一種乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙型流感病毒反轉(zhuǎn)錄-重組酶多聚酶擴(kuò) 增檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型流感病毒屬于正粘病毒科，基因組由8個(gè)負(fù)鏈單股RNA節(jié)段組成，主要感染人 和海豹。根據(jù)病毒表面蛋白血凝素抗原性差異，乙型流感病毒分為Victoria系和Yamagata 系。乙型流感病毒在人群中引起暴發(fā)和流行，是人類季節(jié)性流感病毒主要成員，可以感染所 有人群，對(duì)一些特殊人群（如孕婦、老年人和基礎(chǔ)性疾病患者）能引起嚴(yán)重疾病乃至死亡。 乙型流感病毒的檢測(cè)方法主要包括血清學(xué)和核酸檢測(cè)，血清學(xué)方法主要用標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)分離 到的病毒株進(jìn)行抗原分型，耗時(shí)費(fèi)力，不適合臨床快速分型診斷。目前核酸檢測(cè)方法主要包 括普通PCR法和Real-time time PCR法等。Real-time time PCR法具有很好的特異性和 敏感性，但依賴昂貴的儀器和試劑；相比之下，普通PCR敏感性較差且需要瓊脂糖電泳進(jìn)行 結(jié)果判定，不適合大規(guī)模標(biāo)本的檢測(cè)。因此，需要建立快速、敏感、便于推廣的乙型流感核酸 檢測(cè)方法，以提高流感監(jiān)測(cè)和臨床診斷水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是提供一種乙型流感病毒反轉(zhuǎn)錄-重組酶多聚酶擴(kuò)增 (RT-RPA)檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明提供的乙型流感病毒RT-RPA檢測(cè)試劑盒由RT-RPA反應(yīng)體系、NS片段陽(yáng)性 質(zhì)粒Puc-NS、陰性質(zhì)控品、NS片段RPA引物和exo探針組成。
[0005] NS片段RPA引物和exo探針為：
[0006]NS-F，5'-AAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGG-3' ；
[0007]NS-R,5'-CCATGTCAGCTATTATGGAGCTGTTAACTA-3'；
[0008] NS-exo-probe, 5'-CCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAA[dT-FAM]ΤΑ[THF]AC[dT-BHQ] GGTCACGGAAGAAC[3'-block]-3'
[0009] 本發(fā)明所述乙型流感病毒RT-RPA檢測(cè)試劑盒的制備方法：
[0010] (1)病毒核酸提?。翰捎梅勇确路ㄌ崛〔《綬NA，具體步驟：取臨床鼻咽拭子標(biāo)本 或病毒培養(yǎng)物核酸100μL，加入含有200ul水飽和酚的1. 5mlEP中，劇烈震蕩混勻，靜置 3min，加入200ul氯仿，充分震蕩混勻，12000g室溫離心15分鐘；吸取上清液，加入兩倍上 清體積的異丙醇，再加入1/10上清體積3M醋酸鈉35-45ul，充分混勻后-20°C靜置2h;取 出于4°C下，12000g，離心20min;棄上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，離心20min;棄上 清，室溫干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置備用；
[0011] (2)訂-1?^反應(yīng)：采用英國(guó)了￥18七〇1公司的了￥18七六1^訂61〇8試劑盒，取29.5 41^ 反應(yīng)緩沖液，分別加入下列組分：引物L(fēng)-RPAF(lOmM)和L-RPAR(lOmM)各2. 1yL，2. 6yL RPAexo探針（10mM)，1μLRNA酶抑制劑（5U)，7. 2μL超純水，5μL標(biāo)本RNA模板，渦旋震 蕩，短暫離心，再加入2. 5yL醋酸鎂（280mM)，混合離心后，放入Twista實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀中， 反應(yīng)溫度為40°C，時(shí)間為20min。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0013] 設(shè)計(jì)針對(duì)L片段RPA引物和exo探針，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-重組酶多聚酶擴(kuò)增方法，反應(yīng) 溫度為40°C等溫條件下，20min即可對(duì)臨床上發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒標(biāo)本和病毒分 離物進(jìn)行核酸分子鑒定，無(wú)需昂貴儀器設(shè)備，便于操作，具有快速、敏感、特異等特點(diǎn)，為發(fā) 熱伴血小板減少綜合征病毒監(jiān)測(cè)和臨床救治提供一種新的檢測(cè)方法。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1檢測(cè)乙型流感病毒NS節(jié)段RPA引物瓊脂糖凝膠電泳篩選
