一種無(wú)須鱈魚實(shí)時(shí)熒光pcr特異性檢測(cè)體系及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系及應(yīng)用。引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。采用無(wú)須鱈魚特異性檢測(cè)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增無(wú)須鱈魚的Co Ⅰ基因，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增后會(huì)產(chǎn)生一條特異性擴(kuò)增曲線，從而將無(wú)須鱈魚成分進(jìn)行特異性鑒定。本發(fā)明特異性引物設(shè)計(jì)合理，用于無(wú)須鱈魚的物種檢測(cè)，特異性好，檢測(cè)靈敏度高，即經(jīng)過(guò)熒光PCR分析，即可將無(wú)須鱈魚成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
【專利說(shuō)明】
一種無(wú)須鱈魚實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè) 體系及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 無(wú)須鱈，學(xué)名Merluccius Merluccius，隸屬于鱈科，無(wú)須屬，體長(zhǎng)，頭大，牙大而 尖。有背鰭二個(gè)，第二背鰭長(zhǎng)，靠近中部有淺凹刻。臀鰭亦長(zhǎng)且有凹刻。腹鰭前位，在胸鰭之 前。為游速快的肉食性魚類。
[0003] 通過(guò)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷是對(duì)無(wú)須鱈魚識(shí)別的傳統(tǒng)方法，但是這些形態(tài)學(xué)特征的 可塑性強(qiáng)，受環(huán)境影響大，具有人為的主觀傾向性，且存在豐富的近緣物種，近緣種間的形 態(tài)差異細(xì)微，所以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征識(shí)別方法存在識(shí)別困難與識(shí)別錯(cuò)誤的問(wèn)題。
[0004] 采用DNA技術(shù)鑒定動(dòng)物物種是物種識(shí)別方法中最為熱門也是發(fā)展最快的分子技 術(shù)，快速進(jìn)化并呈母系遺傳的線粒體DNA是種群遺傳學(xué)和進(jìn)化遺傳學(xué)的理想研究對(duì)象。目 前，魚類物種的分子檢測(cè)主要集中Col基因，無(wú)須鱈魚與其它近源物種的Col基因序列相似 度在90%左右，序列之間存在著一定的差異。實(shí)時(shí)熒光PCR是DNA技術(shù)鑒定中快捷高效的技 術(shù)之一，指在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過(guò)熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn) 物總量的方法，研究利用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)無(wú)須鱈魚進(jìn)行物種識(shí)別及在無(wú)須鱈魚的物種保護(hù) 及系統(tǒng)發(fā)育研究等領(lǐng)域均具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種無(wú)須鱈魚物種特異性檢測(cè)體系及該特異性檢測(cè)體系的應(yīng)用方法。 本發(fā)明可以檢測(cè)出來(lái)自動(dòng)物樣品的微量DNA，完全區(qū)分無(wú)須鱈魚的基因與其它魚類基因，檢 測(cè)靈敏度高，方法快速，易操作。
[0006] 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特 異性檢測(cè)引物和檢測(cè)體系，其中所述的引物序列是：
[0007] 上游引物SEQ ID N0 · 1:5 ' -GTCACGGCACACGCCTTC-3 ' ；
[0008] 下游引物SEQ ID NO · 2:5 ' -GGAGGAGCAGGAACGATGG-3 ' ；
[0009] 進(jìn)一步地，所述無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系還包括由其他試劑所 組成的反應(yīng)體系如下表1:
[0010]表1無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的反應(yīng)體系
[0011]
[0012] 其中，SYBR?Premix Ex Taq購(gòu)自于大連寶生物工程有限公司（商品貨號(hào):RR820)
[0013] 進(jìn)一步地，所述無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的反應(yīng)參數(shù)如下表2:
[0014] 表2無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的反應(yīng)參數(shù)
[0015]
[0016] -種根據(jù)所述的無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的應(yīng)用，利用SYBR? Green I與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的特性，監(jiān)測(cè)每一PCR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以檢測(cè)反應(yīng)體系中 的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017] 進(jìn)一步地，所述無(wú)須鱈魚物種進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)方法為:采用無(wú)須鱈魚 物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系擴(kuò)增無(wú)須鱈魚的Col基因，以SYBR^remix Ex Taq DNA 聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用SYBRR3Green I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光的特性，檢測(cè)反應(yīng)體系 中的SYBR?Green I與DNA結(jié)合后發(fā)出的熒光，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量目的。通過(guò)設(shè)計(jì)無(wú) 須鱈魚物種特異性引物，從而引發(fā)特異性擴(kuò)增，通過(guò)熒光信號(hào)的收集處理，獲得特異性擴(kuò)增 曲線。本發(fā)明特異性引物設(shè)計(jì)合理，用于無(wú)須鱈魚物種檢測(cè)，特異性好，檢測(cè)靈敏度高。采用 本方法檢測(cè)無(wú)須鱈魚動(dòng)物成分結(jié)果顯示，采用無(wú)須鱈魚物種特異性檢測(cè)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR擴(kuò)增無(wú)須鱈魚的Col基因，會(huì)產(chǎn)生一條特異性擴(kuò)增曲線，即經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR分析，即可 將無(wú)須鱈魚成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1.相似序列的物種分布情況，其中，方框內(nèi)的物種為無(wú)須鱈魚所在的位置；
