改進的等位基因特異性擴增的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是W下申請的分案申請：申請日：2009年10月17日；【申請?zhí)枴?200980141303. 2 ;發(fā)明名稱：同上。
技術領域
[0002] 本申請設及改進的等位基因特異性擴增。
【背景技術】
[0003] 核酸的等位基因特異性擴增允許祀序列的同步擴增和分析。當懷疑祀核酸在其序 列中具有一個或多個具有變異(多態(tài)性)的亞群時通常使用等位基因特異性擴增。dm多態(tài) 性用于DNA序型（profile)分析(法醫(yī)取證、親子鑒定、用于器官移植的組織分型)，遺傳作 圖，W及稀有突變的檢測，例如在具有正常DNA的細胞背景下在癌細胞中發(fā)生的那些稀有 突變。
[0004] 在成功的等位基因特異性擴增中，期望的祀核酸變體得到擴增，而其他變體不擴 增，至少不擴增至可檢測的水平。通常的等位基因特異性擴增測定包括聚合酶鏈式反應 (PCR)，其中至少一種引物與具有可疑多態(tài)性的區(qū)域互補。等位基因特異性引物的設計成如 此W使僅在存在多態(tài)性的特定變體時才發(fā)生引物延伸。最簡單形式的等位基因特異性引物 具有與祀中的多態(tài)核巧酸期望變體互補的3' -端核巧酸。通常在引物3' -端的單個錯配 就足夠阻止祀序列的非期望變體的擴增。然而，擴增的特異性在不同的3' -端序列中變化 很大：一些錯配有效地阻止聚合酶的延伸，而其他不能，見美國專利號5, 639, 611。
[000引等位基因鑒別的成功取決于DNA聚合酶延伸錯配引物的無能性（in油ility)。DNA聚合酶的此無能性可通過調(diào)整反應條件來調(diào)節(jié)W獲得最大選擇性。然而，對許多多態(tài)序列， 等位基因特異性PCR的低選擇性仍然是個問題。
[0006] 增加特異性的一種方法包括設計具有內(nèi)部錯配核巧酸或多個核巧酸的擴增引物。 此方法在一些系統(tǒng)中被證明是成功的，見美國專利號5, 137, 806。
[0007] 增加特異性的另一種方法包括引物的化學修飾。例如，發(fā)現(xiàn)引物中一些核巧酸 的脫氧核糖的特定2'-C和4'-C修飾提高了聚合酶的等位基因鑒別，見Gaster,J.和 Marx,A.，Chem.化r.J. 2005，11:1861-1870。在另一個研究中，發(fā)現(xiàn)通過在引物的 一個核巧酸中使用非天然喀晚堿基，特別是在喀晚環(huán)的6-位具有不同取代的假異胞喀晚 (pseudoiso巧tidine)，提高了等位基因的鑒別，見美國專利號7, 408, 051。
[0008] 在實時等位基因特異性PCR的情況下，可通過匹配和錯配模板間闊值循環(huán)數(shù)（Ct) 的差異來測量測定的選擇性。更大的差異指示錯配模板擴增的更大延遲，從而更好的鑒別 等位基因。修飾的脫氧核糖已顯示導致1至14個循環(huán)之間的Ct差異。假異胞喀晚的使用 導致錯配模板擴增的7個循環(huán)的延遲。此程度的鑒別對許多應用是不足的，在運些應用中 樣品包含幾種均競爭擴增的模板變體。錯配模板通常W比匹配模板多許多的量存在。例如， 在組織樣品中，僅小部分的細胞可能是惡性的并攜帶等位基因特異性擴增測定祀向的突變 ("匹配模板")。正常細胞中存在的模板可能被較低效的擴增，但是正常細胞的壓倒性數(shù)量 將克服在擴增中的任何延遲并清除突變模板的任何優(yōu)勢。為了檢測在野生型模板存在下的 稀有突變，需要改進等位基因特異性擴增測定的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在第一個方面，本發(fā)明設及等位基因特異性擴增的改進方法，其中在等位基因特 異性引物或多個引物中的一個或多個核巧酸通過修飾基團和核堿基環(huán)外氨基的共價連接 來修飾。修飾可發(fā)生在引物內(nèi)部或3' -末端，或二者均有。
