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戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物的制備方法

文檔序號(hào):6029307閱讀:338來源:國(guó)知局

專利名稱::戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及一種用于特異IgM(抗-HEV)檢測(cè)的兔-人嵌合抗體質(zhì)控物及其制備方法,屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域
。
背景技術(shù)
:戊型肝炎病毒(h印atitisEvirus,HEV)曾稱為經(jīng)消化道傳播的非甲非乙型肝炎病毒。1955年首次在印度暴發(fā)流行,當(dāng)時(shí)認(rèn)為是甲型肝炎病毒所致。70年初建立了HAV的檢測(cè)方法,重新對(duì)當(dāng)時(shí)肝炎患者的血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果未發(fā)現(xiàn)患者血清中抗-HAVIgM或IgG效價(jià)升高,因此確定為消化道傳播的非甲非乙型肝炎病毒所致。1986年,我國(guó)新疆南部地區(qū)發(fā)生戊型肝炎流行,約12萬人發(fā)病,死亡700余人,是迄今世界上最大的一次流行。1989年,Reyes等應(yīng)用基因克隆技術(shù),獲得了該病毒基因組cDNA克隆,并正式命名為戊型肝炎病毒。HEV病毒體呈球狀,無包膜,平均直徑為3234nm,表面有鋸齒狀刻缺和突起,形似杯狀,故將其歸類于杯狀病毒科(Caliciviridae)。本病毒對(duì)高鹽、氯化銫、氯仿等敏感;在一708'C中易裂解,但在液氮中保存穩(wěn)定。細(xì)胞培養(yǎng)未獲成功;多種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可感染HEV。HEV基因組為單正鏈RNA,全長(zhǎng)約7.5kb,具有polyA尾,共有3個(gè)0RF,最長(zhǎng)的第一個(gè)ORF約5kb,編碼病毒復(fù)制所需的依賴RNA的RNA多聚酶等非結(jié)構(gòu)蛋白。第二個(gè)0RF長(zhǎng)約2kb,含有編碼病毒核衣殼的基因。第三個(gè)0RF只有300余個(gè)核苷酸,與第一、二ORF有部分重疊。已知HEV有2個(gè)基因型,其代表株為緬甸株(B)和墨西哥株(M)。中國(guó)株與緬甸株屬同一型,兩者的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為93%和98%;墨西哥株屬另一型,其核苷酸和氨基酸序列與緬甸株的同源性分別為77%和89%。HEV主要經(jīng)糞-口途徑傳播,潛伏期為1060d,平均為40d。經(jīng)胃腸道進(jìn)入血液,在肝內(nèi)復(fù)制,經(jīng)肝細(xì)胞釋放到血液和膽汁中,然后經(jīng)糞便排出體外。人感染后可表現(xiàn)為臨床型和亞臨床型(成人中多見臨床型),病毒隨糞便排出,污染水源、食物和周圍環(huán)境而發(fā)生傳播。潛伏期末和急性期初的病人糞便排毒量最大,傳染性最強(qiáng),是本病的主要傳染源。HEV通過對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷和免疫病理作用,引起肝細(xì)胞的炎癥或壞死。臨床上表現(xiàn)為急性戊型肝炎(包括急性黃疸型和無黃疸型)、重癥肝炎以及膽汁淤滯性肝炎。多數(shù)患者于發(fā)病后6周即好轉(zhuǎn)并痊愈,不發(fā)展為慢性肝炎。孕婦感染HEV后病情常較重,尤以懷孕69個(gè)月最為嚴(yán)重,常發(fā)生流產(chǎn)或死胎,病死率達(dá)10%20%。對(duì)HEV的感染最好作病原學(xué)診斷,否則很難與甲型肝炎相區(qū)別。可用電鏡或免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)患者糞便中的HEV病毒顆粒。盡管體外培養(yǎng)HEV方法已經(jīng)取得一定進(jìn)展,然而病毒培養(yǎng)的周期長(zhǎng),故仍不適宜臨床檢測(cè)。雖然也可用RT-PCR法檢測(cè)糞便或膽汁中的HEVRNA,然而,病毒核酸僅在急性感染前期才可被檢測(cè)出來,隨著抗體滴度的增加,病毒會(huì)迅速下降。目前,臨床診斷常用的方法是檢查血清中的抗-HEVIgM或IgG,如抗-HEVIgM陽性,則可確診患者受HEV感染;如血清中存在抗-HEVIgG,則不能排除是既往感染;因?yàn)榭?HEVIgG在血中持續(xù)存在的時(shí)間可達(dá)數(shù)月至數(shù)年。IgMELISA常用于臨床檢測(cè)HEV急性期感染。然而,抗-HEVIgM檢測(cè)敏感性低,常常因?yàn)榧訇幮越Y(jié)果的發(fā)生而導(dǎo)致不準(zhǔn)確性,為了排除假陰性結(jié)果,在檢測(cè)中需要陽性質(zhì)控物作為對(duì)照,在檢測(cè)中,只有陽性質(zhì)控物的檢測(cè)結(jié)果正確,才能保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。一般來說,用于臨床檢驗(yàn)室的質(zhì)控品需要具備良好穩(wěn)定性,預(yù)期結(jié)果已知,無已知的生物傳染危險(xiǎn)性和單批可大量獲得等性質(zhì)。