專利名稱：重組抗－cd40抗體及其應(yīng)用的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療包括癌癥、炎性疾病和免疫系統(tǒng)疾病或紊亂在內(nèi)的疾病的方法和組合物，包括給予增強(qiáng)CD40配體與CD40結(jié)合的CD40結(jié)合蛋白。CD40結(jié)合蛋白包括重組/變異形式的單克隆抗體S2C6及其衍生物。
2.發(fā)明背景CD40是一種在各種細(xì)胞類型上表達(dá)的細(xì)胞表面磷酸化糖蛋白，所述細(xì)胞類型包括B細(xì)胞、B細(xì)胞惡性腫瘤、小結(jié)樹突細(xì)胞、上皮基細(xì)胞和癌。CD40結(jié)合CD40配體(“CD40L”)。在炎癥和癌癥過(guò)程中，CD40L于活化T細(xì)胞上表達(dá)(Younes等，1998，Br.J.Haematol.100135-141；參見(jiàn)Grewal和Flavell，1998，Annu.Rev.Immunol.16111-135的論述)。CD40與CD40L的相互作用導(dǎo)致B細(xì)胞激活和正常B細(xì)胞的增殖；然而在B細(xì)胞衍生的腫瘤系中CD40介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以導(dǎo)致激活-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡?；罨盘?hào)的強(qiáng)度是激活-誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡的關(guān)鍵(Grafton等，1997，Cell.Immunol.18245-56)。因此，用于增強(qiáng)CD40和CD40L之間的受體-配體相互作用以及活化信號(hào)強(qiáng)度的組合物和方法對(duì)于治療疾病應(yīng)當(dāng)具有巨大的價(jià)值。
2.1 CD40和CD40配體CD40是TNF受體超家族的一員。該家族包括TNFrII、CD40、CD30、LMP-1、LTBr、ATAR、OX-40和4-1BB受體。CD40組成型表達(dá)于B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上，并由在成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞上活化的細(xì)胞因子誘導(dǎo)(Van Kooten和Banchereau，1997，Curr.Opin.Immunol.，9330-337)。還已經(jīng)表明，CD40高度表達(dá)于許多人類癌癥，包括肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌和卵巢癌(Stamenkovic等，1989，EMBO J.81403-1410)。
CD40配體是一種在活化T細(xì)胞上表達(dá)的膜蛋白。受體結(jié)合CD40L導(dǎo)致CD40多聚化，產(chǎn)生活化信號(hào)(對(duì)于抗原提呈(presenting)細(xì)胞如樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞)和生長(zhǎng)與分化信號(hào)(對(duì)于細(xì)胞因子活化的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞)。CD40信號(hào)由多聚化受體經(jīng)一系列TNF受體相關(guān)因子(“TRAF”)的募集而轉(zhuǎn)導(dǎo)(Kehry，1996，J.Immunol.1562345-2348)。TRAF的各種亞型與TNF家族成員(包括CD40)的相互作用各有不同，以使向種類繁多的下游途徑提供刺激物。TRAF1和TRAF2參與編程性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)(Speiser等，1997，J.Exp.Med.1851777-1783；Yeh等，1997，Immunity，7715-725)。TRAF 2、5和6參與增殖和活化過(guò)程，包括NF-κB和c-Jun N末端激酶活化。在正常B細(xì)胞中，CD40的結(jié)合為受體復(fù)合物募集TRAF2和TRAF3，并誘導(dǎo)其它TRAF的下調(diào)(Kuhune等，1997，J.Exp.Med.186337-342)。CD40結(jié)合的作用還取決于膜密度(De Paoli等，1997，Cytometry3033-38)。重要的是，與在正常原始B細(xì)胞觀察到的增殖反應(yīng)不同，在腫瘤B細(xì)胞上的CD40結(jié)合可以導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和活化-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Funakoshi等，1994，Blood 832787-2794)。因此，在不同細(xì)胞類型中的CD40的活化、轉(zhuǎn)化、殘余TRAF和共刺激物可以誘導(dǎo)由活化和增殖至生長(zhǎng)抑制和編程性細(xì)胞死亡的反應(yīng)。
2.2抗CD40抗體除至少一個(gè)類型外，至今描述的抗CD40單克隆抗體(“mAb”)有三個(gè)基本類型(1)以至少90％封閉CD40/CD40L的相互作用并具有抗瘤特性的抗CD40單克隆抗體(Armitage等，美國(guó)專利第5,674,492號(hào)；Fanslow等，1995，Leukocyte Typing V，Schlossman等編輯，1555-556)；(2)通過(guò)CD40對(duì)抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗CD40單克隆抗體(deBoer等，美國(guó)專利第5,677,165號(hào))；和(3)通過(guò)CD40傳遞刺激信號(hào)但不增加CD40和CD40L之間的相互作用的抗CD40單克隆抗體，例如G28-5(Ledbetter等，美國(guó)專利第5,182,368號(hào)；PCT說(shuō)明書WO 96/18413)。
已表明，一種單克隆抗體CD40.4(5C3)(PharMingen，San Diego，Calfornia)使CD40和CD40L之間的相互作用增加約30-40％(Schlossman等編輯，1995，Leukocyte Typing V白細(xì)胞分化抗原1547-556)。
Armitage等(美國(guó)專利第5,674,492號(hào))介紹了使用CD40結(jié)合蛋白(包括單克隆抗體HuCD40-M2)的方法，它們能夠結(jié)合CD40并抑制CD40與CD40L的結(jié)合，以預(yù)防或治療特征為腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD40的疾病。
DeBoer等(美國(guó)專利第5,677,165號(hào))描述了抗CD40單克隆抗體，它沒(méi)有明顯的拮抗活性，結(jié)合B細(xì)胞表面上的CD40并阻斷B細(xì)胞活化。美國(guó)專利第5,677,165號(hào)的基本特征在于當(dāng)抗CD40單克隆抗體結(jié)合正常人B細(xì)胞表面上的人CD40時(shí)，正常人B細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化受到抑制。
Ledbetter等(美國(guó)專利第5,182,368號(hào))描述了一種配體G28-5，它結(jié)合B細(xì)胞表面抗原Bp50(現(xiàn)稱為CD40)并刺激活化的B細(xì)胞阻礙細(xì)胞周期，使得B細(xì)胞增殖擴(kuò)大。然而，G28-5在CD40L存在下沒(méi)有增強(qiáng)B細(xì)胞的活化，也沒(méi)有加強(qiáng)CD40/CD40L的相互作用。
S2C6是一種制備用于抵抗人膀胱癌的抗CD40單克隆抗體(Paulie等，1984，Cancer Immunol.Immunother.17165-179)。S2C6結(jié)合在各種細(xì)胞類型上表達(dá)的CD40受體，包括B-淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。已經(jīng)證明S2C6對(duì)尿路上皮癌和B細(xì)胞衍生的惡性淋巴細(xì)胞具有特異性。還已經(jīng)證明S2C6與前列腺癌細(xì)胞系HS具有反應(yīng)性，以及與黑素瘤具有弱反應(yīng)性(Paulie等，1984，Cancer Immunol.Immunother.17165-179)。已有研究證實(shí)S2C6作為B細(xì)胞惡性腫瘤診斷標(biāo)記的用途(Paulie等，1984，Cancer Immunol.Immunother.17165-179；Paulie等，1985，Eur.J.Cancer.Clin.Oncol.21701-710)。除了檢測(cè)B細(xì)胞惡性腫瘤以外，還已經(jīng)顯示S2C6向B淋巴細(xì)胞傳遞強(qiáng)生長(zhǎng)促進(jìn)信號(hào)(Paulie等，1989，J.Immunol.142590-595)。
S2C6能以劑量依賴方式刺激原代B細(xì)胞增殖，由此證明S2C6對(duì)人外周B細(xì)胞具有激動(dòng)活性(Paulie等，1989，J.Immunol.142590-595)。
盡管競(jìng)爭(zhēng)性研究已經(jīng)顯示G28-5和S2C6結(jié)合相同或最接近的表位，但經(jīng)測(cè)定所述抗體的功能不同，這主要是依據(jù)所述的單克隆抗體之一所達(dá)到的對(duì)先前受刺激的扁桃體B細(xì)胞的刺激程度(Clark和Ledbetter，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494-4498；Ledbetter等，美國(guó)專利第5,182,368號(hào))。在具體的測(cè)試條件下，實(shí)現(xiàn)扁桃體B細(xì)胞活化需要的S2C6比G28-5多100倍(Ledbetter等，美國(guó)專利第5,182,368號(hào))。
本領(lǐng)域需要一種治療方法，以增加治療或預(yù)防癌癥、激活或加強(qiáng)免疫系統(tǒng)或治療或預(yù)防免疫缺陷或疾病的功效，而本發(fā)明提供這種需要。
本文引用或有關(guān)聯(lián)的任一參考文獻(xiàn)不應(yīng)被視為允許該參考文獻(xiàn)作為本發(fā)明的先有技術(shù)。
3.發(fā)明概述申請(qǐng)人獲得的出乎意料的發(fā)現(xiàn)是一類新的抗CD40抗體，即除了傳遞刺激信號(hào)以外，還增強(qiáng)CD40和CD40L之間的相互作用、增強(qiáng)CD40L介導(dǎo)的刺激和具有體內(nèi)抗瘤活性。本發(fā)明人對(duì)S2C6單克隆抗體可變區(qū)的克隆和測(cè)序以及其中CDR區(qū)和構(gòu)架區(qū)的鑒定，促進(jìn)了這些抗體和其相關(guān)分子的產(chǎn)生和應(yīng)用。
本發(fā)明涉及的分子包含S2C6單克隆抗體的可變區(qū)或一個(gè)或多個(gè)具有新序列(SEQ ID NO3、4、8、9或10)的其互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，所述分子(a)免疫特異性地結(jié)合CD40和(b)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入，或不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述分子不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述分子是一種抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不是同種型IgG1。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述分子含有輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO2的氨基酸序列)或重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO7的氨基酸序列)。
本發(fā)明還涉及包含融合至第二種蛋白的氨基酸序列的單克隆抗體S2C6的片段的嵌合/融合蛋白，以及涉及其中單克隆抗體S2C6的片段共價(jià)結(jié)合(例如通過(guò)使用交聯(lián)劑)至另一種化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供一種免疫特異性地結(jié)合CD40的分子，該分子含有單克隆抗體S2C6的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)，它們?nèi)诤现梁衎ryodin 1(BD1)的氨基酸序列的第二種蛋白。
本發(fā)明還涉及其含有的氨基酸序列與SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10具有至少95％的同一性的蛋白，所述蛋白(a)免疫特異性地結(jié)合CD40和(b)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述蛋白不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。
本發(fā)明還涉及純化蛋白，所述蛋白(a)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(b)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(c)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入，或不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述蛋白不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。
