一類雙特異重組抗HBsAg抗體、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一類雙特異重組抗HBsAg抗 體、其制備方法及其在預(yù)防、治療乙型肝炎病毒感染中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（IfepatitisBvirus，HBV)是雙鏈DNA病毒，引起慢性乙型肝炎，而 導(dǎo)致肝衰竭、肝硬化和肝癌的發(fā)生。全球大約有三億五千萬HBV感染者，而這也成為世界公 共健康問題。最近幾十年，乙肝疫苗的研制成功，給乙肝的預(yù)防帶來了很大的希望。然而， 確有少部分人接種乙肝疫苗卻不能激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗乙肝抗體，這一部分人群一旦接觸 到乙肝的高危因素，只能注射人乙肝免疫球蛋白來預(yù)防。但人免疫球蛋白成分相對復(fù)雜，使 用的危險因素相對不確定。因此迫切需要開發(fā)一種人來源的、危險因素相對可控的生物制 品替代人乙肝免疫球蛋白。
[0003] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程抗體的發(fā)展日新月異。人源單克隆抗體產(chǎn)生包 括EBV永生化B淋巴細(xì)胞，人B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，其它種屬抗體的人源化，基于噬菌 體庫展示的全人抗體技術(shù)，基于人源化小鼠的全人抗體技術(shù)和SinglecellRT-PCR單細(xì) 胞抗體技術(shù)。由于EBV永生化B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低，嚴(yán)重限制了這一技術(shù)的推廣[Guan Y，SajadiMM,Kamin-LewisR，etal.DiscordantmemoryBcellandcirculating anti-EnvantibodyresponsesinHIV-1infection.ProcNatlAcadSciUSA 2009; 106:3952-7]。人B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合效率極低，導(dǎo)致人B淋巴細(xì)胞雜 交瘤技術(shù)很少被用于制備人源單克隆抗體。噬菌體展示庫全人抗體技術(shù)是基于人免疫 球蛋白輕鏈和重鏈基因的隨機(jī)配對，未經(jīng)歷體細(xì)胞突變和免疫系統(tǒng)的雙性選擇，導(dǎo)致其 篩選得到的抗體普遍親和力低下（KD> 10_7)，解離速率快（V< 60min)，抗體Tm值低 (<65°C)，熱穩(wěn)定性差，潛在的過敏和自身免疫風(fēng)險[MohapatraS，JuanHS.Designer monoclonalantibodiesasdrugs:thestateoftheart.ExpertRevClinImmunol 2008; 4:305-7]。由于最具潛質(zhì)的人源抗體技術(shù)-人源化小鼠的專利僅掌握在少數(shù)國際制 藥巨頭手中，且開發(fā)成本高昂，嚴(yán)重制約了這一技術(shù)的推廣。
[0004]SinglecellRT-PCR單細(xì)胞抗體技術(shù)直接從人外周血中分離含目的抗體的B細(xì) 胞，運(yùn)用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)直接克隆抗體輕鏈和重鏈，經(jīng)過體外重組來制備抗體。所制 備的抗體來源天然，危險因素可控。由于單克隆抗體都是從人外周血的B淋巴細(xì)胞中克 隆而來，經(jīng)歷了人體免疫系統(tǒng)的雙性選擇、長期的體液循環(huán)和體細(xì)胞突變，因此，顯示出 其極好的親和力（KD< 1(T9)，解離速率慢（V> 6hours)，熱穩(wěn)定性好，潛在的過敏和自身 免疫風(fēng)險低[SmithK,GarmanL,fframmertJ,etal.Rapidgenerationoffully humanmonoclonalantibodiesspecifictoavaccinatingantigen.NatProtoc 2009;4:372-84]。SinglecellRT-PCR單細(xì)胞抗體技術(shù)開發(fā)成本低廉，尤其針對外來抗原 更能顯示其優(yōu)越性。
