此外，本發(fā)明的寡核巧酸包括一個(gè)或多個(gè)具有在環(huán)外氨基被共價(jià)修飾的 堿基的核巧酸。在一些實(shí)施方案中，堿基修飾的核巧酸出現(xiàn)在3' -端核巧酸上游1至30， 例如1至10,優(yōu)選1至5,更優(yōu)選，例如1、2或3個(gè)核巧酸中。在其他實(shí)施方案中，具有修 飾堿基的核巧酸為3' -端核巧酸。在一些實(shí)施方案中，具有修飾堿基的核巧酸同時(shí)出現(xiàn)在 3' -端和寡核巧酸中的其他位置。
[0071] 不受具體理論束縛，發(fā)明者假設(shè)本發(fā)明的共價(jià)堿基修飾，尤其是大體積基團(tuán)，使引 物和模板核酸間在Watson-化ick堿基配對(duì)情況下的氨鍵不穩(wěn)定但不完全破壞氨鍵。當(dāng)所 述修飾與在引物中相同或附近位置的非互補(bǔ)堿基（當(dāng)在非期望或"錯(cuò)配"的祀序列變體上 時(shí)）聯(lián)合時(shí)，聯(lián)合的氨鍵弱化作用使引物-祀核酸復(fù)合物不穩(wěn)定，導(dǎo)致核巧酸參入生物催化 劑對(duì)寡核巧酸的延伸部分或完全被抑制。然而，當(dāng)堿基的修飾單獨(dú)存在而沒有非互補(bǔ)堿基 時(shí)（當(dāng)在待擴(kuò)增的期望或"匹配"的祀序列變體上時(shí))，引物可被有效地延伸。圖1為圖表， 說明了多態(tài)性和引物修飾的位置，和它們?cè)试S匹配祀擴(kuò)增但抑制錯(cuò)配祀擴(kuò)增的作用。
[0072]提供W下實(shí)施例和圖W幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在隨附的權(quán)利要求書 中闡述。應(yīng)當(dāng)理解可W對(duì)闡述的方法進(jìn)行修改而不背離本發(fā)明的精神。 實(shí)施例
[0073] 下面的實(shí)施例使用"匹配"和"錯(cuò)配"祀。如在實(shí)施例中使用的，將匹配祀設(shè)計(jì)為 與等位基因特異性擴(kuò)增引物互補(bǔ)。將錯(cuò)配祀設(shè)計(jì)為與等位基因特異性擴(kuò)增引物的3'-端核 巧酸具有錯(cuò)配。
[0074] 作為匹配祀，實(shí)施例使用人BRAF基因的V600E突變。此突變是由BRAF基因在第 1799位核巧酸的胸腺喀晚（T)至腺嚷嶺（A)的轉(zhuǎn)換引起的第600位氨基酸的鄉(xiāng)氨酸至谷氨 酸的改變。所述突變?cè)谠S多癌癥中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為在癌癥發(fā)展中起作用，因?yàn)槠湟餗ARK途 徑的組成型活化。在腫瘤細(xì)胞群中檢測(cè)此單核巧酸改變?cè)谌税┌Y的診斷和治療中具有實(shí)用 性。
[0075] 突變祀是"匹配的"，即與各條等位基因特異性引物(表1)的3'-端核巧酸形成A-T Watson-化ick配對(duì)。錯(cuò)配祀為野生型BRAF序列。錯(cuò)配祀與等位基因特異性引物的3'-端 核巧酸形成A-A錯(cuò)配。
[0076]表1 引物和探針
X-N6-芐基-dA Y-N6-對(duì)-叔下基-芐基-dA F-cx-FAM供體巧光團(tuán) Q-B冊(cè)-2"黑桐"巧滅劑 P- 3'-憐酸 3' -端核巧酸對(duì)應(yīng)于祀中的可變位置。
[0077] 實(shí)施例1 使用具有內(nèi)部堿基修飾的引物的等位基因特異性擴(kuò)增。
[007引在此實(shí)施例中，模板序列的2種變體(與引物序列互補(bǔ)的匹配變體和錯(cuò)配變體）W等量存在。匹配變體為具有參入BRAFV600E突變序列（SEQIDNO: 1)的插入物的質(zhì)粒 DNA，而錯(cuò)配變體為具有BRAF野生型序列（SEQIDNO: 2)的相同質(zhì)粒。
[0079] 沈DIDNO: 1度RAFV600E突變序列片段）： 5 ^-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGG TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTA-3^ SEQIDNO: 2度RAF野生型序列片段）： 5 ^-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGG TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTA-3^ 表1顯示了正向引物（SEQIDNO: 3，4，5)和反向引物（SEQIDNO: 6)。引物在指 示處包含內(nèi)部N6-芐基-dA或內(nèi)部N6-對(duì)-叔下基-芐基-dA。