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于 實(shí)施例。
[0016] 實(shí)施例1 :靶基因質(zhì)粒構(gòu)建
[0017] 設(shè)計(jì)針對(duì)乙型流感病毒NS片段的特異性引物，通過(guò)PCR法擴(kuò)增獲得806基因片 段，回收純化后的與T載體連接，獲得靶基因陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為Puc-NS。
[0018] 實(shí)施例2 :引物探針設(shè)計(jì)與篩選
[0019] 通過(guò)序列分析軟件分析，以乙型流感病毒較為NS片段保守區(qū)域?yàn)槟０澹苍O(shè)計(jì) 9條正向引物和10條反向引物，引物長(zhǎng)度為30-33bp;同時(shí)設(shè)計(jì)1條exo探針（命名為 NS-exo-probe)，長(zhǎng)度為48bp，其中28位堿基T標(biāo)記熒光物質(zhì)FAM，31位堿基由四氫呋喃代 替，34位堿基標(biāo)記熒光物質(zhì)BHQ，同時(shí)封閉3'末端堿基。
[0020] 采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司，英國(guó)），以革巴基因克隆質(zhì)粒Puc-NS為模 板，以瓊脂糖凝膠電泳為結(jié)果指示手段，對(duì)上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行篩選。引物優(yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo) 包括特異性、敏感性、擴(kuò)增效率和引物噪音等。取29. 5μL反應(yīng)緩沖液，分別加入下列組分： 上下游引物（10mM)各2. 4yL，12. 2yL超純水，lyL質(zhì)粒Puc-L模板。再加入2. 5yL醋 酸鎂（280mM)?；旌想x心后，放入40°C，溫育5min。渦旋震蕩8-10次，短暫離心，放入放入 40°C，反應(yīng)20min。取反應(yīng)產(chǎn)物2ul放入18ul水中，用酚-氯仿法對(duì)DNA進(jìn)行純化。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化DNA產(chǎn)物，結(jié)果篩選到一組引物，命名為NS-F和NS-R(圖1)。
[0021] 實(shí)施例3 :RT-RPA的敏感性
[0022] 將靶基因克隆質(zhì)粒Puc-NS稀釋100倍，再按10倍梯度稀釋成10 2_10 9共八個(gè)濃 度，以此為模板，進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)：采用TwistAmpRTexos試劑盒（TwistDx公司，英國(guó)）。 取29. 5μL反應(yīng)緩沖液，分別加入下列組分：引物NS-F(lOmM)和NS-R(lOmM)各2. 1μL， 2. 6μLRPAexo探針（10mM)，1μLRNA酶抑制劑（5U)，7. 2μL超純水，5μL標(biāo)本RNA模板。 渦旋震蕩，短暫離心。再加入2.5yL醋酸鎂（280mM)?；旌想x心后，放入Twista實(shí)時(shí)熒光 檢測(cè)儀中，反應(yīng)溫度為40°C，時(shí)間為20min。
[0023] 本實(shí)驗(yàn)中所建立的RT-RPA方法可以檢測(cè)下限是lOOcopies/μL，具有較好的敏感 性。
[0024] 實(shí)施例4 :RT-RPA的特異性
[0025] 以甲型流感病毒、登革熱病毒、呼吸道冠狀病毒、鼻病毒和呼吸道合胞體病毒核酸 為模板，用設(shè)計(jì)的RPA引物和exo探針進(jìn)行RT-RPA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果對(duì)上述毒核酸都沒(méi)有熒光信 號(hào)檢出，表明建立的RT-RPA方法具有較好的特異性。。
[0026] 實(shí)施例5 :臨床標(biāo)本檢測(cè)
[0027] 收集65份發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染臨床樣本，所有標(biāo)本都通過(guò)細(xì)胞培 養(yǎng)進(jìn)行病毒分尚。
[0028] (1)病毒RNA提取
[0029] 采用酚氯仿法提取病毒RNA，具體步驟：1.取鼻咽拭子標(biāo)本100yL，加入含有 200ul水飽和酚的1. 5mlEP中，劇烈震蕩混勻，靜置3min，加入200ul氯仿，充分震蕩混勻， 12000g室溫離心15分鐘。2.吸取上清液，加入兩倍上清體積的異丙醇，再加入1/10上清體 積3M醋酸鈉約40ul，充分混勻后-20°C靜置2h;取出于4°C下，12000g，離心20min。3.棄 上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，離心20min。4·棄上清，室溫干燥，加入40ulDEPC 水溶解RNA。