本發(fā)明還涉及編碼所述分子和蛋白的核酸或與包括編碼核苷酸序列的所述蛋白的DNA雜交的核酸；包含所述分子和蛋白的重組細(xì)胞；以及生產(chǎn)所述蛋白的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白含有(a)由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6的重鏈可變區(qū)，和(b)人恒定區(qū)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白含有(a)由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6的輕鏈可變區(qū)，和(b)人恒定區(qū)。
本發(fā)明還涉及包含重組核酸載體的重組細(xì)胞，該載體含有編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，并使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％。本發(fā)明還提供生產(chǎn)所述蛋白的方法，包括培養(yǎng)所述細(xì)胞，使得所述蛋白由所述細(xì)胞表達(dá)，并回收所表達(dá)的蛋白。
本發(fā)明還涉及含有重組核酸載體的重組細(xì)胞，所述載體包含SEQID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQID NO13、SEQ ID NO14或SEQ ID NO15，以及涉及生產(chǎn)蛋白的方法，包括培養(yǎng)所述細(xì)胞，使得由所述核苷酸序列編碼的蛋白由所述細(xì)胞表達(dá)，并回收所表達(dá)的蛋白。
還提供優(yōu)選為純化形式的包含本發(fā)明分子和抗體的藥用組合物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有一種分子和一種藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物，所述分子含有SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，該分子(i)免疫特異性地結(jié)合CD40，(ii)增加CD40配體與CD40的結(jié)合，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述分子不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。
本發(fā)明還涉及包含一種純化蛋白和一種藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入，或不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述蛋白不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包含本發(fā)明的分子或抗體，其量可有效治療或預(yù)防癌癥，或可有效激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，或活化或增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物還包含CD40配體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述藥用組合物包含(a)一種分子，它免疫特異性地結(jié)合CD40，增加CD40配體與CD40的結(jié)合；(b)CD40配體；和(c)一種藥學(xué)上可接受的載體，它們的量可有效治療或預(yù)防癌癥或免疫疾病，或可有效激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在此實(shí)施方案中，例如，所述分子可以是天然單克隆抗體S2C6或天然單克隆抗體5C3或如本文所述的S2C6衍生物。
本發(fā)明還涉及在患者中治療或預(yù)防癌癥的方法，在患者中激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法或在患者中治療或預(yù)防免疫缺陷或疾病的方法，包括給予所述患者治療有效量的本發(fā)明的分子或抗體，例如一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的分子，所述分子(i)免疫特異性地結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，并且與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述分子不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。
本發(fā)明還涉及在患者中治療或預(yù)防癌癥的方法，在患者中激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法或在患者中治療或預(yù)防免疫缺陷或疾病的方法，包括給予所述患者一種純化的蛋白，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入，或不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述蛋白不是天然單克隆抗體S2C6，且不含有所述單克隆抗體S2C6的天然重鏈或輕鏈。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括給予所述患者CD40配體。
本發(fā)明還涉及在患者中治療或預(yù)防癌癥或免疫疾病的方法，包括給予所述患者其量可有效用于所述治療或預(yù)防的下述物質(zhì)(a)一種分子，它免疫特異性地結(jié)合CD40，該分子增強(qiáng)CD40配體與CD40的結(jié)合；和(b)CD40配體，其中所述分子可以是天然單克隆抗體S2C6或天然單克隆抗體5C3或如本文所述的任一種S2C6衍生物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述患者為人。
本發(fā)明還涉及人類以外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物或含有一種或多種編碼蛋白的轉(zhuǎn)基因的分離細(xì)胞，所述蛋白與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，并且所述蛋白使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1.S2C6的輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)。顯示了所述輕鏈可變區(qū)(“VL”)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2 S2C6的重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)。顯示了所述重鏈可變區(qū)(“VH”)的核苷酸序列(SEQ ID NO6)和氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
圖3A-3B.S2C6的可變區(qū)結(jié)構(gòu)。(A)顯示了S2C6 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。(B)顯示了S2C6 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO7)。下劃線標(biāo)示互補(bǔ)性決定區(qū)(“CDR”)。顯示了鄰接CDR的四個(gè)構(gòu)架區(qū)的序列。VLCDR 1-3的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOS3-5。VHCDR 1-3的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOS8-10。
圖4.S2C6單克隆抗體增強(qiáng)CD40-Ig與表達(dá)CD40L的Jurkat T細(xì)胞的結(jié)合。在增加濃度的抗-CD40單克隆抗體(“mAb”)存在下，CD40-Ig(CD40和人免疫球蛋白的可溶性融合蛋白)結(jié)合表面CD40L。單克隆抗體與CD40-Ig預(yù)溫育1小時(shí)，接著與表達(dá)CD40L的靶細(xì)胞溫育1小時(shí)。使用異硫氰酸熒光素(“FITC”)標(biāo)記的抗人Ig利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合靶細(xì)胞的CD40-Ig。然后根據(jù)對(duì)數(shù)平均熒光強(qiáng)度(“MFI”)測(cè)定CD40/CD40L結(jié)合的程度。顯示了減去每組背景值的MFI。
圖5.S2C6單克隆抗體增強(qiáng)可溶性CD40L與B細(xì)胞表面CD40的結(jié)合。在增加濃度的抗-CD40單克隆抗體S2C6、G28-5或M3或者無(wú)關(guān)對(duì)照單克隆抗體，EXA-1H8存在下，溫育Ramos B細(xì)胞、人B細(xì)胞淋巴瘤。將所述單克隆抗體與表達(dá)CD40的靶細(xì)胞預(yù)溫育1小時(shí)。接著通過(guò)流式細(xì)胞儀直接檢測(cè)FITC標(biāo)記的CD40L與B細(xì)胞的結(jié)合。然后根據(jù)對(duì)數(shù)平均熒光強(qiáng)度測(cè)定CD40/CD40L結(jié)合的程度。顯示了減去每組背景值的MFI。
圖6.在CD40L+刺激細(xì)胞和抗-CD40單克隆抗體存在下，S2C6增強(qiáng)原代人外周B細(xì)胞的增殖反應(yīng)。將外周B細(xì)胞(1×105/孔)與增加數(shù)目的非增殖性CD40L+Jurkat T刺激細(xì)胞和30 ng/ml的抗-CD40單克隆抗體S2C6、G28-5或M3或?qū)φ諉慰寺】贵wEXA2-1H8混合在一起。通過(guò)在加入刺激物后72小時(shí)摻入3H-TdR檢測(cè)B細(xì)胞增殖。
圖7.在CD40L存在或不存在時(shí)，對(duì)比原代人外周B細(xì)胞對(duì)抗-CD40單克隆抗體的增殖反應(yīng)。將外周B細(xì)胞與4∶1混合比率的非增殖性CD40L+刺激細(xì)胞和增加濃度的抗-CD40單克隆抗體S2C6、G28-5或?qū)φ湛贵w，EXA2-1H8混合在一起。通過(guò)在加入刺激物后72小時(shí)摻入3H-TdR檢測(cè)B細(xì)胞增殖。
圖8A-8C.單克隆抗體S2C6的體內(nèi)抗瘤活性。評(píng)價(jià)S2C6抗(A)Ramos人B細(xì)胞非Hodgkin淋巴瘤，(B)HS Sultan多發(fā)性骨髓瘤，或(C)IM-9多發(fā)性骨髓瘤的抗瘤活性。用或不用抗-脫唾液酸-GM1預(yù)處理SCID小鼠(5只/組)，以抑制天然殺傷細(xì)胞(“NK”)活性，并在注射1×106-2×106腫瘤細(xì)胞后的第1天或第5天用單克隆抗體處理所述小鼠。實(shí)線表示隨時(shí)間的存活小鼠數(shù)目。
圖9.BD1-S2C6 sFv在ELISA中特異性結(jié)合固定化CD40-Ig。BD1-S2C6 sFv(由融合至單克隆抗體S2C6可變區(qū)的bryodin 1(BD1)組成的單鏈抗-CD40免疫毒素)在大腸桿菌中作為包含體表達(dá)，使其變性和重折疊。然后使用Blue Sepharose分離重折疊的蛋白，接著經(jīng)固定化CD40-Ig親和性層析。然后測(cè)試純化蛋白在ELISA中結(jié)合固定化CD40-Ig的情況。用0.5μg/ml的CD40-Ig包被微量滴定板，接著在25μg/ml S2C6單克隆抗體(▲)、25μg/ml對(duì)照抗體BR96(●)或無(wú)過(guò)量抗體(■)存在下，加入純化BD1-S2C6 sFv的稀釋液。通過(guò)加入BD1特異性兔抗血清，接著加入綴合山羊抗兔Ig的辣根過(guò)氧化物酶，檢測(cè)BD1-S2C6 sFv與固定化受體的結(jié)合。加入過(guò)量S2C6單克隆抗體完全抑制BD1-S2C6 sFv與CD40-Ig的結(jié)合，但加入對(duì)照單克隆抗體不能完全抑制此種結(jié)合。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及S2C6基因的核苷酸序列及其編碼蛋白。本發(fā)明還涉及所述S2C6蛋白和核酸的片段以及其它衍生物和類似物。在各種具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子(例如抗體)包含全部或部分的S2C6單克隆抗體(輕鏈和/或重鏈，或輕鏈CDR 1(SEQ ID NO3)，和/或輕鏈CDR 2(SEQ ID NO4)，和/或重鏈CDR 1(SEQ ID NO8)、重鏈CDR 2(SEQ ID NO9)和/或重鏈CDR 3(SEQ ID NO10)，或輕鏈CDR 3(SEQ ID NO5)與任何其它CDR和/或四條重鏈構(gòu)架區(qū)和四條輕鏈構(gòu)架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)的組合)，前提是所述分子不是天然單克隆抗體S2C6(保藏于ATCC，獲得的保藏號(hào)微PTA-110)或其重鏈或輕鏈。所述分子與S2C6在序列和/或翻譯后修飾(糖基化、酰胺化、肽鍵合或交聯(lián)至非S2C6序列等)方面可以不同。在各種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子免疫特異性地結(jié)合CD40(或在多聚化時(shí)免疫特異性地結(jié)合CD40)、與天然S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，和/或使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％、50％、60％或65％。編碼所述分子(例如S2C6片段或其衍生物)的核酸以及編碼天然單克隆抗體S2C6的核酸也屬于本發(fā)明的范圍。提供例如通過(guò)重組方法來(lái)生產(chǎn)前述蛋白。