通常來說,用于抗-HEVIgM檢測(cè)的質(zhì)控物為來自于病人或者獻(xiàn)血員的含有已知量抗-HEVIgM的血清或血漿與正常血漿或血清的混合物,使用此種陽性質(zhì)控物有很多顯而易見的缺點(diǎn),如價(jià)格較昂貴,可能存在醫(yī)學(xué)倫理問題,有潛在的傳染危險(xiǎn)性,在存在IgG和IgM的血清中PCR檢測(cè)陽性率達(dá)51%。并且,因?yàn)榭?HEVIgM常出現(xiàn)在病毒感染的早期,既急性期,在感染數(shù)月后抗體滴度將逐步衰退,通常來說,黃疸期出現(xiàn)的第26天,IgM抗體檢出率為73%,1-4個(gè)月,檢出率為50%,6-7個(gè)月時(shí)則只有6%,第八個(gè)月時(shí)則完全無法檢出,這也增加了獲得此類陽性質(zhì)控物的難度,使其不能大量獲得。為了克服傳統(tǒng)質(zhì)控物的上述缺點(diǎn),人們不斷尋求此類質(zhì)控物的替代品。由鼠抗體可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)組成的基因工程嵌合抗體質(zhì)控物因此發(fā)展起來,在某種程度上克服了傳統(tǒng)質(zhì)控物的缺點(diǎn)。然而,此類質(zhì)控物的制備涉及雜交瘤技術(shù),重組DNA技術(shù)等,較為復(fù)雜,延長(zhǎng)了質(zhì)控物的制備周期,并且此類抗體的親和力較之真實(shí)的人類標(biāo)本低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物的制備方法。戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物,為兔抗人HEV-lgG和人IgM嵌合抗體,以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺交聯(lián)構(gòu)成。所述兔抗人HEV-lgG為多克隆抗體。所述人IgM為市售產(chǎn)品,來源于戊肝IgM病毒抗體診斷試劑盒,北京萬泰生物藥業(yè)有限公司。戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物的制備方法,包括如下歩驟(1)用HEV抗原免疫新西蘭大白兔,得到含多抗的血清;(2)純化兔抗人HEV-lgG;(3)兔抗人HEV-lgG和人IgM交聯(lián)形成嵌合抗體。所述用服V抗原免疫新西蘭大白兔,得到含多抗的血清是指采用皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫法,免疫新西蘭大白兔,經(jīng)一次基礎(chǔ)免疫和多次加強(qiáng)免疫,得到含多抗的血清。所述純化兔抗人HEV-lgG的方法是采用Amersham公司HiTrapproteinAHP純化抗體。所述兔抗人HEV-lgG和人IgM交聯(lián)形成嵌合抗體是指取純化后的兔抗-HEVIgG和IgM適量,在MES交聯(lián)緩沖液中交聯(lián),PBS透析去除小分子,即得。在本研究中,我們擬用一種化學(xué)交聯(lián)方法建立的兔抗HEV-lgG和人IgM嵌合抗體替代傳統(tǒng)的血清作為質(zhì)控物。利用EDC(l-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺)作為此兩種抗體的交聯(lián)劑形成嵌合抗體,因?yàn)橥每?HEVIgG可與商品試劑盒中標(biāo)記了酶的抗原結(jié)合,人IgM能與試劑盒中包被在微孔板上的特異識(shí)別人IgMFc片段的抗人p鏈結(jié)合,故此嵌合抗體可用于抗-HEVIgM檢測(cè)的質(zhì)控物。臨床診斷HEV常用的方法是檢査血清中的抗-HEVIgM,如抗-HEVIgM陽性,則基本可確診患者受HEV感染。為了避免檢測(cè)中假陰性結(jié)果的出現(xiàn),確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性,需要一種含有的HEV抗體的陽性質(zhì)控物。檢測(cè)中使用陽性質(zhì)控作為對(duì)照,雖然不能增加檢測(cè)靈敏性,但是可以提供信息幫助發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中可能存在的問題,提高HEV篩查過程的總體質(zhì)量。在本研究中,我們采用化學(xué)的方法將兔抗-HEVIgG和人-IgM交聯(lián)在一起得到嵌合抗體,可用于免疫分析中HEV檢測(cè)的陽性質(zhì)控物。首先我們通過用HEV基因重組抗原免疫家兔,獲得的兔抗-HEVIgG多克隆抗體經(jīng)過蛋白A-Sepharose親和層析的方法加以純化。兔抗-HEV多克隆抗體被純化以后,我們用SDS-PAGE蛋白電泳分析其純度和用紫外分析儀測(cè)定其260nm和280nm吸光度計(jì)算抗體濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明純化后的抗體純度較好,沒有其他雜質(zhì),并且濃度較高,可用于下一步的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。純化后的兔抗-HEVIgG和人-IgM因其含有氨基和羧基,故可用化學(xué)交聯(lián)劑EDC將二者交聯(lián)形成嵌合抗體。