[0019] 圖2.引物的特異性分析，如圖所示只有Merluccius Merluccius的物種能和所設(shè) 計(jì)的引物完全互補(bǔ)結(jié)合，沒(méi)有檢驗(yàn)到完全匹配的其它物種，證明引物的特異性較好；
[0020] 圖3.引物PCR擴(kuò)增的電泳檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：]?、01^00011^46〇1、無(wú)須鱈魚2、無(wú)須 鱈魚3、太平洋鱈魚4、黑線鱈5、大西洋鱈6、阿拉斯加鱈魚7、空白對(duì)照。
[0021 ]圖4.無(wú)須鱈魚實(shí)時(shí)熒光PCR的溶解曲線檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：1、無(wú)須鱈魚2、無(wú)須鱈魚 3、太平洋鱈魚4、黑線鱈5、大西洋鱈6、阿拉斯加鱈魚7、空白對(duì)照。
[0022]圖5.無(wú)須鱈魚與其他鱈形目海洋魚類的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：1、 無(wú)須鱈魚2、綠青鱈3、太平洋鱈魚4、藍(lán)鱈魚5、黑線鱈6、大西洋鱈7、黑鱈8、阿拉斯加鱈魚9、 空白對(duì)照。
[0023]圖6 ·靈敏度分析結(jié)果圖，圖中：1、25ngAiL擴(kuò)增結(jié)果;2、5ngAiL擴(kuò)增結(jié)果;3、lng/yL 擴(kuò)增結(jié)果;4、0.2ngAiL擴(kuò)增結(jié)果;5、0. (Mng/yL擴(kuò)增結(jié)果;6、0.0 lng/yL擴(kuò)增結(jié)果;7、空白對(duì) 照。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施 例。本發(fā)明下述具體實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法，所用 的試劑或藥品，如無(wú)特殊說(shuō)明，均由常規(guī)方法制備或者可由商業(yè)途徑獲得，其中所用空白對(duì) 照為水。
[0025]實(shí)施例1熒光PCR特異性檢測(cè)引物序列的設(shè)計(jì)
[0026] 1.無(wú)須鱈魚相近物種Col基因的分析
[0027] 登錄NCBI (http: //www.ncbi .nlm.nih. g N程序在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性序列的 搜索，返回的相似序列的物種分布情況如圖1所示，并將所有序列以Merluccius Merluccius及Col為關(guān)鍵詞在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，將搜索結(jié)果的序列下載存盤后，進(jìn)行 Blast列下載存盤。圖1為相似序列的物種分布情況，其中，方框內(nèi)的物種為無(wú)須鱈魚所在的 位置。
[0028] 2.無(wú)須鱈魚物種特異性檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
[0029] 將下載的序列進(jìn)行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差異處設(shè)計(jì)特異性 引物。
[0030] 3.無(wú)須鱈魚物種特異性檢測(cè)引物的特異性分析
[0031]將設(shè)計(jì)好的引物在NCBI中，利用primer blast程序選擇nr數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行引物的特 異性分析，如圖2結(jié)果所示:在返回的結(jié)果中，只有Merluccius Merluccius的物種能和所設(shè) 計(jì)的引物完全互補(bǔ)結(jié)合，沒(méi)有檢驗(yàn)到完全匹配的其它物種，證明引物的特異性較好。
[0032] 4.無(wú)須鱈魚物種特異性檢測(cè)引物合成
[0033] 在寶生物公司合成無(wú)須鱈魚物種特異性檢測(cè)引物1對(duì)，其序列為：
[0034] 上游引物SEQ ID N0 · 1:5 ' -GTCACGGCACACGCCTTC-3 ' ；
[0035] 下游引物SEQ ID NO · 2:5 ' -GGAGGAGCAGGAACGATGG-3 ' ；
[0036] 5.無(wú)須鱈魚DNA的提取
[0037] 采用DNA提取試劑盒(購(gòu)于寶生物公司）提取無(wú)須鱈魚(購(gòu)自于大連國(guó)富水產(chǎn)食品 有限公司）模板DNA，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取無(wú)須鱈魚模板DNA的濃度為100ng。
[0038] 6.無(wú)須鱈魚Col基因的克隆及測(cè)序驗(yàn)證
[0039] 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：以合成的特異性引物PCR擴(kuò)增無(wú)須鱈魚的Col基因后，以2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（如圖3所示），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后會(huì)分別產(chǎn)生 166bp的特異性電泳條帶，電泳效果最好，PCR擴(kuò)增效率最高。
[0040] 片段的切膠回收:采用寶生物公司的DNA片段回收試劑盒將目的條帶回收及純化， 操作過(guò)程按試劑盒附帶的說(shuō)明書進(jìn)行。
[0041]回收片段的連接、克隆及測(cè)序：回收片段與克隆載體PMD-19T連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液 PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌株送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，確定所克隆的目的片段的序列 信息。
[0042] 序列驗(yàn)證:測(cè)序結(jié)果采用NCBI的Blast N程序通過(guò)序列比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯 示，
[0043] 所克隆的片段為無(wú)須鱈魚的Col基因片段。
[0044] 實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的應(yīng)用