[0005] 由于疾病的多因素性，單一靶點(diǎn)治療已經(jīng)不能滿足臨床的需求。在臨床試驗(yàn)中已 有聯(lián)合運(yùn)用兩種單克隆抗體臨床前實(shí)驗(yàn)的報道，但這種聯(lián)合應(yīng)用單克隆抗體卻有很多限 制性[KouG,ShiJ,ChenL,etal.Abispecificantibodyeffectivelyinhibits tumorgrowthandmetastasisbysimultaneousblockingvascularendothelial growthfactorAandosteopontin.CancerLett2010;299:130-6]。例如，聯(lián)合應(yīng)用兩 種單克隆抗體的的安全性和效果需要分別去評價，由此產(chǎn)生的長周期，高昂的開發(fā)費(fèi)用限 制其研制進(jìn)程，雙特異性抗體恰好解決了這一瓶頸[WuC,YingH,GrinnellC,etal. Simultaneoustargetingofmultiplediseasemediatorsbyadua1-variab1e-domain immunoglobulin.NatBiotechnol2007;25:1290-7]。此外，雙特異抗體有時還能獲 得其親本單克隆抗體所不具備的一些新奇的特性：如往往具有比原親本抗體更低的 解離速度，更強(qiáng)的封閉作用等[LuD,KotanidesH,JimenezX，etal.Acquired antagonisticactivityofabispecificdiabodydirectedagainsttwodifferent epitopesonvascularendothelialgrowthfactorreceptor2.JImmunolMethods 1999;230:159-71]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對以上問題，本發(fā)明設(shè)計基于SingleCellRT-PCR單細(xì)胞抗體技術(shù)開發(fā)一株有 極好中和HBV病毒的Anti-HBsAg雙特異性抗體。本發(fā)明采用超高速流式分選系統(tǒng)從接種 乙肝疫苗的健康志愿者外周血中分離HBsAg特異的記憶性B細(xì)胞（HBsAg+IgG+CD19+)，并制 備成單細(xì)胞樣本。采用SingleCellRT-PCR技術(shù)克隆每一個單細(xì)胞樣本中的抗體相關(guān)的 基因，并克隆入哺乳動物高效表達(dá)載體中，體外重組表達(dá)相應(yīng)的抗體。
[0007] 本發(fā)明公開了 ： 1. 一類雙特異性抗體，它含有兩個不同的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)，可以分別結(jié)合HBsAg不同的功能表位。
[0008] 2.所述的一類雙特異性抗體，其特征是重鏈可變區(qū)具有SEQN0 :2所示的氨基酸 序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQN0 :4所示的氨基酸序列。
[0009] 3. -種分離的核苷酸分子，編碼所述氨基酸序列，具有SEQN0 :1所示核苷酸序列 及SEQN0:3所示核苷酸序列。
[0010] 4. -種載體，含有所述的核苷酸分子，和所述核苷酸分子的序列操作性相連的表 達(dá)調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl，pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZE0 ( +)，pDHFR之一。
[0011] 5.所述的載體為pcDNA3. 1 ( + )。
[0012] 6. -種宿主細(xì)胞，含有所述載體，為真核細(xì)胞。
[0013] 7.所述的宿主細(xì)胞，為哺乳動物細(xì)胞。
[0014] 8?所述的宿主細(xì)胞，為Freestyle 293F細(xì)胞。
[0015] 9.一種制備所述的雙特異性抗體的方法，該方法包括： a) 采用超高流速流式分選系統(tǒng)分離接種乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特異的記 憶性B細(xì)胞，并制備成單細(xì)胞樣本； b) 采用SingleCellRT-PCR技術(shù)克隆每個樣本中抗體相關(guān)基因，體外重組表達(dá)相應(yīng)抗 體； c) 經(jīng)過功能表位測定、親和力測定及中和HBV活性測定，篩選出親和力強(qiáng)、活性高的結(jié) 合不同功能表位的兩個抗HBsAg的單克隆抗體C4G4和D2H2 ; d) 利用生物工程技術(shù)將C4G4、D2H2這兩個單克隆抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)分別經(jīng)過 重鏈linker、輕鏈linker連接，制備成具有雙功能的抗體； e) 在表達(dá)條件下，培養(yǎng)任一所述的宿主細(xì)胞，表達(dá)雙特異性抗體C4D2-BsAb，分離純 化。
[0016] 10.-種組合物，含有所述的雙特異性抗體，和藥學(xué)上可接受的載體。
[0017] 11.所述的雙特異性抗體在制備抗HBV感染中的應(yīng)用。
[0018] 12.所述的組合物在制備抗HBV感染中的應(yīng)用。
[0019] 13.任一所述的用途，還包括和其他的抗HBV感染中的藥物聯(lián)合使用。
[0020] 在本發(fā)明中，成功克隆了 42株全新的Anti-HBsAg單克隆抗體，采用ELISA的方法 鑒定了其功能表位，親和力及中和HBV