[0010] 在第二個方面，本發(fā)明設及W幾種變體序列形式存在的祀序列變體的等位基因特 異性擴增的方法，所述方法包括： (a) 提供樣品，其可能含有祀序列的至少一種變體； (b) 提供第一種寡核巧酸，其與祀序列的一種或多種變體至少部分互補； (C)提供第二種寡核巧酸，其與祀序列的一種或多種變體至少部分互補，并具有至少一 個與祀序列的僅一種變體互補的3' -端核巧酸；其中所述第二種寡核巧酸參入至少一個具 有在環(huán)外氨基被共價修飾的堿基的核巧酸； (d) 提供適于所述第一種和第二種寡核巧酸與祀序列的至少一種變體雜交的條件；和 (e) 提供適于第二種寡核巧酸通過核巧酸參入生物催化劑延伸的條件；其中當所述第 二種寡核巧酸和與其具有的所述3' -端核巧酸互補的祀序列變體雜交時，所述生物催化劑 能夠延伸所述第二種寡核巧酸，當所述第二種寡核巧酸和與其具有的3' -端核巧酸不互補 的祀序列變體雜交時，所述延伸大大降低。
[0011] 在第=個方面，本發(fā)明設及檢測樣品中W幾種變體序列形式存在的祀序列變體的 方法，所述方法包括： (a) 將第一種和第二種寡核巧酸與祀序列的至少一種變體雜交；其中第一種寡核巧酸 與祀序列的一種或多種變體至少部分互補，第二種寡核巧酸與祀序列的一種或多種變體至 少部分互補并具有與祀序列的僅一種變體互補的3' -端核巧酸，所述第二種寡核巧酸參入 至少一個具有在環(huán)外氨基被共價修飾的堿基的核巧酸； (b) 使用核巧酸參入生物催化劑延伸第二種寡核巧酸；其中所述生物催化劑能夠可檢 測地延伸僅與祀序列變體雜交的寡核巧酸，所述寡核巧酸具有與所述祀序列變體所述互補 的3' -端核巧酸訊 (C)檢測所述第二種寡核巧酸延伸的產(chǎn)物，其中延伸表示下述祀序列變體的存在，即所 述寡核巧酸具有與之互補的3' -端核巧酸。
[0012] 在第四個方面，本發(fā)明設及用于W幾種變體序列形式存在的祀序列的等位基因特 異性擴增的試劑盒，其包含 (a) 第一種寡核巧酸，其至少與祀序列的一種或多種變體部分互補；和 (b) 第二種寡核巧酸，其至少與祀序列的一種或多種變體部分互補并具有與祀序列的 僅一種變體互補的3' -端核巧酸；其中所述第二種寡核巧酸參入至少一個具有在環(huán)外氨基 被共價修飾的堿基的核巧酸。
[0013] 在第五個方面，本發(fā)明設及用于進行W幾種變體序列形式存在的祀序列的等位基 因特異性擴增的寡核巧酸，其包含： -與所述祀序列的一種或多種變體的一部分至少部分互補的序列； -與所述祀序列的僅一種變體互補的3' -端核巧酸和 -至少一個具有在環(huán)外氨基被共價修飾的堿基的核巧酸。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明的等位基因特異性擴增測定的示意圖。
[0015] 圖2顯示了使用具有內(nèi)部堿基修飾的引物的等位基因特異性擴增結果。
[0016]圖3顯示了使用具有一個或多個內(nèi)部和3'-端堿基修飾的引物的等位基因特異性 擴增結果。
[0017] 圖4顯示了使用具有堿基修飾的引物和不同DNA聚合酶的等位基因特異性擴增結 果。
[0018]圖5顯示了在過量錯配模板存在下使用堿基修飾引物的等位基因特異性擴增結 果。
[0019] 圖6顯示了在本發(fā)明含義內(nèi)的蝸型或類蝸型探針-引物形式的實例。
[0020] 圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明可使用的蝸型ARMS形式結構的圖示。
【具體實施方式】
[0021] 定義 除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語與此發(fā)明所屬領域普通技術人員通常 理解的具有相同的含義。在描述和要求保護本發(fā)明中將使用W下定義。