本發(fā)明還涉及S2C6蛋白及其衍生物，包括但不限于具有功能活性的融合/嵌合蛋白，即其能夠顯示一種或多種已知與全長(zhǎng)S2C6單克隆抗體相關(guān)的功能活性。這樣的功能活性包括但不限于結(jié)合CD40的能力、刺激信號(hào)至CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的傳遞(例如便于引起B(yǎng)細(xì)胞增殖)、CD40L與CD40相互作用的加強(qiáng)；抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力；以及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。
另外提供抗CD40的抗體，包括S2C6、其衍生物和類似物，包括但不限于人源化抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體和結(jié)合化療劑或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的抗體。
本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防癌癥、炎性疾病和免疫系統(tǒng)疾病的方法，包括單獨(dú)或與CD40L聯(lián)合給予本發(fā)明組合物。
通過(guò)下文6-9部分闡明的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例特別公開(kāi)了S2C6基因的克隆和鑒定特征；CD40/CD40L的相互作用的增強(qiáng)；腫瘤生長(zhǎng)的抑制；以及單鏈抗-CD40免疫毒素與CD40-Ig的結(jié)合。
為了使公開(kāi)內(nèi)容更清晰明嘹而不是起限制作用，本發(fā)明的詳述被分成以下的小單元。
5.1分離S2C6基因本發(fā)明涉及S2C6核酸的核苷酸序列。在具體的實(shí)施方案中，S2C6核酸包括SEQ ID NO1和6的cDNA序列，或編碼S2C6蛋白的核酸(例如具有SEQ ID NO2和7的序列的蛋白)。本發(fā)明提供的純化核酸由S2C6基因序列的至少8個(gè)核苷酸(即可雜交部分)組成；在其它實(shí)施方案中，所述核酸由S2C6序列的至少25個(gè)(連續(xù))核苷酸、50個(gè)核苷酸、100或200個(gè)核苷酸或全長(zhǎng)S2C6可變區(qū)編碼序列組成。在相同的或其它實(shí)施方案中，所述核酸的長(zhǎng)度小于50、75、100或200或5000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。核酸可以是單鏈或雙鏈。本發(fā)明還涉及與前述序列或其反向互補(bǔ)物雜交或互補(bǔ)的核酸，具體而言，這種編碼結(jié)合于CD40的蛋白的核酸與S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，和/或使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％、50％、60％或65％。在具體方面，提供包含與至少10、25、50、100或200個(gè)核苷酸或S2C6可變區(qū)基因的完整編碼區(qū)互補(bǔ)的序列的核酸。
另外提供編碼S2C6蛋白的衍生物和類似物的核酸。顯而易見(jiàn)，本文使用的“編碼S2C6蛋白的片段或部分的核酸”應(yīng)被解釋為是指僅編碼所提及的S2C6蛋白的片段或部分的核酸，而不是編碼為連續(xù)序列的S2C6蛋白的其它鄰接部分的核酸。
5.2克隆步驟以下為克隆S2C6基因的具體實(shí)施方案。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，由產(chǎn)生單克隆抗體S2C6的雜交瘤分離總RNA，并使用基于本文公開(kāi)序列的引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所需的可變區(qū)序列。參見(jiàn)作為說(shuō)明性實(shí)施例的下文6單元。至于另一個(gè)實(shí)施例，由產(chǎn)生單克隆抗體S2C6的雜交瘤分離mRNA，制備cDNA并將其連接至表達(dá)載體(例如噬菌體衍生物)，使得其能夠由宿主細(xì)胞表達(dá)，從而將其導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞中。然后可以用各種篩選測(cè)定法選擇表達(dá)產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇是基于與代表一部分S2C6基因或其RNA或其片段的標(biāo)記探針的雜交(Benton和Davis，1977，Science 196180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。這些具有與探針大致同源性的DNA片段將與探針雜交。還可能通過(guò)限制酶消化來(lái)鑒定合適的片段，并按照已知的限制圖譜(如果可以獲得的話)比較其與預(yù)期片段的片段大小?？梢愿鶕?jù)所述基因的特性進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。
或者，通過(guò)基于所需基因表達(dá)產(chǎn)物的物理、化學(xué)或免疫學(xué)特性的測(cè)定，可以檢測(cè)所需基因的存在。例如，可以選擇并表達(dá)cDNA克隆或雜種選擇合適mRNA的DNA克隆，以產(chǎn)生具有例如類似或等同于已知的S2C6蛋白的電泳遷移、等電聚焦特性、蛋白水解的消化圖譜或功能活性的蛋白。例如，可在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)-型方法中檢測(cè)結(jié)合CD40的能力。
還可以通過(guò)使用核酸雜交的mRNA選擇，接著通過(guò)體外翻譯，鑒定S2C6基因。在此方法中，使用片段通過(guò)雜交分離互補(bǔ)性mRNA。分離mRNA的分離產(chǎn)物的體外翻譯產(chǎn)物的功能測(cè)定(例如結(jié)合CD40等)鑒定所述mRNA，因此所述互補(bǔ)性DNA片段包含所需的序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以由本文公開(kāi)的序列化學(xué)合成S2C6cDNA?？梢允褂眉夹g(shù)人員已知的其它分離S2C6基因的方法。
然后可以將所鑒定和分離的S2C6基因/cDNA插入到合適的克隆載體中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的大量載體-宿主系統(tǒng)?？尚械妮d體包括但不限于質(zhì)?；蛐揎棽《荆鲚d體系統(tǒng)必須與使用的宿主細(xì)胞相適配。這樣的載體包括但不限于噬菌體(如λ衍生物)或質(zhì)粒，諸如PBR322或pUC質(zhì)粒衍生物或Bluescript載體(Stratagene)。例如，可以通過(guò)將所述DNA片段連接至具有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)克隆載體的插入。然而，如果用于所述DNA片段的互補(bǔ)限制位點(diǎn)在所述克隆載體中不存在，則可以經(jīng)酶修飾所述DNA分子的末端?；蛘?，通過(guò)將核苷酸序列(接頭)連接至DNA末端上，可以產(chǎn)生任何需要的位點(diǎn)；這些連接接頭可以含有編碼限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的特異性化學(xué)合成的寡核苷酸。在一個(gè)替代的方法中，可以通過(guò)同聚物加尾或使用含合適序列的引物的PCR，修飾切割的載體和S2C6基因?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等將重組分子引入到宿主細(xì)胞中，以便產(chǎn)生許多拷貝的基因序列。
在一個(gè)替代的方法中，可在以“鳥槍”法將所需基因插入到合適的克隆載體后對(duì)其進(jìn)行鑒定和分離。在插入所述克隆載體之前，可以通過(guò)例如大小分級(jí)進(jìn)行所需的基因的富集。
在具體的實(shí)施方案中，用加入分離的S2C6基因、cDNA或合成的DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生多拷貝的所述基因。因此，通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體、由轉(zhuǎn)化體分離重組DNA分子并在需要時(shí)由分離的重組DNA中回收所插入的基因，可以獲得大量的所述基因。
本發(fā)明提供的S2C6基因包括編碼與天然S2C6可變區(qū)發(fā)現(xiàn)的基本相同的氨基酸序列的那些核苷酸序列、編碼具有功能相同的氨基酸的氨基酸序列的那些核苷酸序列，以及編碼其它S2C6衍生物或類似物(如下文對(duì)S2C6衍生物或類似物的描述)的那些核苷酸序列。
5.3表達(dá)S2C6基因編碼S2C6蛋白或其功能活性類似物或片段或其它衍生物(參見(jiàn)5.6單元)的核苷酸序列，可以被插入到合適的表達(dá)載體中，即含有插入蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件的載體。轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的信號(hào)還可以由天然S2C6基因和/或其側(cè)翼區(qū)提供?？梢允褂酶鞣N宿主-載體系統(tǒng)表達(dá)所述蛋白編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，諸如含酵母載體的酵母或用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；轉(zhuǎn)基因植物或人類以外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。載體的表達(dá)元件在其長(zhǎng)度和特異性上有所變化。根據(jù)使用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用大量合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任一個(gè)。
可以使用先前所述的任一種將DNA片段插入到載體中的方法，構(gòu)建含有嵌合基因(由合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)組成)和蛋白編碼序列的表達(dá)載體。這些方法可包括體外重組體DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組體(基因重組)。編碼S2C6蛋白或肽片段的核酸序列的表達(dá)可以由第二種核酸序列調(diào)節(jié)，以便S2C6蛋白或肽在用重組體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件控制S2C6蛋白的表達(dá)?？捎糜诳刂芐2C6基因表達(dá)的非天然S2C6基因啟動(dòng)子包括但不限于，SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、包含在Rous肉瘤病毒的3′長(zhǎng)末端復(fù)制的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)；原核細(xì)胞表達(dá)載體如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或lac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；也參見(jiàn)“得自重組細(xì)菌的有用蛋白”，載于Scientific American，1980，24274-94；含有胭脂堿合成酶啟動(dòng)子區(qū)的植物表達(dá)載體(Herrera-Estrella等，Nature 303209-213)或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子(Gardner等，1981，Nucl.Acids.Res.92871)，以及光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶啟動(dòng)子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310115-120)；得自酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件如Gal 4啟動(dòng)子、ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子，和以下的顯示出組織特異性并已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等，1984，Cell38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)、在胰腺β細(xì)胞中有活性的基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，Cell 38647-658；Adames等，1985，Nature 318533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、在睪丸、乳房、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，Cell 45485-495)、在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1268-276)、在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer等，1987，Science 23553-58)、在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1161-171)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，Nature 315338-340；Kollias等，1986，Cell 4689-94)、在大腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，Cell 48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature 314283-286)和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，Science 2341372-1378)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用的載體包含有效連接至S2C6基因核酸的啟動(dòng)子、一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以及任選含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記(例如抗生素抗性基因)。