交聯(lián)后所得到的嵌合抗體經(jīng)過商品試劑盒ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其仍保持較好的活性,表明交聯(lián)劑EDC并沒有影響嵌合抗體和包被在微孔板上的抗人IJ鏈及酶標(biāo)抗原的反應(yīng)。我們構(gòu)建的此嵌合抗體陽性質(zhì)控物不僅可用于IQC(lnternationalQualityControl,室內(nèi)質(zhì)量控制)也可用于EQA(ExternalQualityControl,室間質(zhì)量評(píng)價(jià))。因?yàn)榇朔N質(zhì)控物均一,穩(wěn)定,安全,可提高臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作中批間,批內(nèi)樣本檢測(cè)的一致性,而且可以客觀的評(píng)價(jià)一實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果與靶值的差異,使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。傳統(tǒng)的陽性質(zhì)控通常是含有已知量的抗HEV抗體的陽性血清或血漿與陰性基質(zhì)的混合物,我們構(gòu)建的此嵌合抗體陽性質(zhì)控,克服了傳統(tǒng)的陽性質(zhì)控的顯而易見的缺陷,比如因?yàn)榭笻EV-IgM在病毒感染六個(gè)月后既會(huì)消失,從而增加了獲得高滴度抗HEV-IgM的難度,從而帶來一系列的經(jīng)濟(jì)和倫理問題,并且傳統(tǒng)的質(zhì)控血清具有潛在的感染危險(xiǎn)性。重組基因工程抗體含有鼠可變區(qū)基因和人恒定區(qū)基因,也可用于免疫分析中的陽性質(zhì)控。此類基因工程嵌合抗體可持續(xù)大量獲得,并保持較一致的均一性和特異性,然而,此類抗體的產(chǎn)生比本研究中的化學(xué)交聯(lián)方法產(chǎn)生的嵌合抗體要復(fù)雜的多,因?yàn)槠渖婕半s交瘤技術(shù)和重組DNA技術(shù)等,延長(zhǎng)了整個(gè)制備的周期。另外,針對(duì)一個(gè)抗原或單一抗原決定簇的單克隆抗體不能正確地模擬人類血清樣本,因此,針對(duì)人血清中抗體的復(fù)雜性,在某些情況下需要多個(gè)基因工程抗體來識(shí)別不同抗原或者同一抗原的不同表位。相對(duì)此而言,我們構(gòu)建的來自于多克隆抗體的嵌合抗體與真實(shí)的人類樣本和抗原的親和性相似,故更加適宜用作陽性質(zhì)控。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于本發(fā)明構(gòu)建的用于免疫分析HEV的嵌合抗體質(zhì)控物適用于EQA和IQC。利用化學(xué)交聯(lián)方法構(gòu)建抗HEVIgM質(zhì)控物在國(guó)內(nèi)外仍屬首次。該指控物可在保持相對(duì)均一的前提下重復(fù)生產(chǎn),相對(duì)穩(wěn)定,易于高滴度大量獲得,沒有潛在的生物傳染危險(xiǎn)性,較為經(jīng)濟(jì),不涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題,并且其與抗原的親和力較高。是一種良好的陽性質(zhì)控物。下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩說明,凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換,均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為SDS-PAGE電泳圖*,*20kD處為IgG輕鏈,50kD處為IgG重鏈。圖2為穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,圖2-l為l:100稀釋,圖2-2為l:50稀釋。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中涉及的主要材料和試劑弗氏完全佐劑,SIGMA,美國(guó)弗氏不完全佐劑,SIGMA,美國(guó)蛋白電泳Marker,天根生化,中國(guó)Human-IgM,友誼中聯(lián),中國(guó)HiTrapproteinAHP,Amersham,美國(guó)MES,SIGMA,美國(guó)EDC,Pirece,德國(guó)無水乙醇,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)異丙醇,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)丙烯酰胺,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)過硫酸銨,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)SDS,Serva,德國(guó)氯化鉀,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)氯化鈉,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)磷酸二氫鈉,北京化學(xué)試劑公司,中國(guó)TEMED,Biosharp,美國(guó)酶標(biāo)儀,Labsystems,芬蘭洗板機(jī),拓普分析儀器有限公司,中國(guó)蛋白分析儀,Eppendorf,德國(guó)酶標(biāo)板,Corning,美國(guó)純化試劑的制備(1)中和液1MTris-HCl,pH9.0:,80ml蒸餾水溶解12.llgTris,加濃鹽酸調(diào)pH至9.0(約7.5ml),加水定容至lOOml。