[0022] 術語"核酸"指核巧酸(例如核糖核巧酸、脫氧核糖核巧酸、核巧酸類似物等等）的 聚合物，包含脫氧核糖核酸（DNA)、核糖核酸（RNA)、DNA-RNA雜交物、寡核巧酸、多核巧酸、 適配體、膚核酸（PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等等，上述分子包含W線性或分支 方式共價連接在一起的核巧酸。核酸通常是單鏈或雙鏈的，通常包含憐酸二醋鍵，雖然在一 些情況下包括可具有交替骨架的核酸類似物，所述交替骨架包括例如憐酷胺度eaucage等 人（1993)Tetr址e化on49 (10): 1925);硫代憐酸醋（Mag等人（1991)NucleicAcids Res. 19:1437;和美國專利號5, 644, 048)，二硫代憐酸醋度riu等人（1989)J.Am. Qiem.Soc. 111:2321), 〇-甲基亞憐酷胺連接（見Eckstein,Oligonucleotidesand Analogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(1992)),及膚核酸骨 架和連接（見，E曲olm(1992)J.Am.Chem.Soc. 114:1895)。其他類似物核酸包括具 有正電荷骨架值e噸cy等人（1995)Proc.化tl.Acad.Sci.USA92: 6097);非離子骨 架（美國專利號 5, 386, 023，5, 637, 684，5, 602, 240，5, 216, 141 和 4, 469, 863)和非核糖 骨架(包括在美國專利號5, 235, 033和5, 034, 506中描述的）的類似物核酸。在核酸定義 中也包括含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸（見Jenkins等人（1995)化em.Soc.Rev.PP. 169-176)，在例如Rawls,C&ENews化n. 2，1997第35頁中也描述了類似物。可進行 核糖-憐酸骨架的運些修飾W便于加入另外的部分例如標記物，或改變運些分子在生理環(huán) 境下的穩(wěn)定性和半衰期。
[002引除了在核酸中通?？梢姷奶烊淮嬖陔s環(huán)堿基(例如腺嚷嶺、鳥嚷嶺、胸腺喀晚、胞 喀晚和尿喀晚）外，核巧酸類似物還可包括非天然存在的雜環(huán)堿基，例如在例如Seela等 人（1999)Helv.化im.Acta82:1640中描述的那些。在核巧酸類似物中使用特定堿基 作為解鏈溫度（Tm)修飾劑。例如，運些堿基中的一些包括7-脫氮嚷嶺(例如，7-脫氮鳥嚷 嶺，7-脫氮腺嚷嶺，等等)，化挫并巧，4-d]喀晚，丙烘基-dN(例如，丙烘基-加，丙烘基-dC 等等)等等。見例如美國專利號5, 990, 303,在此引入作為參考。其他代表性雜環(huán)堿基包括 例如次黃嚷嶺、次黃巧、黃嚷嶺；2-氨基嚷嶺、2, 6-二氨基嚷嶺、2-氨基-6-氯嚷嶺、次黃嚷 嶺、次黃巧、黃嚷嶺的8-氮雜衍生物；腺嚷嶺、鳥嚷嶺、2-氨基嚷嶺、2, 6-二氨基嚷嶺、2-氨 基-6-氯嚷嶺、次黃嚷嶺、次黃巧、黃嚷嶺的7-脫氮-8-氮雜衍生物；6-氮雜胞喀晚；5-氣 胞喀晚；5-氯胞喀晚；5-艦胞喀晚；5-漠胞喀晚；5-甲基胞喀晚；5-丙烘基胞喀晚；5-漠 乙締基尿喀晚；5-氣尿喀晚；5-氯尿喀晚；5-艦尿喀晚；5-漠尿喀晚；5-=氣甲基尿喀晚； 5-甲氧基甲基尿喀晚；5-乙烘基尿喀晚；5-丙烘基尿喀晚等等。
[0024]"核巧"指核酸的成分，所述成分包含與糖部分(核糖或脫氧核糖)、糖部分的衍生 物或糖部分的功能等價物(例如碳環(huán)）共價連接的堿基或堿基基團(包含至少一個同素環(huán)、 至少一個雜環(huán)、至少一個芳基和/或類似物)。例如，當核巧包括糖部分時，堿基通常與該糖 部分的r位連接。如上所述，堿基可為天然存在的堿基或非天然存在的堿基。示例性核巧 包括核糖核巧、脫氧核糖核巧、雙脫氧核糖核巧和碳環(huán)核巧。
[002引"核巧酸"指核