[0080] 各100化反應(yīng)包含1〇6個(gè)拷貝的2種祀之一，5%甘油，50mMSH甲基甲基甘氨 酸（pH8. 3)，25mM醋酸鐘（pH7. 5)，各為 200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0.1剛一種正向引物（SEQIDNO: 3，4或5)，0.7剛反向引物（SEQIDNO: 6)，2剛 Syto-13插入染料，1%DMS0, 4個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶扣NG)，10個(gè)單位AZ05聚合 酶和4mM醋酸儀。
[0081] 擴(kuò)增和分析使用RocheLi曲t切cler480儀器完成。反應(yīng)使用W下溫度概況： 50°C5分鐘（UNG步驟)，95°C10分鐘，之后80個(gè)循環(huán)的95°C15秒和59°C40秒。在各 個(gè)59°C步驟結(jié)束時(shí)收集巧光數(shù)據(jù)。
[0082]結(jié)果顯示于圖2。擴(kuò)增結(jié)果W450-500皿波長(zhǎng)區(qū)間的巧光變化表示。擴(kuò)增的選擇 性通過匹配和錯(cuò)配祀之間的Ct值差異（Act)測(cè)量。圖2顯示了各試驗(yàn)的Act。數(shù)據(jù)顯示 祀的匹配(突變）變體相對(duì)錯(cuò)配(野生型）變體得到選擇性擴(kuò)增。通過引物中核巧酸的堿基 修飾提高了選擇性。
[008引 實(shí)施例2 使用具有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部和3' -端堿基修飾的引物的等位基因特異性擴(kuò)增。
[0084] 在此試驗(yàn)中，使用與實(shí)施例1相同的匹配(突變）和錯(cuò)配(野生型）祀。引物在內(nèi)部 位置、3' -端位置或同時(shí)含有堿基修飾。
[00財(cái)各100化反應(yīng)包含106個(gè)拷貝的2種祀之一，5%甘油，甲基甲基甘氨 酸（pH8. 3)，90mM醋酸鐘（pH7. 5)，各為 200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0.5剛一種正向引物（SEQIDNO: 3，5，7或8)，0.5剛反向引物（SEQIDNO: 6)，0.2剛 巧光探針（SEQIDN0: 9)，1%DMS0, 4個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶扣NG)，10個(gè)單位Z05 聚合酶和5mM醋酸儀。
[0086] 擴(kuò)增和分析使用RocheLi曲t切cler480儀器完成。反應(yīng)使用W下溫度概況： 50°C5分鐘（UNG步驟)，95°C10分鐘，之后60個(gè)循環(huán)的95°C15秒和59°C40秒。在各 個(gè)59°C步驟結(jié)束時(shí)收集巧光數(shù)據(jù)。
[0087] 除了在483-553皿波長(zhǎng)區(qū)間測(cè)量巧光W外，結(jié)果W和實(shí)施例1的結(jié)果相同的形式 顯示于圖3。數(shù)據(jù)表明引物的堿基修飾改進(jìn)了擴(kuò)增測(cè)定的選擇性，一些修飾的堿基可對(duì)選擇 性具有累積效應(yīng)。
[008引實(shí)施例3 使用具有單堿基修飾的引物和多種dm聚合酶的等位基因特異性擴(kuò)增。
[0089] 在此實(shí)施例中，使用與實(shí)施例1相同的匹配（突變）和錯(cuò)配(野生型）祀，使用具有 單個(gè)內(nèi)部堿基修飾的引物擴(kuò)增。擴(kuò)增在Z05，AZ05，或AZ05-Gold聚合酶存在下進(jìn)行。
[0090] Z05反應(yīng)在100化中包含106個(gè)拷貝的模板，5%甘油，50mMS徑甲基甲基甘氨 酸（pH8.3)，90mM醋酸鐘（pH7.5)，各為200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0. 5剛正向引物（SEQID NO: 5)，0. 5剛反向引物（SEQID NO: 6)，2剛8八〇-13插入染 料，1% DMS0, 4個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶扣NG)，10個(gè)單位Z05聚合酶和5mM醋酸儀。 [00川 AZ05反應(yīng)在100化中包含106個(gè)拷貝的模板，5%甘油，50mMS徑甲基甲基甘氨 酸（pH8.3)，25mM醋酸鐘（pH7.5)，各為200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0. 1剛正向引物（SEQID NO: 5)，0. 7剛反向引物（SEQID NO: 6)，2剛8八0-13插入染 料，1% DMS0, 4個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶扣NG)，10個(gè)單位A Z05聚合酶和4mM醋酸 儀。