可通過(guò)三種基本方法鑒定包含S2C6基因插入片段的表達(dá)載體(a)核酸雜交；(b)“標(biāo)記”基因功能的存在或不存在；和(c)插入序列的表達(dá)。在第一種方法中，可通過(guò)使用含與插入的S2C6基因同源的序列的探針進(jìn)行核酸雜交，檢測(cè)插入到表達(dá)載體中的S2C6基因的存在。在第二種方法中，可根據(jù)所述載體中插入的S2C6基因產(chǎn)生的某些“標(biāo)記”基因功能(例如胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、在桿狀病毒中形成包含體等)的存在或不存在，鑒定并選擇重組載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果在所述載體的標(biāo)記基因序列中插入S2C6基因，則可通過(guò)標(biāo)記基因功能的缺失鑒定含有S2C6插入片段的重組體。在第三種方法中，可通過(guò)測(cè)定由所述重組體表達(dá)的S2C6產(chǎn)物，鑒定重組表達(dá)載體。這樣的測(cè)定可基于例如S2C6蛋白在體外測(cè)定系統(tǒng)中的物理和功能特性，例如增強(qiáng)CD40L與CD40的結(jié)合、刺激正常B細(xì)胞增殖、抑制腫瘤生長(zhǎng)。
一旦鑒定和分離出具體的重組DNA分子，則可用幾種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行增殖。一旦確定合適的宿主系統(tǒng)和培養(yǎng)條件，則可以大量增殖和制備重組表達(dá)載體。如前所述，可使用的表達(dá)載體包括但不限于以下的載體或其衍生物人或動(dòng)物病毒如痘苗病毒或腺病毒、昆蟲病毒如桿狀病毒、酵母載體、噬菌體載體(例如λ噬菌體)以及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，在此僅舉幾個(gè)例子。
此外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以需要的特異性方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。在某些誘導(dǎo)物存在下可提升某些啟動(dòng)子的表達(dá)；因此，可以控制S2C6基因工程蛋白的表達(dá)。而且，不同的宿主細(xì)胞具有用于翻譯和翻譯后加工和修飾的特征性和特異性機(jī)制(例如蛋白糖基化、磷酸化)?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對(duì)表達(dá)的前述蛋白的所需修飾和加工。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可用于產(chǎn)生非糖基化核心蛋白產(chǎn)物。在酵母中的表達(dá)可產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可用于確保異源蛋白的“天然”糖基化。而且，不同載體/宿主系統(tǒng)可不同程度地影響加工反應(yīng)。
在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)的S2C6相關(guān)蛋白為抗體或其片段或衍生物。重組抗體可含有重組輕鏈可變區(qū)、重組重鏈可變區(qū)或二者均包含在內(nèi)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，輕鏈和重鏈或其衍生物均由細(xì)胞重組表達(dá)(參見(jiàn)例如Boss等于1989年3月28日登記的美國(guó)專利第4,816,397號(hào))?？墒褂酶鞣N宿主-載體系統(tǒng)表達(dá)蛋白編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，諸如含酵母載體的酵母或用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；轉(zhuǎn)基因植物或人類以外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
5.4鑒定和純化基因產(chǎn)物在具體的方面，本發(fā)明提供S2C6蛋白及其片段和衍生物的氨基酸序列，以及編碼它們的核酸序列，所述氨基酸序列含有互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或具有其它的功能活性。本文使用的“功能活性”的S2C6物質(zhì)是指顯示出一種或多種與全長(zhǎng)(天然)S2C6蛋白相關(guān)的功能活性的物質(zhì)，所述功能活性例如為結(jié)合CD40，刺激正常B細(xì)胞增殖，抑制腫瘤生長(zhǎng)，使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供S2C6蛋白片段以及其編碼核酸，其中所述片段由至少6、10、20、50、75或100個(gè)氨基酸組成。
一旦鑒定出表達(dá)S2C6基因序列的重組體，則可以分析基因產(chǎn)物。這可通過(guò)基于所述產(chǎn)物的物理或功能特性的測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述測(cè)定包括放射性標(biāo)記所述產(chǎn)物然后經(jīng)凝膠電泳分析、免疫測(cè)定、正常B細(xì)胞增殖的刺激、CD40結(jié)合測(cè)定、CD40配體與CD40結(jié)合的促進(jìn)、腫瘤生長(zhǎng)的抑制等。
一旦鑒定出S2C6蛋白，則可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行分離和純化，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括層析(例如離子交換層析、親和性層析和分子篩(sizing)柱層析)、離心、不同溶解性或任何其它用于蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？捎萌我缓线m的測(cè)定評(píng)價(jià)功能特性(參見(jiàn)5.7單元)。
或者，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的基于本文公開(kāi)的序列的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法合成S2C6蛋白或其衍生物(例如參閱Hunkapiller等，1984，Nature310105-111)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，這類S2C6蛋白，無(wú)論是通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生還是通過(guò)化學(xué)合成方法產(chǎn)生，或是通過(guò)天然蛋白純化產(chǎn)生，都包括(但不限于)包含為初級(jí)氨基酸序列的基本如圖3A-3B(SEQ ID NO2和7)所示的氨基酸序列的全部或部分的蛋白，以及其片段和其他衍生物和其類似物(包括其同源蛋白)。
5.5 S2C6基因和蛋白的結(jié)構(gòu)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法分析本發(fā)明的S2C6基因和蛋白的結(jié)構(gòu)。以下描述這些方法的某些實(shí)例。
5.5.1遺傳分析可分析對(duì)應(yīng)于S2C6基因的克隆DNA或cDNA的方法包括但不限于DNA雜交(Southern hybridization)(Southern，1975，J.Mol.Biol.98503-517)、RNA雜交(Northern hybridization)(參見(jiàn)例如Freeman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.804094-4098)、限制性內(nèi)切核酸酶作圖(Maniatis，1982，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring HarborNew York)以及DNA序列分析。因此，本發(fā)明提供識(shí)別S2C6基因的核酸探針。例如，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；美國(guó)專利第4,683,202、4,683,195和4,889,818號(hào)；Gyllenstein等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857652-7656；Ochman等，1988，Genetics 120621-623；Loh等，1989，Science 243217-220)后用S2C6基因特異性探針進(jìn)行DNA雜交，可檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞(例如雜交瘤)的DNA或cDNA中的S2C6基因。也可以使用通常已知的非PCR擴(kuò)增方法?？蓪?duì)DNA雜交和RNA雜交二者的雜交條件的嚴(yán)格性進(jìn)行操作，以確保檢測(cè)出與使用的特異性S2C6基因探針具有所需相關(guān)度的核酸。可使用這些方法和本領(lǐng)域通常已知的其它方法的改良方法。
可使用限制性內(nèi)切核酸酶作圖粗略估測(cè)S2C6基因的遺傳結(jié)構(gòu)。可通過(guò)DNA序列分析證實(shí)由限制性內(nèi)切核酸酶切割產(chǎn)生的限制酶圖譜。
可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行DNA序列分析，包括但不限于Maxam和Gilbert法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)、Sanger雙脫氧法(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)、使用T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，美國(guó)專利第4,795,699號(hào))或使用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(例如Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)。
5.5.2蛋白分析可通過(guò)DNA序列推導(dǎo)，或通過(guò)直接蛋白測(cè)序(例如使用自動(dòng)化氨基酸測(cè)序儀)，得出S2C6蛋白的氨基酸序列。
可通過(guò)親水性分析進(jìn)一步特征鑒定S2C6蛋白序列(Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824)。親水性分布圖可用于鑒定S2C6蛋白的疏水區(qū)和親水區(qū)(加強(qiáng)免疫原性)以及編碼這些區(qū)的相應(yīng)的基因序列區(qū)。
還可以進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(Chou和Fasman，1974，Biochemistry13222)，以鑒定表現(xiàn)為特異性二級(jí)結(jié)構(gòu)的S2C6蛋白區(qū)。
還可以用本領(lǐng)域可得到的計(jì)算機(jī)軟件程序完成操作、翻譯和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、可讀構(gòu)架預(yù)測(cè)和作圖以及序列同源性測(cè)定。
5.6單克隆抗體S2C6抗體衍生物本文描述了用于產(chǎn)生能夠免疫特異性結(jié)合CD40的S2C6抗體衍生物的方法。
這樣的抗體包括但不限于單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體以及以上任一抗體的表位結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，S2C6衍生物在與S2C6初級(jí)氨基酸序列相關(guān)的初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)缺失、添加和/或取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，S2C6衍生物不是用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生的。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，S2C6衍生物在與S2C6初級(jí)氨基酸序列相關(guān)的初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)缺失、添加和/或取代，且不是用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生的。在本單元和下文的5.7單元提供選擇合適的缺失、添加和/或取代的引導(dǎo)。
