物種類群需要 選擇有效的目的基因。目前，在系統(tǒng)發(fā)育研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)志基因是核糖體12S和16S基 因，但因其存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，不宜用做條形編碼基因。線粒體基因組中存在的13 個(gè)蛋白編碼基因中僅細(xì)胞色素氧化酶亞基1(切tochrome Oxidase Subunit I, C0 I)、線 粒體細(xì)胞色素 KCy憂）、ND4、ND5運(yùn)4個(gè)基因滿足基因插入和缺失現(xiàn)象較少、長度在900 bp左右運(yùn)兩個(gè)條件，但ND4和ND5進(jìn)化太快，不可能設(shè)計(jì)出通用引物，限制了它們作 為全面DNA鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因。故人們最終選定C0 I基因中的一個(gè)片段作為DNA條形編 碼基因。迄今為止，已有諸多研究證明C0 I基因在鳥類、魚類、鱗翅目昆蟲、蚊類、蟻類和彈 尾目等類群的分類鑒定中行之有效。因此，可采用基于C0 I基因的DNA條形碼技術(shù)對(duì)吸血 朦進(jìn)行分子鑒定。該方法與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全等 問題，而且可實(shí)現(xiàn)吸血朦的快速鑒定。目前，通過該方法已獲得多種吸血朦的C0I基因序列 并上傳 Genbank中，但至今尚無美麗庫朦的相關(guān)基因序列。本發(fā)明提供的美麗庫朦基因序列 有利于實(shí)現(xiàn)美麗庫朦的快速鑒定，縮短鑒定時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供一種庫朦的C0I基因序列。通過分子生物學(xué)方法獲取美麗 庫朦(Culicoides bellulus)的C0I基因序列，通過基因序列相似性的比對(duì)，可準(zhǔn)確、快速地 鑒定美麗庫朦。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 采用小型昆蟲微量DM模板制備方法，通過改進(jìn)的PCR反應(yīng)條件，由合成的引物擴(kuò)增 該庫朦的COI基因，PCR產(chǎn)物序列送由專業(yè)生物公司測定。測序結(jié)果通過手工校對(duì)、序列拼 接，并在NCBI中進(jìn)行Blast相似性捜索，確保所得序列為目標(biāo)序列。本發(fā)明所述的美麗庫 朦特異基因，為COI基因，所述庫朦的C0 I基因序列如SEQ ID No.l所示(不含引物）：
[0007] 本發(fā)明所述的美麗庫朦C0I基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0008] 本發(fā)明所述的美麗庫朦的分子鑒定方法，包括： 1)從待測的昆蟲組織中分離提取DNA; 2似該DNA為模板，采用的引物為:正向引物5 ' AATCATAAAGATATTGGAAC 3 '，反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出該昆蟲的C0I基因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的C0I基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)漠乙 錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。若能相應(yīng)地特異性擴(kuò)增出大小 約為658 bp的條帶，送生物公司測序； 4) 根據(jù)測序結(jié)果，若目標(biāo)基因序列與SEQ ID No.l的相似性在98%W上，即可判斷所述 的待測組織為美麗庫朦。
[0009] 美麗庫朦的種類鑒定依靠形態(tài)學(xué)鑒定所實(shí)現(xiàn)，并經(jīng)權(quán)威專家復(fù)核，從而保證了結(jié) 果的可靠性。
[0010] 所述引物根據(jù)文獻(xiàn)合成，正向引物5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3'，反向引物5' CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0011] 本發(fā)明可用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法檢測擴(kuò)增結(jié)果。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為： 1)本發(fā)明采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子分類方法相結(jié)合，對(duì)所述庫朦進(jìn)行鑒定，可確 保物種鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0013] 2)與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明建立的美麗庫朦分子鑒定方法可有效縮 短美麗庫朦的鑒定時(shí)間。
【附圖說明】
[0014]圖1為美麗庫朦C0I基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。編號(hào)說明如下：泳道1為陰性對(duì) 照，2-5均為美麗庫朦雌蟲的C0I基因，檢出大小約為658 bp的條帶。Μ為化2000的DNA m曰rker〇
[001引圖2為未知庫朦雌蟲C0I基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。編號(hào)說明如下：泳道1為陰 性對(duì)照，2為未知庫朦雌蟲的C0I基因，檢出大小約為658 bp的條帶。Μ為化2000的DNA m曰rker0
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1美麗庫朦(化licoides bellulus)C0I基因序列的獲取 1、美麗庫朦標(biāo)本的獲取 美麗庫朦為野外采集獲得的標(biāo)本，經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。標(biāo)本制成玻片 后經(jīng)權(quán)威專家鑒定，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)本制作前，挑取美麗庫朦胸部末端和腹部前 幾節(jié)置于95%酒精中，供DNA提取。
