磁性分離偶聯(lián)rt-pcr法ev71核酸檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及一種磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道病毒EV71是引起手足口病的主要病原體，以夏秋季節(jié)發(fā)病為主，發(fā)病年齡以嬰幼兒為主，目前的檢測方法以RT-PCR為主，檢測標(biāo)本主要為鼻咽部拭子，應(yīng)用咽拭子的洗脫液直接應(yīng)用于RT-PCR的檢測，由于常規(guī)的核酸提取方法的靈敏度的限制，在臨床檢測中容易造成陽性標(biāo)本的漏檢，從而造成假陰性，特別是在疾病的后期由于病毒載量的下降，更易出現(xiàn)假陰性，不利于疾病的診斷治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本實用新型的目的在于提供一種應(yīng)用磁性免疫分離技術(shù)對樣本中的病毒顆粒進行分離濃集再行PCR檢測，并且在PCR檢測過程中加入內(nèi)參同時擴增，可以大大提高檢測靈敏度和可靠性的磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒。
[0004]本實用新型為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案，其特征在于:盒體I上方連接有盒蓋2，盒體I的底部放置有海綿襯墊3，海綿襯墊3上開有與存放不同試劑瓶直徑相同的盲孔，分別用于存放磁顆粒溶液4、Trizol試劑5、無水乙醇6、異丙醇溶液7、DEPC水8、EV71 RT-PCR反應(yīng)液9、逆轉(zhuǎn)錄酶系10、Taq酶系11、陰性質(zhì)控12、陽性質(zhì)控13試劑瓶。
[0005]本實用新型還可以采用如下技術(shù)方案:
[0006]1.所述的磁顆粒溶液表面也可包被二或三種不同EV71高親和力單克隆抗體。
[0007]2.所述的EV71 RT-PCR反應(yīng)液中也可換用GAPDH作內(nèi)參。
[0008]3.所述的用于存放磁顆粒溶液、Trizol試劑、無水乙醇、異丙醇溶液、DEPC水、EV71 RT-PCR反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶系、Taq酶系、陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控的塑料瓶瓶身均貼有相應(yīng)的標(biāo)示，或瓶蓋采用不同的顏色以示區(qū)別。
[0009]本實用新型具有的優(yōu)點和積極效果是:檢測方法為應(yīng)用磁性免疫分離技術(shù)對樣本中的病毒顆粒進行分離濃集再行實時熒光定量PCR檢測，并且在PCR過程中加入了內(nèi)參，顯著提高了檢測靈敏度及結(jié)果的可靠性，有利于腸道病毒71型感染的早期診斷和治療。
【附圖說明】
[0010]圖1是本實用新型整體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖1中:1.盒體；2.盒蓋；3.海綿襯墊；4.磁顆粒溶液；5.Trizol試劑；6.無水乙醇；7.異丙醇溶液；8.DEPC水；9.EV71 RT-PCR反應(yīng)液；10.逆轉(zhuǎn)錄酶系；11.Taq酶系；
12.陰性質(zhì)控；13.陽性質(zhì)控。
【具體實施方式】
[0012]為能進一步了解本實用新型的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點及效果，茲例舉以下實施例，并配合附圖詳細說明如下，請參閱圖1。
[0013]如圖1所示:盒體I上方連接有盒蓋2，用硬質(zhì)紙質(zhì)或塑料制成的盒體I的底部放置有3cm厚海綿襯墊3，海綿襯墊3上開有與存放不同試劑瓶直徑相同的盲孔，分別用于存放磁顆粒溶液4、Trizol試劑5、無水乙醇6、異丙醇溶液7、DEPC水8、EV71 RT-PCR反應(yīng)液
9、逆轉(zhuǎn)錄酶系10、Taq酶系11、陰性質(zhì)控12、陽性質(zhì)控13各一瓶；使用時，首先用專用采樣棉簽，拭抹患者咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，放入采樣管中并加入3?5mL PBS，震蕩后分離洗脫液，磁顆粒溶液1yL與被檢咽拭子洗脫液1500 μ L混合，置于搖擺振蕩器上富集I小時以防磁顆粒沉淀并促進病毒抗原與抗體的接觸，用磁性分離器分離磁性顆粒，以PBS洗液洗磁顆粒沉淀2次并恢復(fù)為100 μ L磁顆粒懸液，加入1.5mL EP管中，加入200 μ L Trizol及100 μ L氯仿，強力震蕩20秒后靜置3分鐘，然后12000rpm離心2分鐘，取出上層無色液體，轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管中，加入10yL異丙醇溶液混勻，12000rpm離心5分鐘，棄上清，向沉淀加入DEPC水配制的75%乙醇200 