[009引AZ05-Gold反應(yīng)在100化中包含106個(gè)拷貝的模板，8%甘油，50mM^徑甲基甲基甘 氨酸（pH8.3)，45mM醋酸鐘（pH7. 5)，各為 200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0.1剛正向引物（SEQIDNO: 5)，0. 7剛反向引物（SEQIDNO:6)，2剛8八0-13插入染 料，1%DMS0, 2個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶（UNG)，60個(gè)單位AZ05-Gold聚合酶和3mM 醋酸儀。
[0093] 結(jié)果W和實(shí)施例2的結(jié)果相同的形式顯示于圖4。數(shù)據(jù)表明各個(gè)酶使用堿基修飾 的引物進(jìn)行等位基因選擇性擴(kuò)增的相對(duì)能力。
[0094] 實(shí)施例4 使用堿基修飾的引物在過量錯(cuò)配模板存在下的等位基因特異性擴(kuò)增。
[0095] 在此實(shí)施例中，使用與實(shí)施例1相同的匹配(突變）和錯(cuò)配(野生型）祀。使用具有 單個(gè)內(nèi)部烷基修飾的引物擴(kuò)增祀。為模擬臨床樣品，反應(yīng)單獨(dú)或在大大過量野生型(錯(cuò)配） 祀存在下包含極低拷貝數(shù)的突變（匹配）祀。在一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中，存在大量錯(cuò)配祀而沒有 任何錯(cuò)配祀。
[009引 100化反應(yīng)中包含指示量的祀DNA，8%甘油，50mMS徑甲基甲基甘氨酸（pH8. 3)， 45mM醋酸鐘（pH7. 5)，各為200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0. 1剛正向引物(SEQIDNO: 5)，0. 7剛反向引物（SEQIDNO: 6)，0. 2剛巧光探針（SEQIDNO: 9)，10/0 DMS0, 2個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶扣NG)，60個(gè)單位AZ05-Gold聚合酶和3mM醋酸儀。 [0097] 結(jié)果W和實(shí)施例2的結(jié)果相同的形式顯示于圖5。數(shù)據(jù)表明在示例性條件下，擴(kuò)增 特異性針對(duì)匹配祀，與錯(cuò)配祀的存在或相對(duì)量無關(guān)。
[009引 實(shí)施例5 使用具有內(nèi)部堿基修飾的類蝸型ARMS引物的等位基因特異性擴(kuò)增。
[0099] 表 3
X-N6-芐基-dA Y-N6-對(duì)-叔下基-芐基-dA F-CX-FAM供體巧光團(tuán) Q-B冊(cè)-2"黑桐"巧滅劑 J-肥G P- 3'-憐酸 *等位基因選擇性核巧酸為下劃線的(距離3' -端N或N-1位)。
[0100] 在此實(shí)施例中，模板序列的2種變體巧引物序列互補(bǔ)的匹配變體和錯(cuò)配變體）W 等量存在。匹配變體為具有代表BRAFV600E突變序列（SEQIDNO: 1)的插入物的質(zhì)粒 DNA，而錯(cuò)配變體為具有BRAF野生型序列（SEQIDNO: 2)的相同質(zhì)粒。表3描述了正向引 物（SEQIDNO: 3，5，12和13)和反向引物（SEQIDNO: 14)。將正向、ASPCR引物設(shè)計(jì) 為在3'-端位置具有SNP，具有或不具有N6-對(duì)-叔下基-芐基-dA修飾。ASPCR引物與下 游檢測(cè)探針配對(duì)或與W封閉的類蝸型形式互補(bǔ)的探針連接。
[010。 各50uL反應(yīng)包含105個(gè)拷貝的2種祀之一，5%甘油，50mMS徑甲基甲基甘氨酸（pH 8. 3)，150mM醋酸鐘（pH7. 5)，各為 200剛的dATP、dCTP和dGTP, 400剛加TP, 0. 4剛 正向引物，0. 4剛反向引物，1%DMS0, 2個(gè)單位尿喀晚-N-糖基化酶扣NG)，10個(gè)單位 Z05聚合酶和3mM醋酸儀。在含有引物3和5的反應(yīng)中加入0. 2uM檢測(cè)探針，其中互補(bǔ)探針 不與正向引物連接。
[0102] 擴(kuò)增和分析使用RocheLi曲t切cler480儀器完成。反應(yīng)