[0017] 2、DNA模板制備 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法提取美麗庫朦DNA(文禮章主編.昆蟲學(xué)研究方法 與技術(shù)導(dǎo)論[M].北京:科學(xué)出版社，2010.278-286)，提取的DNA樣品于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[001引3、引物合成 本實(shí)施例所用引物如下： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0019] 4、PCR 擴(kuò)增 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表1所示。
[0020] 表1美麗庫朦C0I基因 PCR反應(yīng)體系巧OuL體系）
本實(shí)施例的反應(yīng)程序如表2所示。
[0021 ] 表2美麗庫朦C0I基因 PCR反應(yīng)程序
PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 取扣L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35 min)。漠乙錠染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖1。
[0023] 6、基因序列測定 選取3-5個(gè)效果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由生物公司純化后測序(測序所用引物與PCR所 用引物相同），所得基因序列經(jīng)校正拼接后即為美麗庫朦的C0 r基因序列一SEQ ID No.1。
[0024] 實(shí)施例2未知庫朦的鑒定 1、標(biāo)本的采集與保存 采用揮網(wǎng)法或燈誘法進(jìn)行采集，采獲的標(biāo)本經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。
[00巧]2、DNA模板制備 在解剖鏡或體視顯微鏡下，從采集到的朦類標(biāo)本中隨機(jī)挑選出一只雌性庫朦，采用小 型昆蟲微量DNA模板制備方法提取庫朦DNA(文禮章主編.昆蟲學(xué)研究方法與技術(shù)導(dǎo)論[M]. 北京:科學(xué)出版社，2010.278-286)，提取的DNA樣品于-20°C保存?zhèn)溆?，每份?biāo)本一個(gè)編號(hào)。
[0026] 3、目的基因序列的獲取 3.1引物合成 W獲得的未知庫朦DNA為模板，合成引物，所用引物序列如下： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0027] 3.2 PCR擴(kuò)增 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表3所示。
[002引 表3未知庫朦C0I基因 PCR反應(yīng)體系巧OuL體系)_
本實(shí)施例的反應(yīng)程序如表4所示。
[0029] 表4未知庫朦C0I基因 PCR反應(yīng)程序
PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與基因序列測定 取扣L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35 min)。漠化乙錠染色。凝 膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖2。由附圖2看出實(shí)施例2的未知庫朦也能特異性擴(kuò)增出 大小約為658 bp的產(chǎn)物，將大小約為658 bp的產(chǎn)物送生物公司測序，結(jié)果顯示與基因序 列SEQ ID NO. 1的相似性為99.9%，因而可判定該未知庫朦為美麗庫朦。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種美麗庫朦特異基因，其特征在于，所述特異基因序列為COI基因，為如下所述的 基因序列沈Q ID No. 1:ο2. 權(quán)利要求1所述的庫朦的COI基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分別為： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。3. -種美麗庫朦的分子鑒定方法，包括： 1) 從待測的昆蟲組織中分離提取DNA; 2. W該DNA為模板，對(duì)C0I基因采用的引物為:正向引物5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3'， 反向引物5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出美麗庫朦COI基 因； 3) 然后取步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的C0I基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)漠乙錠染 色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出大小約為658 bp的條帶，送生物公司測序； 4) 根據(jù)測序結(jié)果，如果相應(yīng)C0I基因序列與SEQ ID No.l的相似性在98%W上，即可判斷 所述的待測組織為美麗庫朦。
【專利摘要】本發(fā)明公開<b>一種美麗庫蠓特異基因及其分子鑒定方法，</b>其特征在于采用分子生物學(xué)方法獲取該庫蠓的COⅠ基因序列，通過基因序列相似性的比對(duì)，對(duì)該庫蠓進(jìn)行種類鑒定。本發(fā)明提供的美麗庫蠓分子鑒定方法，有利于實(shí)現(xiàn)美麗庫蠓準(zhǔn)確、快速的鑒定。
【IPC分類】C12N15/53, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105543249
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610011293
【發(fā)明人】陳敏, 黃恩炯, 蔡怡珊, 高博, 張建慶, 王飛鵬
【申請(qǐng)人】福建國際旅行衛(wèi)生保健中心
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月8日