(2)Bindingbuffer:20mM磷酸鈉,pH7.0,3.8012g磷酸鈉溶于500ml水中,用7濃鹽酸調(diào)pH至7.0(約1.5ml)。(3)Elutionbuffer:0.58%(v;v)冰醋酸NaCl(0.15M)溶液,NaCl(0.15M)溶液4.383gNaCl溶于500ml水中,再加入1.45ml冰醋酸。蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑配制(參見分子克隆下冊(cè)P1716)(1)lXTris-甘氨酸電泳緩沖液可配5X儲(chǔ)存液,900ml去離子水中加15.lgTris堿和94g甘氨酸,再加50mllO。/。SDS(m/V),用去離子水補(bǔ)至1000ml。(2)考馬斯亮藍(lán)染色液0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于100ml甲醇冰醋酸溶液中,濾紙過濾除去顆粒物質(zhì)。甲醇冰醋酸溶液500ml甲醇、400ml水、100ml冰醋酸混合。(3)色液500ml甲醇、400ml水、100ml冰醋酸混合。(4)30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液29g丙烯酰胺,lgN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于80ml水中,37'C使之完全溶解,加水定容到100ml,過濾,Ph<7.0。4'C避光保存。(5)10%過硫酸銨取lg過硫酸銨用水配成總體積10ml。(6)1.5mol/LTris:800ml的蒸餾水溶解181.6gTris堿,加濃硫酸調(diào)pH值到所需值,加水定容到1L。(7)10%SDS:用900ml水溶解lOOg電泳級(jí)SDS。加熱到68°C并用磁力攪拌器攪拌溶解,若需要,加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)Ph到7.2,用水定容到1L。(8)50mM/LTris-HCl:800ml的蒸餾水溶解6.06gTris堿,加濃硫酸調(diào)pH值到所需值,加水定容到1L。(9)100mM二硫蘇糖醇20ml0.Olmol/L乙酸鈉溶液(Ph5.2)溶解0.309DTT,過濾除菌,-20"儲(chǔ)存。ELISA檢測(cè)和交聯(lián)試劑(1)包被緩沖液50mmol/l碳酸鹽緩沖液(pH9.5),碳酸鈉0.32g,碳酸氫鈉0.58g,加水稀釋至200ml。(2)MES交聯(lián)緩沖液:0.1MMES,0.9%NaCl,pH4.5-5.0,500ml水、10.66gMES、4.5gNaCl用NaOH調(diào)pH到4.5-5。PBS交聯(lián)緩沖液10mMPBS,159mMNaCl,pH7,4500ML水、1.9gNa3PO:!*12H20、4.65gNaCl用HC1i周pH到7.4。實(shí)施例1:兔抗人HEV-IgG的制備一.材料1.新西蘭大白兔,健康雄性,體重2.5kg左右,北京幸福動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。2.抗原NE2,批號(hào)20060829,含量1.817mg/ml,北京萬泰生物藥業(yè)有限公司。3.戊肝IgM病毒抗體診斷試劑盒,北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。二.方法1.血清制備耳靜脈采血,用1.5mle卯endorf離心管收集l-2ml血液,以便日后做對(duì)照。將兔血在室溫下靜置數(shù)小時(shí),將血清移至一新的離心管中,5000rpm離心10分鐘收集血清,置血清于1.5ml管中,-70。C保存。2.抗原制備取10ii1抗原原液,用注射用0.9%生理鹽水稀釋至lml(含量為20ug/ml)。取lml完全福氏佐劑與抗原等體積混合(用lml注射用水溶解抗原),吸入兩只5ml注射器內(nèi),反復(fù)推拉混合,使之乳化成油包水的乳化懸液(檢測(cè)是否乳化2ml注射器,滴一滴乳劑于冷水表面,合格乳劑液滴應(yīng)保持在水面完整而不分散。)3.基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫取5tU抗原原液,用注射用水稀釋至lml,加入lml完全弗氏佐劑或不完全福氏佐劑(基礎(chǔ)免疫用CFA,加強(qiáng)免疫用IFA),共制成2ml乳劑,每只注射lml乳劑。免疫途徑為背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫法。每次免疫后每只兔取血約1.5ml做ELISA檢測(cè),將兔血在室溫下靜置數(shù)小時(shí),將血清移至一新的離心管中,5000rpm離心10分鐘收集血清,置血清于1.5ml管中,-70°C保存。4.透析袋處理把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20cm)的小段,在大體積的2y。