為制備另外的抗CD40的單克隆抗體，可使用在培養(yǎng)基中由傳代細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)。這些技術(shù)包括但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature 256，495-497；以及美國(guó)專利第4,376,110號(hào))、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，ImmunologyToday 4，72Cole等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026-2030)以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁(yè))。這樣的抗體或本領(lǐng)域可獲得的其它抗CD40抗體例如可用作克隆的基礎(chǔ)，并因此在S2C6重鏈重組表達(dá)時(shí)提供互補(bǔ)輕鏈(兩條鏈可在同一細(xì)胞中重組表達(dá)，或在分開(kāi)表達(dá)和純化后體外組合)；或者，可使用來(lái)自任何特異性抗體的輕鏈。可將編碼S2C6重鏈或編碼含S2C6重鏈可變區(qū)的分子的核酸(例如質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染入表達(dá)抗體輕鏈或含抗體輕鏈的分子的細(xì)胞中，用于表達(dá)多聚體蛋白；所述抗體輕鏈可以是重組體或非重組體，并可以具有或不具有抗-CD40特異性?；蛘?，可任選在互補(bǔ)輕鏈或輕鏈可變區(qū)不存在的情況下，表達(dá)和使用S2C6重鏈或含其可變區(qū)或其CDR的分子。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有CD40結(jié)合親和性的S2C6重鏈或一種分子(其含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的重鏈CDR 8、9和/或10或由其組成)或一種蛋白(肽或多肽)，所述蛋白的序列含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的CDR 8、9和/或10或由其組成。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這種蛋白可以通過(guò)例如C末端酰胺化或N末端乙酰化對(duì)N或C末端進(jìn)行修飾。
另外，可使用通過(guò)將合適抗原特異性的小鼠抗體分子基因與合適生物活性的人抗體分子基因剪接在一起開(kāi)發(fā)的用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312，604-608；Takeda等，1985，Nature314，452-454)。嵌合抗體是一種其中不同的部分得自不同的動(dòng)物物種的分子，例如具有鼠類單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。(參閱例如美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；以及Boss等，美國(guó)專利第5,816,397號(hào))。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述嵌合抗體包含由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6的可變區(qū)和人恒定區(qū)。在具體的實(shí)施方案中，所述嵌合抗體的可變區(qū)含有示于圖3A的S2C6 VL(SEQ ID NO2)和/或示于圖3B的S2C6 VH(SEQ ID NO7)。
另外，已開(kāi)發(fā)了產(chǎn)生人源化抗體的技術(shù)。(參閱例如Queen，美國(guó)專利第5,585,089號(hào)和Winter，美國(guó)專利第5,225,539號(hào))。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由被三個(gè)高變區(qū)間隔的“構(gòu)架”區(qū)組成，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。已精確定義了構(gòu)架區(qū)和CDR的范圍(參閱“目的免疫球蛋白的序列”，Kabat，E.等，美國(guó)公共醫(yī)療衛(wèi)生與人類健康部(1983))。簡(jiǎn)而言之，人源化抗體是得自具有一個(gè)或多個(gè)人類以外物種的CDR和人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)的人類以外物種的抗體分子。
本發(fā)明包括含重鏈或輕鏈可變區(qū)的抗體或其衍生物，所述可變區(qū)包含(a)一組三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，其中所述CDR組來(lái)自單克隆抗體S2C6，和(b)一組四個(gè)構(gòu)架區(qū)，其中所述構(gòu)架區(qū)組與單克隆抗體S2C6中的構(gòu)架區(qū)組不同，并且其中所述抗體或其衍生物免疫特異性地結(jié)合CD40。所述構(gòu)架區(qū)組最好是得自人單克隆抗體，例如不結(jié)合CD40的人單克隆抗體。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含輕鏈可變區(qū)的抗體或其衍生物，所述可變區(qū)包含(a)一組三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，其中所述CDR組包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO4，和(b)一組四個(gè)構(gòu)架區(qū)，其中所述構(gòu)架區(qū)組與單克隆抗體S2C6中的輕鏈構(gòu)架區(qū)組不同，并且其中所述抗體或其衍生物免疫特異性地結(jié)合CD40。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含重鏈可變區(qū)的抗體或其衍生物，所述可變區(qū)包含(a)一組三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，其中所述CDR組包含SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，和(b)一組四個(gè)構(gòu)架區(qū)，其中所述構(gòu)架區(qū)組與單克隆抗體S2C6的重鏈中的構(gòu)架區(qū)組不同，并且其中所述抗體或其衍生物免疫特異性結(jié)合CD40。
或者，可采用所描述的用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利第4,946,778號(hào)；Bird，1988，Science 242，423-426；Huston等，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883；和Ward等，1989，Nature 334，544-546)，使用S2C6序列產(chǎn)生單鏈抗體。通過(guò)經(jīng)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段形成單鏈抗體，產(chǎn)生單鏈多肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述單鏈抗體包含示于圖3A和圖3B的氨基酸序列(分別為SEQ ID NOS2和7)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO6的全部或部分的抗CD40抗體、多肽、肽或其它衍生物或其類似物是一種雙特異性抗體(一般參見(jiàn)例如Fanger和Drakeman，1995，DrugNews and Perspectives 8133-137)。對(duì)這樣的雙特異性抗體進(jìn)行基因工程改造，以便識(shí)別(1)表位和(2)眾多“觸發(fā)”分子中的一種，例如骨髓細(xì)胞上的Fc受體和T細(xì)胞上的CD3和CD2，它們已被鑒定為能夠使細(xì)胞毒性T細(xì)胞破壞特定靶?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)接合、雜交瘤或技術(shù)人員已知的重組分子生物學(xué)技術(shù)制備這種雙功能抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述雙功能抗體包含的分子含有S2C6重鏈或輕鏈可變區(qū)或其CDR序列，所述分子具有抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)，但不同于天然S2C6重鏈或輕鏈(例如在構(gòu)架區(qū)或人恒定區(qū)中具有氨基酸取代)。
可通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生保留識(shí)別CD40能力的抗體片段。例如，這樣的片段包括但不限于可通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段以及可通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的F(ab′)片段?；蛘?，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989，Science 2461275-1281)，以允許快速且容易地鑒定具有所需的特異性的單克隆Fab片段。
5.7 S2C6蛋白、衍生物和類似物除了在以上5.6單元描述的那些抗體分子/變異體以外，本發(fā)明還涉及S2C6蛋白、衍生物(包括但不限于片段)、類似物和S2C6蛋白分子。還提供編碼S2C6蛋白衍生物和S2C6蛋白類似物的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，S2C6蛋白由上文5.1單元描述的核酸所編碼。在具體的方面，所述蛋白、衍生物或類似物由SEQ ID NO1或SEQID NO6的序列所編碼。
與S2C6蛋白相關(guān)的衍生物和類似物的生產(chǎn)和應(yīng)用屬于本發(fā)明的范圍。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述衍生物和類似物具有功能活性，即能夠表現(xiàn)出一種或多種與全長(zhǎng)S2C6蛋白相關(guān)的功能活性。作為一個(gè)實(shí)施例，可在免疫測(cè)定或治療性抑制腫瘤生長(zhǎng)等中應(yīng)用這樣的具有所需結(jié)合特異性的衍生物或類似物。一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及結(jié)合CD40并增強(qiáng)CD40L與CD40結(jié)合的S2C6蛋白片段。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種免疫測(cè)定檢測(cè)S2C6蛋白的衍生物或類似物的所需活性，所述免疫測(cè)定包括但不限于使用以下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)諸如放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、“夾心”免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光測(cè)定、A蛋白測(cè)定、免疫電泳測(cè)定等。
另外，可使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定檢測(cè)或測(cè)定體內(nèi)或體外抑制細(xì)胞增殖(例如抑制腫瘤生長(zhǎng))的能力或刺激細(xì)胞增殖(例如B細(xì)胞增殖)的能力。
具體而言，可通過(guò)提供功能等同分子的取代、添加(例如插入)或缺失改變S2C6序列，制備S2C6衍生物。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，所以編碼與S2C6基因大致相同的氨基酸序列的其它DNA序列可用于本發(fā)明的實(shí)踐。這些DNA序列包括但不限于包含S2C6基因的全部或部分的核苷酸序列，它們是通過(guò)編碼序列中功能等同氨基酸殘基的不同密碼子的取代，由此產(chǎn)生沉默變化而得到改變。同樣地，本發(fā)明的S2C6衍生物包括但不限于包含為初級(jí)氨基酸序列的S2C6蛋白的全部或部分氨基酸序列的那些物質(zhì)，包括其中功能等同氨基酸殘基取代所述序列的殘基導(dǎo)致沉默變化的改變序列。例如，所述序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可被另一個(gè)起功能等價(jià)作用的相似極性氨基酸取代，產(chǎn)生沉默改變。所述序列中的氨基酸取代可選自所述氨基酸所屬類型的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這類取代通常被理解為保守取代。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供由S2C6蛋白片段組成或包含S2C6蛋白片段的蛋白，其中所述S2C6蛋白片段由S2C6蛋白的至少10個(gè)(連續(xù)的)氨基酸組成。在其它實(shí)施方案中，所述片段由S2C6蛋白的至少20個(gè)或至少50個(gè)氨基酸組成。在具體的實(shí)施方案中，這種片段不長(zhǎng)于50、75、100或200個(gè)氨基酸。S2C6蛋白的衍生物或類似物包括但不限于那些含有與S2C6蛋白或其片段大致同源(例如在各種實(shí)施方案中，在沒(méi)有插入或缺失的相同大小的氨基酸序列上的同一性至少為60％或70％或80％或90％或95％，或與通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序進(jìn)行序列對(duì)比的對(duì)比序列相比較，同一性至少為60％或70％或80％或90％或95％)的區(qū)的分子，或者其編碼核酸能夠在高、中或低嚴(yán)格條件下與編碼S2C6基因序列雜交的分子。
具體而言，用于測(cè)定同源性的計(jì)算機(jī)程序?qū)嵗ǖ幌抻赥BLASTN、BLASTP、FASTA、TEASTA和CLUSTALW (Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-8；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-10；Thompson等，1994，Nucleic.Acids.Res.22(22)4673-80；Higgins等，1996，Methods Enzymol 266383-402；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-10)。這些計(jì)算機(jī)程序中的每一種程序的默認(rèn)參數(shù)均為熟知的，并可加以利用。