[0030] (2)RT_RPA反應(yīng)：采用公司的TwistAmpRTexos試劑盒（TwistDx公司，英國(guó)）。 取29. 5μL反應(yīng)緩沖液，分別加入下列組分：引物NS-F(lOmM)和NS-R(lOmM)各2. 1μL， 2. 6μLRPAexo探針（10mM)，1μLRNA酶抑制劑（5U)，7. 2μL超純水，5μL標(biāo)本RNA模板。 渦旋震蕩，短暫離心。再加入2.5yL醋酸鎂（280mM)?；旌想x心后，放入Twista實(shí)時(shí)熒光 檢測(cè)儀中，反應(yīng)溫度為40°C，時(shí)間為20min。
[0031] 結(jié)果65份臨床樣本，RT-RPA檢測(cè)陽(yáng)性的有43份，陰性22份，結(jié)果與病毒分離結(jié) 果完全一致。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于反轉(zhuǎn)錄-重組酶多聚酶擴(kuò)增的乙型流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征是試劑盒 由RT-RPA反應(yīng)體系、RNA酶抑制劑、Μ片段陽(yáng)性質(zhì)粒Puc-NS、陰性質(zhì)控品、NS片段RPA引物 和exo探針組成，NS片段RPA引物和exo探針為： NS-F, 5'-AAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGG-3'； NS-R,5'-CCATGTCAGCTATTATGGAGCTGTTAACTA-3'； NS-exo-probe,5'-CCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAA[dT-FAM]ΤΑ[THF]AC[dT-BHQ] GGTCACG GAAGAAC[3'-block]-3'〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于反轉(zhuǎn)錄-重組酶多聚酶擴(kuò)增的乙型流感病毒檢測(cè)試劑 盒的制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成： (1) 病毒核酸提?。翰捎梅勇确路ㄌ崛〔《綬NA，具體步驟：取臨床鼻咽拭子標(biāo)本或病 毒培養(yǎng)物核酸100μL，加入含有200ul水飽和酚的1. 5mlEP中，劇烈震蕩混勻，靜置3min， 加入200ul氯仿，充分震蕩混勻，12000g室溫離心15分鐘；吸取上清液，加入兩倍上清體積 的異丙醇，再加入1/10上清體積3M醋酸鈉約40ul，充分混勻后-20°C靜置2h;取出于4°C 下，12000g，離心20min;棄上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，離心20min;棄上清，室溫 干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置備用； (2) RT-RPA反應(yīng)：采用TwistAmpRTexos試劑盒，取29. 5μL反應(yīng)緩沖液，分別加入下 列組分：引物1-1?^卩1〇1111和1^-1?^1?1〇1111各2.141^，2.6 41^1?^61〇探針1〇1111，141^1?熟 酶抑制劑5U，7. 2μL超純水，5μL標(biāo)本RNA模板；渦旋震蕩，短暫離心，再加入2. 5μL醋酸 鎂280mM;混合離心后，放入Twista實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀中，反應(yīng)溫度為40°C，時(shí)間為20min。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙型流感病毒反轉(zhuǎn)錄-重組酶多聚酶擴(kuò)增(RT-RPA)檢測(cè)試劑盒及其制備方法。本發(fā)明涉及的檢測(cè)試劑盒由RT-RPA反應(yīng)體系、RNA酶抑制劑、乙型流感病毒NS片段陽(yáng)性質(zhì)粒Puc-NS、陰性質(zhì)控品、NS片段RPA引物和exo探針組成。用特異性引物和探針，通過(guò)配制RT-RPA反應(yīng)體系，置入Twista實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，建立了一種快速、敏感、特異的乙型流感病毒等溫實(shí)時(shí)熒光核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明涉及特異性RPA引物和exo探針在乙型流感病毒感染臨床鑒別診斷和病毒分離株鑒定中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/70
【公開(kāi)號(hào)】CN105296675
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510875348
【發(fā)明人】祁賢, 宋勇春, 焦永軍, 鮑倡俊, 湯奮揚(yáng), 崔侖標(biāo)
【申請(qǐng)人】江蘇省疾病預(yù)防控制中心
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月3日