μ L，混勻，8000rpm離心5分鐘，棄上清，將沉淀室溫干燥15分鐘，加入30 μ L DEPC水，重懸后為核酸模板；將提取后的核酸模板、陰性對照和陽性對照各5 μ L分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管內(nèi)；EV71 RT-PCR反應(yīng)液15 μ L，逆轉(zhuǎn)錄酶系2 μ L，Taq酶系3 μ L于PCR反應(yīng)管中，8000rpm離心數(shù)秒，放入PCR擴增儀，PCR擴增儀循環(huán)條件設(shè)置:40°C 25分鐘，一個循環(huán)；94°C 3分鐘，一個循環(huán)；93°C 15s — 57°C 45s，40個循；結(jié)果判斷值〈38為陽性，G值多38為陰性。
[0014]其優(yōu)點是:將具有富集病毒功能的磁性免疫分離技術(shù)與RT-PCR技術(shù)結(jié)合在一起來檢測咽拭子洗脫液中的EV71病毒，并且在PCR過程中加入了內(nèi)參，顯著提高了檢測靈敏度及結(jié)果的可靠性，有利于腸道病毒71型感染的早期診斷和治療。
[0015]以上所述的實施例僅是對本實用新型的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本實用新型的范圍進行限定，在不脫離本實用新型設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本實用新型的技術(shù)方案做出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本實用新型權(quán)利要求書確定的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒，其特征在于:盒體(I)上方連接有盒蓋(2)，盒體(I)的底部放置有海綿襯墊(3)，海綿襯墊上開有與存放不同試劑瓶直徑相同的盲孔，分別用于存放磁顆粒溶液(4)、Trizol試劑(5)、無水乙醇(6)、異丙醇溶液(7)、DEPC水(8)、EV71 RT-PCR反應(yīng)液(9)、逆轉(zhuǎn)錄酶系(10)、Taq酶系(11)、陰性質(zhì)控(12)、陽性質(zhì)控(13)各一瓶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒，其特征在于:所述的磁顆粒溶液含有超順磁性納米顆粒，顆粒表面包被抗EV71多克隆抗體，直徑L 5 μ m0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒，其特征在于:所述的EV71 RT-PCR反應(yīng)液(9)包含dNTPs、Mg2+、EV71特異性引物及其熒光探針、β -actin內(nèi)參引物及其熒光探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒，其特征在于:所述的Taq酶系(11)含有Taq DNA聚合酶和UNG酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒，其特征在于:所述的逆轉(zhuǎn)錄酶系(10)含有mMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。
【專利摘要】本實用新型公開了磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒，盒體上方連接有盒蓋，用硬質(zhì)紙質(zhì)或塑料制成的盒體的底部放置海綿襯墊，其上開有與存放不同試劑瓶直徑相同的盲孔，盲孔內(nèi)分別存放裝有磁顆粒溶液、Trizol試劑、無水乙醇、異丙醇、DEPC水、EV71 RT-PCR反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶系、Taq酶系、陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控各一瓶。優(yōu)點是：本實用新型提供的磁性分離偶聯(lián)RT-PCR法EV71核酸檢測試劑盒在核酸提取前增加了病毒的富集過程，并且在PCR過程中加入了內(nèi)參，顯著提高了檢測靈敏度及結(jié)果的可靠性，有利于腸道病毒71型感染的早期診斷和治療。
【IPC分類】C12M1-00, C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN204490862
【申請?zhí)枴緾N201520130734
【發(fā)明人】王學(xué)超, 魏榮華, 王高升, 傅金瑞, 張超, 張晨磊, 李會萍
【申請人】天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年3月9日