具體而言，基本局部序列對(duì)比檢索工具(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，J.of Molec.Biol.215403-410，“BLAST算法；Altschul等，1997，Nuc.Acids.Res.253389-3402)是一種專門用于檢索序列相似性的啟發(fā)性檢索算法，該算法可歸結(jié)于使用Karlin和Altschul等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68；1993，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，905873-77的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的顯著性。使用五種特定的BLAST程序執(zhí)行以下的任務(wù)1)BLASTP程序比較氨基酸查詢(query)序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)；2)BLASTN程序比較核苷酸查詢序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)；3)BLASTX程序比較核苷酸查詢序列(雙鏈)的6-讀框(frame)概念翻譯產(chǎn)物與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)；4)TBLASTN程序比較蛋白查詢序列與在全部6個(gè)讀框中翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(雙鏈)；5)TBLASTX程序比較核苷酸查詢序列的6-讀框翻譯產(chǎn)物與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的6-讀框翻譯產(chǎn)物。
Smith-Waterman(數(shù)據(jù)庫(kù)歐洲生物信息研究所wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/)(Smith-Waterman，1981，J.of Molec.Biol.，147195-197)是一種用于序列對(duì)比的數(shù)學(xué)上嚴(yán)密的算法。
FASTA(參見(jiàn)Pearson等，1988，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，852444-2448)是一種近似于Smith-Waterman算法的啟發(fā)性算法。關(guān)于BLAST、Smith-Waterman和FASTA算法的的步驟和優(yōu)勢(shì)的一般性論述，參見(jiàn)Nicholas等，1998，“序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索指南和序列記分方法”(www.psc.edu)及其中引用的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的S2C6衍生物和類似物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生?？稍诨蚧虻鞍姿缴线M(jìn)行導(dǎo)致其產(chǎn)生的操作。例如，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的眾多策略中的任一種，修飾克隆的S2C6基因序列(Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)?？捎孟拗菩詢?nèi)切核酸酶在合適的位點(diǎn)切割所述序列，接著如果需要的話進(jìn)一步進(jìn)行酶修飾、分離并體外連接。在產(chǎn)生編碼S2C6蛋白衍生物或類似物的修飾基因時(shí)，應(yīng)小心確保所述修飾基因保留在與天然蛋白相同的翻譯讀框中，而不致于在編碼所需的S2C6蛋白活性的基因區(qū)中被翻譯終止信號(hào)間斷。
另外，S2C6核酸序列可在體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯序列、起始序列和/或終止序列，或在編碼區(qū)產(chǎn)生變異和/或形成新的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或破壞預(yù)先存在的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，以易于進(jìn)一步的體外修飾。可以使用任一種本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)，包括但不限于化學(xué)誘變、體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem.2536551)、使用含有誘變的引物的PCR等。
還可以在蛋白水平上操作S2C6蛋白序列。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的S2C6蛋白片段或其它衍生物或類似物在翻譯過(guò)程中或在翻譯后被分別修飾，例如通過(guò)糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、利用已知的保護(hù)基/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白酶剪切、連接至抗體分子或其它細(xì)胞配體等?？赏ㄟ^(guò)已知技術(shù)進(jìn)行眾多化學(xué)修飾中的任一種，包括但不限于利用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4進(jìn)行特異性化學(xué)切割、乙?；?、甲?；?、氧化、還原、在衣霉素存在下的代謝合成等。
另外，可化學(xué)合成S2C6蛋白的類似物和衍生物。例如，可使用肽合成儀合成對(duì)應(yīng)于一部分、含有所需的結(jié)構(gòu)域或在體外介導(dǎo)所需的活性的S2C6蛋白的肽。而且，如果需要的話，可將非典型氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物以取代或添加引入到S2C6序列中。非典型氨基酸包括但不限于一般氨基酸的D-異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、designer氨基酸(諸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)和一般的氨基酸類似物。而且，所述氨基酸可以是D(右旋)氨基酸或L(左旋)氨基酸。
在其它的具體實(shí)施方案中，S2C6蛋白、片段、類似物或衍生物可作為融合或嵌合蛋白產(chǎn)物(包含通過(guò)肽鍵連接不同蛋白的異源蛋白序列的所述蛋白、片段、類似物或衍生物)表達(dá)。所述異源蛋白序列可含有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，包括但不限于α干擾素、γ干擾素、白介素-2、白介素-4、白介素-6和腫瘤壞死因子或其功能活性部分?；蛘?，所述異源蛋白序列可包含酶(如β-內(nèi)酰胺酶或羧酸酯酶)或毒素(如bryodin1、假單胞菌外毒素A或gelonin)或其功能活性部分?；蛘?，S2C6蛋白可與化療劑化學(xué)連接，所述化療劑包括但不限于烷化劑(例如氮芥、亞硝基脲、三氮烯)；抗代謝物(例如葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似劑)；天然產(chǎn)物(例如抗生素、酶、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物)；其它物質(zhì)(例如取代的脲、鉑配位復(fù)合物)；以及激素和拮抗劑(例如雌激素、雄激素、抗雄激素、促性腺素釋放激素類似物)；或其功能活性部分(參見(jiàn)例如Goodman和Gilman，治療的藥理基礎(chǔ)，第九板，McGraw-Hill，第1225-1287頁(yè)，1996)。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，將編碼所需的氨基酸序列的合適核酸序列在正確的編碼框內(nèi)互相連接，并通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的方法表達(dá)所述嵌合產(chǎn)物，從而制備這樣的嵌合產(chǎn)物?；蛘?，可通過(guò)蛋白合成技術(shù)(例如使用肽合成儀)制備這樣的嵌合產(chǎn)物。在不同的實(shí)施方案中，異源蛋白序列可通過(guò)非肽鍵(例如使用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)交聯(lián)劑)與S2C6相關(guān)序列共價(jià)結(jié)合。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，S2C6蛋白衍生物是一種含有S2C6蛋白或其片段(優(yōu)選由S2C6蛋白的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域或基序組成，或由S2C6蛋白的至少10、50或100個(gè)氨基酸組成)的嵌合或融合蛋白，其中所述S2C6蛋白或其片段在其氨基末端或羧基末端通過(guò)肽鍵連接至不同蛋白的氨基酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述不同蛋白是毒素、酶或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
在具體的實(shí)施方案中，所述不同蛋白的氨基酸序列為所述不同蛋白的至少6、10、20或30個(gè)連續(xù)的氨基酸或所述不同蛋白的功能活性部分，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)重組表達(dá)編碼所述蛋白(包含在讀框內(nèi)連接至不同蛋白的編碼序列的S2C6編碼序列)的核酸產(chǎn)生這樣的嵌合蛋白?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法，將編碼所需的氨基酸序列的合適核酸序列在正確的編碼框內(nèi)互相連接，并通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的方法表達(dá)所述嵌合產(chǎn)物，從而制備這樣的嵌合產(chǎn)物。或者，可通過(guò)蛋白合成技術(shù)(例如使用肽合成儀)制備這樣的嵌合產(chǎn)物?？蓸?gòu)建含有融合至任何異源蛋白編碼序列的S2C6基因部分的嵌合基因。一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及的嵌合蛋白含有的S2C6蛋白片段至少為6或15或50個(gè)氨基酸，或具有S2C6蛋白的一種或多種功能活性(例如包含一個(gè)或多個(gè)CDR的拷貝)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，S2C6蛋白或其衍生物化學(xué)連接至化療藥物(包括但不限于阿霉素、紫杉醇或docetaxel)。這種S2C6-藥物結(jié)合體可將所述藥物傳遞至表達(dá)CD40的細(xì)胞。S2C6蛋白或衍生物可連接一種或多種藥物分子。連接包括但不限于腙、肽或糖連接。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述衍生物是一種含有與S2C6蛋白同源的區(qū)的分子。作為實(shí)施例，在各種實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)蛋白區(qū)的氨基酸序列(沒(méi)有任何插入或缺失)與第二個(gè)蛋白區(qū)(其含有的氨基酸數(shù)目與所述第一個(gè)區(qū)中含有的氨基酸數(shù)目相等)的任何序列相比至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同，或當(dāng)?shù)谝粋€(gè)蛋白區(qū)的氨基酸序列與第二個(gè)區(qū)的已通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序進(jìn)行比較的對(duì)比序列相比至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同時(shí)，則可認(rèn)為所述第一個(gè)蛋白區(qū)與所述第二個(gè)蛋白區(qū)同源。