(W/V)碳酸氫鈉和lmmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。酉己EDTA:500ml水、0.146gEDTA,用NaOH調(diào)pH到8.0;500mlEDTA中加10gNaHCO3。用蒸餾水徹底清洗透析袋。放在lmmol/LEDTA(pH8.0)中將之煮沸10分鐘。冷卻后,存放于4度,必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋是必須戴手套。,用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出,將之清洗干凈。5.ELISA檢測(cè)抗體滴度(l)兔血清包板取1(H4兔血清用包被緩沖液稀釋至100(^1(1:100),從這1000W稀釋后的血清中取用包被緩沖液稀釋至1000ri(1:1000)(2)包被首先將稀釋后的兔血清(1:100和1:1000)于碳酸鹽緩沖液中包被聚苯乙烯固相,每種稀釋度包被兩孔,每孔100W,4。C下過夜,形成固相抗體,用洗板機(jī)洗板五次,拍干。(3)封閉20%小牛血清封閉,每孔150W,37。C2小時(shí),用洗板機(jī)洗板五次,拍干。(4)加酶加入酶標(biāo)記抗體各IOOW,輕拍混勻。37'C溫育40分鐘;(5)洗滌用洗板機(jī)洗板五次,拍干(每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時(shí)間)(6)顯色加入酶底物A,B液各50W,溫育顯色測(cè)定.37'C閉光15分鐘。加終止液每孔各50W,終止反應(yīng)。(7)測(cè)定:用雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值。6.親合層析純化兔抗HEV-IgG(1)試劑及樣品制備血清10000xg離心10分鐘,去除細(xì)胞和脂類,0.45ym濾膜過濾。試劑如上所述,所有配制試劑的水及化學(xué)物質(zhì)均需高純度,使用前用0.45ym濾膜過濾。(2)收集管準(zhǔn)備于每個(gè)收集管中加入1MTris-HCl,PH9.0中和收集組分以防止酸性洗脫液影響抗體效價(jià),比例為310iU/ml收集組分。(3)裝柱注射器中裝滿Bindingbuffer,安裝至層析柱上,逐低加入Bindingbuffer以防止將氣泡帶入柱中。(4)打開柱末端螺旋蓋。(5)10倍柱體積的Bindingbuffer以lml/min(30滴/min)的流速洗柱(lml柱)。(6)上樣注射器上樣lml。(7)10倍柱體積的Bindingbuffer洗柱,至無蛋白流出(OD<0.2)。(9)測(cè)OD值。(10)5倍柱體積的20%乙醇洗柱,4-8度儲(chǔ)存于20%乙醇中。7.蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)配制5%分離膠(適用于分子量為60-200kD的蛋白質(zhì)),小心注入玻璃板間隙內(nèi),至高度為llcm,上覆水飽和異丁醇層,隔離空氣,室溫聚合30-60分鐘,傾去覆蓋物,吸水紙吸干殘留液體,配制積層膠,注入分離膠上端,高度為lcm,小心插入梳子,避免氣泡產(chǎn)生,室溫聚合30-45分鐘。20ul樣品加入等體積2X上樣緩沖液混勻,IOO'C加熱5分鐘。每孔上樣20iU,首先以8V/cm進(jìn)行,待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)整為15V/cm,直至溴酚蘭抵達(dá)分離膠底部。考馬斯亮蘭藍(lán)染色將凝膠浸泡于考馬斯亮蘭染液中,振蕩染色4小時(shí),脫色液脫色至蛋白條帶清晰時(shí),分析抗體的條帶。分離膠和基層膠配制方法如下(1)分離膠配制(單位ml):水2.330%丙烯酰胺5.01.5mol/LTris(pH8.8)2.5腦SDS0.110%過硫酸銨(交聯(lián)劑)0.1TEMED(催化劑)0,004(2)5%積層膠的配制(單位ml):水3.430%丙烯酰胺0.831.5mol/LTris(pH6.8)0.6310%SDS0.0510%過硫酸銨0.05TEMED0.0058.蛋白濃度測(cè)定測(cè)純化后的0D值,用下述公式計(jì)算蛋白濃度蛋白濃度(mg/ml)=1.45A28。_0.74A260三.結(jié)果1.動(dòng)物免疫新西蘭大白兔2只,健康雄性,體重2.5kg左右,免疫前耳緣靜脈取血,用1.5ml離心管收集l-2ml血液,制備陰性對(duì)照血清,以便日后做對(duì)照。取10nl抗原原液,用注射用水稀釋至lml(含量為20ug/ml)?;A(chǔ)免疫取lml弗氏完全佐劑與抗原等體積混合(用lml注射用水溶解抗原),加強(qiáng)免疫則用弗氏不完全佐劑共制成2ml乳劑,每只家兔注射1ml乳劑,免疫途徑為皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫法。每次免疫后每只兔取血約1.5ml,ELISA檢測(cè)抗體滴度,具體免疫情況見表1。每次免疫的時(shí)間間隔為兩個(gè)星期。表l:動(dòng)物免疫免疫次數(shù)抗原劑量乳劑量取血ELISA初次免疫共lOullml/只(10ng/ml)陰性對(duì)照一次加強(qiáng)共5ullml/只(5ngml)二次加強(qiáng)共5ullml/只(5ng/ml)取血檢測(cè)三次加強(qiáng)共5ullml/只(5ng/ml)取血檢測(cè)四次加強(qiáng)共6ullml/只(5ng/ml)取血檢測(cè)五次加強(qiáng)共5ullml/只(5ng/ml)取血六次加強(qiáng)共5ullml/只(5ng/ml)取血檢測(cè)2.ELISA檢測(cè)抗體滴度結(jié)果ELISA方法檢測(cè)陰性對(duì)照血清和各次加強(qiáng)免疫后血清抗體滴度,以發(fā)現(xiàn)是否產(chǎn)生免疫效果。