Ev71病毒 vp1重組抗原及其單克隆抗體與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一組腸道病毒71型(EV71)病毒VP1重組抗原及其單克隆抗體與應(yīng) 用,屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病(Hand footmouthdisease,HFMD)是由腸道病毒引起的一種全球性常 見的急性傳染病。該病多發(fā)生于5歲以下兒童,主要表現(xiàn)為口痛、厭食、低熱、手、足、口腔等 部位出現(xiàn)小皰瘆或小潰瘍,少數(shù)患兒可引起心肌炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快,導(dǎo) 致死亡。手足口病是由腸道病毒引起的傳染病,引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)。 目前國(guó)內(nèi)爆發(fā)的手足口病以柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和腸道病毒71型(EV71)引起 最為常見。CoxA16引起的手足口病一般癥狀較輕,容易自愈。感染EV71病癥則相對(duì)較重, 20%患者可能出現(xiàn)重癥炎癥及傷害中樞系統(tǒng)造成后遺癥。故早發(fā)現(xiàn)早診斷可有效降低該病 毒傳播風(fēng)險(xiǎn),并有助于患者得到及時(shí)治療。因此,開發(fā)好研制有關(guān)EV71病毒檢測(cè)試劑和方 法顯得尤為重要。
[0003] 腸道病毒71型(EV71)于1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰 兒糞便標(biāo)本中分離出來。病毒基因組為單股正鏈RNA,全長(zhǎng)約7. 5kb,編碼含2194個(gè)氨基 酸的多聚蛋白。該蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P3 3個(gè)前體蛋白;其中P1蛋白可分解為 VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)外殼蛋白。VP1、VP2、VP3暴露在病毒衣殼蛋白的表面,具有大量 抗原決定簇,而其中的VP1是最主要的衣殼蛋白,具有最多的特異性中和位點(diǎn),因此,VP1蛋 白的編碼基因序列與病毒血清具有較高的相關(guān)性,常被用于病毒的鑒定和進(jìn)化分析。
[0004] 高相關(guān)的EV71病毒抗原和抗體是EV71病毒檢測(cè)試劑制備的關(guān)鍵。近年來,基因 工程的發(fā)展為研制EV71病毒抗原和抗體提供了良好基礎(chǔ)。故加強(qiáng)研制EV71病毒VP1特異 性抗原和其單克隆抗體,對(duì)開發(fā)更加有效的早期診斷EV71的方法和試劑盒具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明目的在于提供一組EV71病毒VP1重組抗原及其單克隆抗體與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的EV71病毒VP1重組抗原,其特征在于:所述重組抗原由SEQID No. 1~SEQIDNo. 11所示的11種氨基酸序列分別與柔性短肽氨基酸序列連接制得;其中, 所述柔性短肽氨基酸序列是:GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY,所述11種氨基酸序列分別 與柔性短肽氨基酸序列連接時(shí),每種氨基酸序列均重復(fù)3次。
[0007] 進(jìn)一步的,所述重組抗原有11種,其編號(hào)為EV71VP1 1號(hào)~EV71VP1 11號(hào),其中 £¥71¥?11號(hào)~£¥71¥?111號(hào)重組抗原的核苷酸序列由5£〇10吣.12~5£〇10吣.22 所示。
[0008] 基于對(duì)手足口病不同疫區(qū)的EV71病毒的研宄,本發(fā)明進(jìn)一步綜合分析了國(guó)內(nèi)外 有關(guān)EV71的文獻(xiàn),確定了EV71的VP1蛋白作為抗原靶位的主要研宄對(duì)象。通過多種生物 信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)軟件對(duì)VP1基因及其編碼蛋白序列對(duì)比分析,考慮氨基酸序列 親水性,對(duì)VP1抗原表位預(yù)測(cè),篩選得到上述EV71病毒11種潛在高交叉反應(yīng)性的線性親水 表位氨基酸序列,合成基因重組表達(dá),并經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有高交叉反應(yīng),其氨基酸序列具體 為:
[0009] VP1(10-20AA)SEQIDNOl :SSI⑶SVSRAL
[0010] VP1(25-40AA)SEQIDN02 :PAPTGQNTQVSSHRLD
[0011] VP1(51-65AA)SEQIDN03 :EIGASSNASDESMIE
[0012] VP1 (105-119AA)SEQIDN04 :GYANWDIDITGYAQM
[0013] VP1(119-133AA)SEQIDN05 :MRRKVELFTYMRFDA
[0014] VP1(137-150AA)SEQIDN06 :FVACTPTGEVVPQL
[0015] VP1(161-180AA)SEQIDN07 :PKPDSRESLAWQTATNPSVF
[0016] VP1(206-224AA)SEQIDN08:DGYPTFGEHKQEKDLEYGA
[0017] VP1(231-245AA)SEQIDN09:GTFSVRTVRDLQVQV
[0018] VP1(255-269AA)SEQIDN010:MKHVRAWIPRPMRNQ