[0045] 無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的應(yīng)用，即利用所述無(wú)須鱈魚物種實(shí) 時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系擴(kuò)增無(wú)須鱈魚的Col基因，對(duì)無(wú)須鱈魚物種進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR特 異性檢測(cè)，具體步驟如下：
[0046] 表3無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的反應(yīng)體系
[0047]
12
[0048] 無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系的反應(yīng)參數(shù)如下表4:[0049] 串4子頌傾偉物軸stR計(jì)賠后柿給》丨蝕:?的反應(yīng)參數(shù)
2 采用無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)組合物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增無(wú)須鱈 魚的Col基因時(shí)，以SYBRslPremix Ex Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用SYBR?Green I與 雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBR?Green I與DNA結(jié)合后發(fā)出的熒光，通 過(guò)設(shè)計(jì)無(wú)須鱈魚物種特異性引物，從而引發(fā)特異性擴(kuò)增，通過(guò)熒光信號(hào)的收集處理，獲得特 異性擴(kuò)增曲線，如圖4所示，證明了所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的有效性及特異性的結(jié)果。 [0052]實(shí)施例3特異性檢測(cè)
[0053]利用所述無(wú)須鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)體系進(jìn)行無(wú)須鱈魚的物種成分實(shí) 時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)無(wú)須鱈魚等鱈形目樣品，采用DNA提取試劑盒提取各待測(cè)樣品的模板 DNA，用微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)所提取的模板DNA的濃度為50ngAxL，分別按照上述步驟4 中所述反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的30個(gè)循環(huán)以下的特異性擴(kuò)增曲線即為無(wú) 須鱈魚，其他樣品在30個(gè)循環(huán)以后出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或沒(méi)有擴(kuò)增曲線，此方法可以準(zhǔn)確的對(duì)無(wú) 須鱈魚的成分進(jìn)行鑒定，具有很好的特異性，如圖5所示。
[0054]實(shí)施例4靈敏度檢測(cè)
[0055]采用DNA提取試劑盒提取陽(yáng)性樣品的模板DNA，用微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)所提取 的模板 DNA 梯度稀釋，制備成 25Γ^/μL、5Γ^/μL、lng/yL、0 · 2ng/yL、0 .(Mng/yl^O.Olng/yLef 濃度梯度樣品，分別按照上述步驟3中所述反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以 確定本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)靈敏度，結(jié)果如圖6所示，所產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線即為無(wú)須鱈魚，當(dāng) DNA濃度2 0.04ng/yL時(shí)均可以特異擴(kuò)增，即該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)靈敏度為0.04ng/yL。此方法 可以準(zhǔn)確的對(duì)無(wú)須鱈魚的成分進(jìn)行鑒定，具有很好的靈敏度。
[0056]以上內(nèi)容是結(jié)合優(yōu)選技術(shù)方案對(duì)本發(fā)明所做的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定發(fā)明的 具體實(shí)施僅限于這些說(shuō)明。對(duì)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明 的構(gòu)思的前提下，還可以做出簡(jiǎn)單的推演及替換，都應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0057]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無(wú)須轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測(cè)引物，其特征在于：引物序列如SEQ ID NO. 1和沈Q ID NO.2所示。2. -種無(wú)須轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測(cè)體系，其特征在于:包括如權(quán)利要求1所 述的引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無(wú)須轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測(cè)體系，包括下述試 劑： 2X 濃巧的 SYBRK Premix Ex Taq 12 5 μ L 濃度為10 μ mol/L的上游引物SEQ ID Ναι 0.25 μ L 濃度為10 μ mol/L的下游引物SEQ阻Ν0.2 0.25 yL。 濃度^Ong的待檢樣品的DNA模板 1 μ L 雙蒸氷 11 w:L4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無(wú)須轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測(cè)體系，其特征在 于:所述檢測(cè)體系的反應(yīng)參數(shù)為:變性，95°C，30s;擴(kuò)增，95°(：，53;60°(：，3〇3,40個(gè)循環(huán)。5. 利用權(quán)利要求2所述檢測(cè)體系對(duì)無(wú)須轄魚物種進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105838787SQ201610204780
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月31日
【發(fā)明人】劉淑艷, 孫曉飛, 宋大賀, 萬(wàn)超
【申請(qǐng)人】劉淑艷, 孫曉飛, 宋大賀, 萬(wàn)超