取10W兔血清用包被緩沖液倍比稀釋至1:100,1:1000,1:10000,1:105。每個(gè)稀釋度均做副孔,經(jīng)過包被,封閉,加酶和顯色后,雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定OD值。具體結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與陰性對(duì)照值相比,隨著免疫次數(shù)的增加,兩只家兔抗體滴度逐漸增加,兩只家兔抗血清各稀釋度OD值最終最高分別可達(dá)0.844,1.650,,2.051,0.133;和1.591,3.125,3.032,0,364,表明免疫達(dá)到預(yù)期效果,產(chǎn)生了較高滴度的抗體,并且發(fā)現(xiàn)l:IOOOO稀釋效果較好。表2:ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果f稀釋陰性一次二次三次四次五次六次兔號(hào)倍數(shù)對(duì)照加強(qiáng)加強(qiáng)加強(qiáng)加強(qiáng)加強(qiáng)加強(qiáng)1:1000.0750.8521.1121.5920.2591.0310.8440.0870.8130.6701.2250.2940.9750.6861:10000.0111.1242.7782.8821.4281.9751.477l號(hào)0.0071.1702.7462.8340.9381.6941.6501:100000.1050.3551.8812.0391.2601.4691.6740.0240.3011.7551.9221.3541.4922.051121:1050Oil0.0220.0660.0880.09601460.1310.0190.02000580.02500670.1600.1331:10600130.0220.0180.0140.Oil00130.0120.0110.Oil00150.01000120Oil0.0101:1000.0091.0632.2552.0930.8241.4961.5910.0080.6562.3132.1320.9591.7830.7441:10000.0191.3563.8823.6453.1802.8172.7272號(hào)0.0221.5193.6103.6073.1533.0603.1251:100000.0540,7393.3873.5661.9553.1822.9430.Oil0.6993.3483.4752.4113.0813.0321:1050.Oil0.0210.1350.2830.0850.4030.3640.Oil0.0470.2600.1760.1870.4520.2831:1060.0120.0100.Oil0.0230.Oil0.0100.0120.0100.Oil0.Oil0.0510.0130.0230.Oil*表中數(shù)值為450nm/630nm下OD值第六次加強(qiáng)免疫后,兔頸動(dòng)脈放血,置于50ml離心管中,兔血清離心,分裝小管,2號(hào)兔38ml,l號(hào)兔14ml以備日后純化。3.抗體純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果葡萄球菌A蛋白(SPA)具有與多種哺乳動(dòng)物IgG分子Fc段結(jié)合的能力,并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。利用改變TO及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-S印harose柱上的IgG或不同的IgG亞類,可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。在此步實(shí)驗(yàn)中,我們采用Amersham公司HiTrapproteinAHP純化抗體。首先按照上文所述方法配制中和液,Bindingbuffer,Elutionbuffer,上述所有試劑經(jīng)0.45um濾膜過濾。親合層析收集洗脫組分,通過蛋白濃度測(cè)定和蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷純化后抗體的濃度和純度。用公式計(jì)算蛋白濃度蛋白濃度(mg/ml)=1.45A加)-0.74A260,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明純化后抗體濃度可達(dá)10mg/ml,并且抗體純度達(dá)到預(yù)期要求,沒有雜帶(見圖1)。ELISA檢測(cè)純化后抗體活性,結(jié)果見表3,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗體活性較好,可進(jìn)行交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。