[0019] VP1(270-284AA)SEQIDN011:NYLFKANPNYAGNSI
[0020] 利用基因重組方法,將上述各線性表位氨基酸序列分別加入柔性短肽并連接在一 起,可以獲得具有高交叉反應(yīng)的融合VP1重組抗原,即EV71病毒VP1重組抗原。
[0021] 本發(fā)明還提供了一組抗體,其特征在于:所述抗體是能與上述EV71病毒VP1重組 抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體。
[0022] 將上述EV71病毒VP1重組抗原蛋白免疫小鼠(注射小鼠),經(jīng)常規(guī)單克隆抗體制 備方法,純化分離,即可制備出上述重組抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體。
[0023] 本發(fā)明所述EV71病毒VP1重組抗原在制備EV71病毒抗原或抗體檢測(cè)試劑盒中的 應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明所述EV71病毒VP1特異性抗原和其單克隆抗體,可以用于開發(fā)體外檢測(cè)樣 品中是否存在抗EV71病毒抗體的試劑盒或作為其他EV71檢測(cè)產(chǎn)品的重要原料?;蛘?,可 以用于開發(fā)體外檢測(cè)樣品中是否存在EV71病毒抗原的試劑盒或作為其他EV71檢測(cè)產(chǎn)品的 重要原料。對(duì)開發(fā)更加有效的早期診斷EV71的方法和試劑盒提供了基礎(chǔ)。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)比,本發(fā)明技術(shù)具有以下特點(diǎn):
[0026] 1篩選得到的VP1抗原是線性親水表位,易于與患者血清中抗EV71病毒抗體發(fā)生 特異性結(jié)合反應(yīng)。運(yùn)用本發(fā)明的特異性重組蛋白可用于免疫于兔、鼠等動(dòng)物,制備單克隆抗 體。
[0027] 2本發(fā)明得到的單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備 (如雜交瘤技術(shù)),亦可以通過小抗體技術(shù)制備Fab段。
[0028] 3本發(fā)明的重組抗原蛋白和抗體是高特異性、高靈敏度的優(yōu)質(zhì)生物原料,均可以直 接用于檢測(cè)人血清中EV71病毒或抗EV71抗體,從而有利于EV71病毒感染早期篩查。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明范圍。若未特別指明,實(shí)施例中 所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段,所用原料均為市售商品。
[0030] 實(shí)施例1 :候選抗原表位的選擇
[0031] 通過查找NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), 對(duì)EV71 3種基因型的共70條EV71序列進(jìn)行分析,根據(jù)氨基酸序列的同源性,依次分篩選 出11條各基因型序列保守的線性表位抗原序列。其氨基酸序列分別如表1所示。
[0032] 表1本發(fā)明篩選出的11條EV71VP1線性抗原表位抗原序列
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組EV71病毒VPl重組抗原,其特征在于:所述重組抗原由SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 11所示的11種氨基酸序列分別與柔性短肽氨基酸序列連接制得;其中,所述柔性短肽 氨基酸序列是:GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY,所述11種氨基酸序列分別與柔性短肽氨 基酸序列連接時(shí),每種氨基酸序列均重復(fù)3次。
2. 如權(quán)利要求1所述EV71病毒VPl重組抗原,其特征在于:所述重組抗原有11種,其 編號(hào)為EV71 VPl 1號(hào)~EV71 VPl 11號(hào),其中EV71 VPl 1號(hào)~EV71 VPl 11號(hào)重組抗原 的核苷酸序列由SEQ ID No. 12~SEQ ID No. 22所示。
3. -組抗體,其特征在于:所述抗體是能與權(quán)利要求2所述EV71病毒VPl重組抗原特 異性結(jié)合的單克隆抗體。
4. 權(quán)利要求1或2所述EV71病毒VPl重組抗原在制備EV71病毒抗原或抗體檢測(cè)試劑 盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組EV71病毒VP1重組抗原,是由SEQ ID No.1~SEQ ID No.11所示的11種氨基酸序列分別與柔性短肽氨基酸序列連接制得。本發(fā)明還公開了能與所述EV71病毒VP1重組抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體,以及所述抗原在制備EV71病毒抗原或抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組抗原和單克隆抗體具有高靈敏度、高特異性等特點(diǎn),是可以作為研制EV71病毒檢測(cè)試劑的關(guān)鍵原料。
【IPC分類】C07K14-085, G01N33-569, C07K16-10, G01N33-68
【公開號(hào)】CN104650195
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510102558
【發(fā)明人】蓋中濤
【申請(qǐng)人】蓋中濤
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年3月9日