5.8雜交條件在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供在低嚴(yán)格條件下與S2C6核酸(例如具有SEQ ID NOS1或6所提供的序列)或其反向互補(bǔ)物或者編碼S2C6衍生物的核酸或其反向互補(bǔ)物雜交的核酸。作為非限制性實(shí)例，以下為使用這類低嚴(yán)格條件的方法(也參見(jiàn)Shilo合Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6789-6792)。于40℃在含35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml變性鮭精DNA的溶液中預(yù)處理含DNA的濾器6小時(shí)。在具有以下改變的相同溶液中進(jìn)行雜交0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鮭精DNA、10％(重量/體積)硫酸葡聚糖，并使用5-20×106cpm32P標(biāo)記的探針。濾器于40℃在雜交混合物中溫育18-20小時(shí)，然后于55℃在含2X SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中漂洗1.5小時(shí)。用新鮮溶液替換漂洗溶液，并于60℃再溫育1.5小時(shí)。吸干濾器并進(jìn)行放射自顯影曝光。如果必要，于65-68℃第三次清洗濾器并對(duì)膠片重新曝光?？梢允褂玫钠渌蛧?yán)格條件是本領(lǐng)域眾所周知的(例如采用種間雜交)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供在高嚴(yán)格條件下與S2C6核酸(例如具有SEQ ID NOS1或6所提供的序列)或其反向互補(bǔ)物或者編碼S2C6衍生物的核酸或其反向互補(bǔ)物雜交的核酸。作為非限制性實(shí)例，以下為使用這類高嚴(yán)格條件的方法。于65℃在由6X SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml變性鮭精DNA組成的緩沖液中預(yù)雜交含DNA的濾器8小時(shí)至過(guò)夜。于65℃使濾器在含100μg/ml變性鮭精DNA和5-20×106cpm32P標(biāo)記的探針的預(yù)雜交混合物中雜交48小時(shí)。于37℃在含2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中漂洗濾器1小時(shí)。接著于50℃在0.1X SSC中漂洗45分鐘，然后放射自顯影。可以使用的其它高嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域眾所周知的。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供在中等嚴(yán)格條件下與S2C6核酸(例如具有SEQ ID NOS1或6所提供的序列)或其反向互補(bǔ)物或者編碼S2C6衍生物的核酸或其反向互補(bǔ)物雜交的核酸。對(duì)合適的中等嚴(yán)格條件的選擇是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)例如Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring HarborNew York；還參見(jiàn)Ausubel等編輯，載于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)分子生物學(xué)系列現(xiàn)時(shí)方案，1987-1997Current Protocols，1994-1997 John Wiley and Sons，Inc.)。
5.9治療應(yīng)用本發(fā)明通過(guò)給予治療性化合物(本文稱為“治療劑”)提供對(duì)各種疾病或紊亂的治療和預(yù)防。這樣的治療劑包括但不限于S2C6抗體及其衍生物(例如上文所述)；以及編碼這種S2C6抗體及其衍生物的核酸(例如上文所述)。本文使用的“治療”實(shí)際上應(yīng)包括任何對(duì)所述疾病或紊亂有臨床需要或有益的作用，包括但不限于緩解一種或多種癥狀、抑制、減緩或終止惡化等。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述治療劑或單獨(dú)給予或與CD40L一起給予，以治療或預(yù)防惡性腫瘤(包括但不限于癌和血癌)、炎性疾病以及免疫系統(tǒng)疾病。所述治療劑和CD40L可以(但不是必須)包含在同一制劑中，即所述治療劑和CD40可分別給予，但也可同時(shí)給予或在同一治療過(guò)程中給予。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述惡性細(xì)胞表達(dá)CD40?；蛘撸鰫盒约?xì)胞不必表達(dá)CD40，因?yàn)榕c惡性腫瘤相連的脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)表達(dá)CD40，因此本發(fā)明的治療劑甚至對(duì)不表達(dá)CD40的腫瘤也能提供治療功效。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療劑使CD40L與CD40的結(jié)合增強(qiáng)至少45％、50％、60或65％。
在具體的實(shí)施方案中，所述治療劑用于增強(qiáng)免疫受抑制的個(gè)體(如罹患獲得性免疫缺陷綜合征、惡性腫瘤的人或嬰兒或老年人)的免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，所述治療劑可進(jìn)行化學(xué)修飾，以便殺死其結(jié)合的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括但不限于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。因?yàn)樗械腂細(xì)胞都表達(dá)CD40，所以該方法可對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制。例如，為了越過(guò)移植患者的組織相容性屏障，可使用連接S2C6序列的細(xì)胞毒性藥物(例如融合蛋白)，以在體內(nèi)引起免疫抑制；或者可使用這些修飾的配體控制自身免疫性疾病。
在其它的實(shí)施方案中，所述治療劑可用于促進(jìn)非B細(xì)胞的攜帶CD40的細(xì)胞(例如肺癌細(xì)胞)的增殖和/或分化，作為直接治療惡性腫瘤的工具或作為化療輔助劑。
可使用本發(fā)明的治療劑治療或預(yù)防的惡性腫瘤包括但不限于表1中的那些惡性腫瘤表1惡性腫瘤和相關(guān)疾病白血病急性白血病急性淋巴細(xì)胞白血病急性骨髓細(xì)胞白血病急性成髓細(xì)胞白血病急性前髓細(xì)胞白血病急性骨髓單核細(xì)胞白血病急性單核細(xì)胞白血病急性紅白血病慢性白血病慢性骨髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病慢性淋巴細(xì)胞白血病脾大性紅細(xì)胞增多淋巴瘤何杰金氏病非何杰金氏病多發(fā)性骨髓瘤Waldenstrm氏巨球蛋白血癥重鏈疾病實(shí)體瘤肉瘤和癌癥纖維肉瘤粘液肉瘤脂肪肉瘤軟骨肉瘤骨原性肉瘤骨肉瘤脊索瘤血管肉瘤內(nèi)皮肉瘤淋巴管肉瘤淋巴管內(nèi)皮肉瘤滑膜瘤間皮瘤Ewing氏瘤平滑肌肉瘤橫紋肌肉瘤結(jié)腸癌結(jié)腸直腸癌胰腺癌乳癌卵巢癌前列腺癌鱗狀細(xì)胞癌基細(xì)胞癌腺癌汗腺癌皮脂腺癌乳頭狀癌乳頭狀腺癌囊腺癌髓樣癌支氣管原性癌腎細(xì)胞癌肝細(xì)胞瘤膽管癌絨膜癌精原細(xì)胞瘤胚胎癌Wilms氏腫瘤頸癌子宮癌睪丸癌肺癌小細(xì)胞肺癌非小細(xì)胞肺癌膀胱癌上皮細(xì)胞癌神經(jīng)膠質(zhì)瘤星細(xì)胞瘤成神經(jīng)管細(xì)胞瘤顱咽管瘤室管膜細(xì)胞瘤松果體瘤成血管細(xì)胞瘤聽(tīng)神經(jīng)瘤寡枝神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤腦膜瘤(menangioma)黑素瘤成神經(jīng)細(xì)胞瘤眼癌鼻咽癌食道癌可使用本發(fā)明的治療劑治療或預(yù)防的炎性疾病和免疫系統(tǒng)缺陷或疾病包括但不限于在表2中的那些病癥表2炎性疾病和免疫系統(tǒng)疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)硬皮病(例如CRST綜合征)炎癥性肌炎
Sjgren氏綜合征(SS)混合性結(jié)締組織疾病(例如MCTD、Sharp綜合征)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化炎性腸道疾病(例如潰瘍性結(jié)腸炎、節(jié)段性結(jié)腸炎)急性呼吸窘迫綜合征肺炎骨質(zhì)疏松癥遲發(fā)型過(guò)敏癥哮喘夏科氏肝硬變(PBC)自發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)5.9.1有效劑量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測(cè)定所述治療劑在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物中的毒性和治療功效，例如測(cè)定LD50(使50％的群體致死的劑量)和ED50(在50％的群體中治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比率為治療指數(shù)，它可以表示為L(zhǎng)D50/ED50比率。優(yōu)選具有大治療指數(shù)的治療劑。盡管可以使用具有毒性副作用的治療劑，但應(yīng)小心設(shè)計(jì)將所述化合物靶向受累組織部位的傳遞系統(tǒng)，以使對(duì)未感染細(xì)胞的潛在傷害最小，并因此減少副作用。
在配制人類使用的劑量范圍時(shí)，可使用由細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究所獲得的數(shù)據(jù)。典型劑量包括但不限于1ng/kg至100mg/kg。所述治療劑的劑量?jī)?yōu)選位于包括幾乎無(wú)毒或無(wú)毒的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可根據(jù)使用的劑型和利用的給藥途徑而在此范圍內(nèi)有所變化。對(duì)于一種治療劑，最好先由細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定評(píng)價(jià)治療有效劑量?？膳渲埔环N劑量，以在動(dòng)物模型中達(dá)到循環(huán)血漿濃度范圍，包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(即達(dá)到對(duì)綜合征最大抑制一半時(shí)的測(cè)試化合物濃度)?？墒褂眠@種信息，以更精確地測(cè)定在人類中有用的劑量。例如可通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)在血漿中的水平。
5.9.2 配制可以常規(guī)方式，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑，配制按照本發(fā)明使用的藥用組合物。
因此，可配制所述治療劑及其生理學(xué)上可接受的鹽和溶劑化物，以通過(guò)吸入或吹入(或通過(guò)嘴或通過(guò)鼻)給藥或口服、口腔含化、胃腸外或直腸給藥。
對(duì)于口服給藥，所述藥用組合物可采用例如通過(guò)常規(guī)方法利用藥學(xué)上可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊劑劑型，其中所述賦形劑有例如粘合劑(例如預(yù)凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可通過(guò)本領(lǐng)域廣為人知的方法進(jìn)行包衣?？诜囊后w制劑可采用的劑型例如為溶液劑、糖漿劑或懸浮劑，或者它們可作為在使用前用水或其它合適溶媒稀釋的干燥產(chǎn)品存在。這樣的液體制劑可通過(guò)常規(guī)方法，用藥學(xué)上可接受的添加劑制備，其中所述添加劑例如為懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水溶性載體(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制劑在合適時(shí)還可以含有緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。
可適當(dāng)?shù)嘏渲瓶诜o藥制劑，以獲得控釋的活性化合物。
對(duì)于口腔含化給藥，所述組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑劑型。
對(duì)于吸入給藥，按照本發(fā)明使用的所述治療劑通常以由加壓填充器或噴霧器使用合適的拋射劑提供的氣溶膠噴霧劑形式傳遞，所述拋射劑例如為二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過(guò)提供一種計(jì)量的量傳遞的閥確定劑量單位。用于吸入劑或吹入劑的膠囊和藥筒(例如明膠)，可配制成含有所述化合物的粉末混合物和一種合適的粉末基，諸如乳糖或淀粉。
所述治療劑可配制為通過(guò)注射胃腸外給予，例如通過(guò)大劑量注射或連續(xù)輸注。注射制劑可以是有或沒(méi)有添加的防腐劑的單位劑型(例如在安瓿或多劑量容器中)。所述組合物可采用諸如在油性或水性溶媒中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并可以含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸龌钚猿煞挚梢詾樵谑褂们坝煤线m溶媒(例如滅菌無(wú)熱源水)配制的粉末形式。
所述治療劑還可以被配制為直腸組合物，諸如栓劑或保留灌腸劑，例如含常規(guī)栓劑基質(zhì)(如可可酯或其它甘油酯)的組合物。
除了先前描述的制劑以外，所述治療劑還可以被配制為包埋長(zhǎng)效(depot)制劑。這種長(zhǎng)效制劑可通過(guò)植入(例如皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射給藥。因此，例如所述治療劑可用合適的聚合物或疏水性物質(zhì)(例如在可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂配制，或配制為微溶衍生物，例如微溶鹽。
如果需要的話，所述組合物可存在于包裝或分散裝置中，所述裝置可含有一種或多種含所述活性成分的單位劑型。所述包裝例如可包括金屬或塑料薄片，諸如泡罩包裝。所述包裝或分散裝置可附帶有優(yōu)選給予人的給藥說(shuō)明。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含治療有效量的治療劑與CD40配體的藥用組合物。
在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例決不是限制本發(fā)明的范圍。
6.實(shí)施例克隆S2C6可變區(qū)