表3:抗體活性檢測(cè)稀釋倍數(shù)OD值OD值(復(fù)孔)陽性1:1001.9911.478對(duì)照1:10003.7283.9321:100003.7193.817純化700Pg/ml4.4314.373后樣70Pg/ml5.9094.239品(4)74g/ml4.0554.496實(shí)施例2:抗體交聯(lián)一.方法1.兔抗HEV-IgG與人IgM交聯(lián)(1)取用MES交聯(lián)緩沖液透析后的(約180U1)及(約427"1)(lmglgG及l(fā)mglgM)(2)平衡EDC至室溫(3)混合透析后的上述兩種蛋白。(lmglgG及l(fā)mglgM)(4)取2.5mgEDC,溶于250ul水中,取100u1加入至反應(yīng)體系。(5)室溫反應(yīng)2小時(shí)。(6)用PBS透析過夜(1000ml)透析過夜,其間換液三次,間隔放于4度,并且攪拌。2.ELISA測(cè)定嵌合抗體滴度(1)每孔加入樣品稀釋液。(2)依次加入陰性對(duì)照,EDC交聯(lián)產(chǎn)物和陽性對(duì)照(均做兩孔)。(3)37。C溫育30分鐘,洗扳5次。(4)加入酶標(biāo)抗體IOOW,輕拍混勻。37'C溫育30分鐘;洗扳5次。(5)加入酶底物A,B液各50W,溫育顯色測(cè)定.37'C閉光15分鐘。(6)加終止液每孔各50W,終止反應(yīng)。(7)測(cè)定用雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值。3.嵌合抗體與陽性血清稀釋度比較(1)每孔加入樣品稀釋液。(2)用20%小牛血清將嵌合抗體和陽性血清按下列比例稀釋1:IO,I:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640。(3)依次加入陰性對(duì)照,各稀釋度的嵌合抗體和陽性血清,陽性對(duì)照IOW。(4)37。C溫育30分鐘,洗扳5次。(5)加入酶標(biāo)抗體IOOW,輕拍混勻。37'C溫育30分鐘;洗扳5次。(6)加入酶底物A,B液各50W,溫育顯色測(cè)定。37'C閉光15分鐘。(7)加終止液每孔各50W,終止反應(yīng)。(8)測(cè)定用雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值。二.結(jié)果EDC(l-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺)是一種可用于交聯(lián)羧基和氨基的交聯(lián)物,并且交聯(lián)操作簡(jiǎn)單,利用此交聯(lián)劑,我們可將兩種含有羧基和氨基的抗體交聯(lián)在一起形成嵌合抗體。所得到的嵌合抗體用戊肝IgM檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否有活性,并用未交聯(lián)的兔抗-HEV-IgG作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未交聯(lián)的兔抗-HEV-IgGP/N(陽性和陰性的OD值)比值為2.5,而嵌合抗體P/N比值為198,說明嵌合抗體在ELISA檢測(cè)中可達(dá)到質(zhì)控物的標(biāo)準(zhǔn)。表4:嵌合抗體與陽性血清各稀釋度比較稀釋比例1:101:201:40h801:1601:3201:640嵌合抗體1.4090.8230.7270.5620.2780,1430.112陽性血清0.7860.8320,7110.5270.3160.1180.085陽性:1.814陰性0.006Cutoff=0.26+0.006實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,嵌合抗體與陽性血清的滴度均為1:160,因此構(gòu)建的嵌合抗體更加類似于陽性血清。實(shí)施例3:交聯(lián)抗體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)一.方法將交聯(lián)物進(jìn)行l(wèi):50,1:IOO稀釋、放置于各條件下、保存不同時(shí)間后應(yīng)用戊肝檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ELISA檢測(cè)。1.倍比稀釋原液稀釋液成分含20%小牛血清的稀釋液(含防腐劑硫柳汞,慶大)15稀釋以陽性樣本原液進(jìn)行1:50,取600W加稀釋液至35ml以陽性樣本原液進(jìn)行1:100,取30014加稀釋液至35ml2.具體條件將研究樣本在37'C、室溫、4°C、_20"以及-701:至室溫反復(fù)凍融3次的樣本穩(wěn)定性。具體條件見表5:_表5:嵌合抗體穩(wěn)定性研究__放置條件放置時(shí)間_37°C,相對(duì)濕度60-80%1天3天7天2周3周_£J_室溫(20-25°C,相對(duì)濕度20-25%)1天3天7天2周3周4周_^J5_2-8。C3天7天2周3周4周6周__-20。C2周4周<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3.樣本分裝分裝前將生物安全柜清潔消毒,紫外照射30分鐘;選用DNAse的螺口離心管(蓋子有密封圈),在生物安全柜內(nèi)分裝液體制備物,分裝量為每支0.5ml(共60管)。4.鑒定應(yīng)用商品試劑對(duì)各濃度、不同溫度保存樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè),觀察其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中使用同一批次試劑,同一儀器、相同耗材并經(jīng)同一人員操作、嚴(yán)格按操作說明進(jìn)行。二.結(jié)果將交聯(lián)后得到的嵌合抗體進(jìn)行1:50,1:100稀釋,在生物安全柜內(nèi)分裝,分裝量為每支0.5ml(共60管),每個(gè)條件下設(shè)副管,放置于各溫度條件下37°C、室溫、4°C、-20°C,-70。C以及反復(fù)凍融3次,保存不同時(shí)間后應(yīng)用戊肝檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ELISA檢測(cè)樣本穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中注意使用同一批次試劑,同一儀器、相同耗材并經(jīng)同一人員操作、嚴(yán)格按操作說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嵌合抗體在37。C至少保持穩(wěn)定一個(gè)月,在室溫、4'C則至少為兩個(gè)月,而在較低溫度如-2(TC,-70匸和反復(fù)凍融條件下不太穩(wěn)定。因此,我們認(rèn)為室溫兩個(gè)月內(nèi)可能是此嵌合抗體的較適宜保存條件。權(quán)利要求1.戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物,其特征在于為兔抗人HEV-IgG和人IgM嵌合抗體,以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺交聯(lián)構(gòu)成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物,其特征在于所述兔抗人HEV-lgG為多克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物,其特征在于所述人IgM為市售產(chǎn)品。4.戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物的制備方法,包括如下步驟(1)用HEV抗原免疫新西蘭大白兔,得到含多抗的血清;(2)純化兔抗人HEV-lgG;(3)兔抗人HEV-lgG和人IgM交聯(lián)形成嵌合抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用HEV抗原免疫新西蘭大白兔,得到含多抗的血清是指采用皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫法,免疫新西蘭大白兔,經(jīng)一次基礎(chǔ)免疫和多次加強(qiáng)免疫,得到含多抗的血清。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物的制備方法,其特征在于所述純化兔抗人HEV-lgG的方法是采用Amersham公司HiTrapproteinAHP純化抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求4兔抗人HEV-lgG和人lgM交聯(lián)形成嵌合抗體是指取純化后的兔抗-HEVIgG和IgM適量,在MES交聯(lián)緩沖液中交聯(lián),PBS透析去除小分子,即得。全文摘要本發(fā)明公開了一種戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物及其制備方法,屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域
。戊型肝炎兔-人嵌合抗體質(zhì)控物,其特征在于為兔抗人HEV-IgG和人IgM嵌合抗體,以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺交聯(lián)構(gòu)成。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于本發(fā)明構(gòu)建的用于免疫分析HEV的嵌合抗體質(zhì)控物適用于EQA和IQC。利用化學(xué)交聯(lián)方法構(gòu)建抗HEVIgM質(zhì)控物在國(guó)內(nèi)外仍屬首次。該質(zhì)控物可在保持相對(duì)均一的前提下重復(fù)生產(chǎn),相對(duì)穩(wěn)定,易于高滴度大量獲得,沒有潛在的生物傳染危險(xiǎn)性,較為經(jīng)濟(jì),不涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題,并且其與抗原的親和力較高。是一種良好的陽性質(zhì)控物。文檔編號(hào)G01N33/576GK101676726SQ200810222520公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年9月18日優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日發(fā)明者括張,瑞張,李金明,王露楠申請(qǐng)人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院
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