6.1材料與方法使用基本如Gilliland等，1996，Tissue Antigens 471-20所述的方法，克隆S2C6輕鏈和重鏈可變區(qū)。由S2C6雜交瘤分離總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶和退火JC接點(diǎn)(junction)下游大約100個(gè)堿基對(duì)的反義引物，制備小鼠κ輕鏈和重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)DNA(cDNA)第一鏈。使用末端轉(zhuǎn)移酶將聚鳥苷酸尾(poly-G tail)加入到所述cDNA鏈中，然后使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成雙鏈DNA。設(shè)計(jì)對(duì)所述聚鳥苷酸尾或輕鏈或重鏈cDNA內(nèi)部約50個(gè)堿基的序列特異性的PCR引物，使之能包括獨(dú)特限制酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增后，將用EcoRI和HindIII消化的PCR產(chǎn)物克隆入已用相同限制酶消化的pUC19中。連接這些反應(yīng)物，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并通過(guò)限制酶切分析篩選獲得的克隆。通過(guò)在Li-Cor熒光測(cè)序儀上進(jìn)行DNA測(cè)序，對(duì)限制酶消化分析為陽(yáng)性的克隆測(cè)序。在圖1中顯示了輕鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸序列(SEQ IDNO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在圖2中顯示了重鏈可變區(qū)(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO6)和氨基酸序列(SEQ ID NO7)。圖3A-3B圖解顯示了S2C6 VL和S2C6 VH的氨基酸序列(分別為圖3A和3B)。CDR標(biāo)出下劃線。VLCDR 1-3的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ IDNOS3-5。VHCDR 1-3的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOS8-10。
然后比較獲得的DNA序列與相同同種型的其它鼠抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，并測(cè)定分離自S2C6的基因的讀框和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。為證實(shí)所述氨基酸序列，對(duì)S2C6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)進(jìn)行N-末端氨基酸分析。
1999年4月21日提交S2C6 VL、S2C6 VH以及VL和VH二者CDR的氨基酸序列，使用NR數(shù)據(jù)庫(kù)(全部非豐余GenBank CDS翻譯物+PDB+SwissProt+PIR+PRF)和Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(Kabat的有關(guān)免疫球蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行BLASTP檢索。在http∥www.ncbi.nlm.nih.gov使用登錄號(hào)可獲取使用NR數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)的序列。在http∥immuno.bme.nwu.edu/database_.html和SEQHUNT II使用登錄號(hào)可獲取使用Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)的序列。這些檢索結(jié)果如下所示使用NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索S2C6 VL(SEQ ID NO2)用S2C6 VL作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在100％同一性時(shí)未得到命中序列，而在94％(106/112)同一性時(shí)獲得6個(gè)命中序列。這6個(gè)序列示于以下pir||PT0359 IgGκ鏈V區(qū)(R4A.12)-小鼠(片段)gi|196660(M59949)免疫球蛋白κ鏈VJ區(qū)[鼠類肌肉]gi|196954(M12183)κ鏈V區(qū)[鼠類肌肉]＞gi|2247[鼠類肌肉]pir||B34904 Igκ鏈前體V區(qū)(12-40和5-14)…emb|CAA80076|(Z22102)免疫球蛋白可變區(qū)[鼠類肌肉]dbj|BAA22172|(AB006833)抗假尿苷單克隆抗體…VL CDR1(SEQ ID NO3)用VL CDR1作為查詢序列進(jìn)行BLASTP檢索，在100％同一性時(shí)未得到命中序列，而在93％(15/16)同一性時(shí)獲得無(wú)數(shù)命中序列。其中前5個(gè)序列示于以下dbj|BAA03480|(D14627)免疫球蛋白γ-3κ鏈[鼠類肌肉]dbj|BAA22172|(AB006833)抗假尿苷單克隆抗體…gi|4101647(AF005352)免疫球蛋白V區(qū)輕鏈[鼠類肌肉]gi|3377681(AF078800)單鏈抗HIV-1Rev可變區(qū)片段gi|1870366(U55625)抗DNA免疫球蛋白輕鏈IgM[鼠類肌肉]VL CDR2(SEQ ID NO4)用VL CDR2作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
VL CDR3(SEQ ID NO5)用VL CDR3作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
S2C6 VH(SEQ ID NO7)用S2C6 VH作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在100％同一性時(shí)未得到命中序列，而在最多可至88％同一性時(shí)獲得無(wú)數(shù)命中序列，其中的前5個(gè)序列示于以下gi|3561044(AF083186)抗HIV-1p24抗體D2重鏈[鼠類肌肉]pdb|1A6T|B鏈B，Mab1-Ia單克隆抗體的Fab片段gi|2895955(AF045895)IgG1重鏈mAB1-IA[鼠類肌肉]emb|CAA80023|(Z22049)免疫球蛋白可變區(qū)[鼠類肌肉]gi|194510(M91695)免疫球蛋白γ-1鏈[鼠類肌肉]VH CDR1(SEQ ID NO8)用VH CDR1作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
VH CDR2(SEQ ID NO9)用VH CDR2作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在100％同一性時(shí)未得到命中序列，在94％(16/17)同一性時(shí)獲得1個(gè)命中序列，而在低于94％的同一性時(shí)得到無(wú)數(shù)個(gè)命中序列。94％同一性時(shí)獲得的1個(gè)命中序列如下所示gi|3561044(AF083186)抗HIV-1p24抗體D2重鏈[鼠類肌肉]VH CDR3(SEQ ID NO10)用VH CDR3作為查詢序列對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
使用KABAT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索S2C6 VL(SEQ ID NO2)用S2C6 VL作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在100％同一率時(shí)未得到命中序列，而在89-91％同一率時(shí)獲得無(wú)數(shù)個(gè)命中序列。前5個(gè)序列示于以下KADBID 005591，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(5-14...)，
KADBID 005594，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(10VA...)，KADBID 005593，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(12-4...)，KADBID 005603，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(17s...)，KADBID 005588，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(TEPC...)。
VL CDR1(SEQ ID NO3)用VL CDR1作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在100％同一率時(shí)未得到命中序列，而在93％(15/16)同一率時(shí)獲得無(wú)數(shù)命中序列。前5個(gè)序列示于以下KADBID 005720，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(BW24...)，KADBID 005614，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(PME7...)，KADBID 005624，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(C5-7...)，KADBID 005621，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(40-6...)，KADBID 005640，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(40-9...)。
VL CDR2(SEQ ID NO4)用VL CDR2作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
VL CDR3(SEQ ID NO5)用VL CDR3作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在與所述查詢序列的同一性為100％時(shí)得到1個(gè)命中序列KADBID 005681，小鼠IGκ輕鏈可變區(qū)(NC10...)。
S2C6 VH(SEQ ID NO7)用S2C6 VH作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在與所述查詢序列的同一性為100％時(shí)未得到命中序列，而在與所述查詢序列的同一性為79-85％時(shí)獲得無(wú)數(shù)命中序列。前5個(gè)命中序列示于以下KADBID 001498，小鼠IG重鏈可變區(qū)(HDEX24)，KADBID 001494，小鼠IG重鏈可變區(qū)(HDEX5)，
KADBID 001529，小鼠IG重鏈可變區(qū)(163.72′CL)，KADBID 001500，小鼠IG重鏈可變區(qū)(HDEX 37)，KADBID 001597，小鼠IG重鏈可變區(qū)(BB128′CL)。
VH CDR1(SEQ ID NO8)用VH CDR1作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
VH CDR2(SEQ ID NO9)用VH CDR作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，在與所述查詢序列的同一率為100％時(shí)未得到命中序列，而在與所述查詢序列的同一率為87-88％時(shí)獲得10個(gè)命中序列。前5個(gè)命中序列如下所示KADBID 001535，小鼠IG重鏈可變區(qū)(H10″CL)，KADBID 001534，小鼠IG重鏈可變區(qū)(H81′CL)，KADBID 001533，小鼠IG重鏈可變區(qū)(H50′CL)，KADBID 019741，小鼠IG重鏈可變區(qū)(克隆F′CL)，KADBID 001529，小鼠IG重鏈可變區(qū)(163.72′CL)。
VH CDR3(SEQ ID NO10)用VH CDR3作為查詢序列對(duì)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP檢索，未得到命中序列。
7.實(shí)施例S2C6的生物活性7.1材料與方法7.1.1抗-CD40抗體的制備于37℃在含10％胎牛血清(FBS)、100單位/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的完全I(xiàn)MDM(Gibco-BRL，Grand Island，NY)中培養(yǎng)S2C6雜交瘤。通過(guò)離心收獲培養(yǎng)物，并通過(guò)使用0.2μm濾膜過(guò)濾收集上清液。隨后將所述上清液上GammaBindTMSepharose柱(Pierce)，用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌，并用0.1M甘氨酸pH2.5洗脫。在洗脫后立即用1M Tris pH8.0中和抗體，透析到PBS中，并除菌過(guò)濾。通過(guò)大小排阻層析分析單克隆抗體制品。在本文所述的研究中只使用單體蛋白超過(guò)99％的樣品。
7.1.2人腫瘤異種移植模型得到90只6-8周齡的雌性C.B.-17 SCID小鼠(Taconic Labs，Germantown，NY)，并隔離檢疫2周。對(duì)照組小鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射人B細(xì)胞腫瘤系Ramos(非何杰金氏淋巴瘤)細(xì)胞、HS Sultan(多發(fā)性骨髓瘤)細(xì)胞或IM-9(多發(fā)性骨髓瘤)細(xì)胞(1×106-2×106細(xì)胞)。余下的小鼠被分為兩組；一半在注射腫瘤細(xì)胞前1天靜脈注射200μl 1∶10稀釋的抗-脫唾液酸-GM1(Wako Chemicals，Richmond，VA)，以去除宿主天然殺傷細(xì)胞(Murphy等，1992，Eur.J.Immunol.22241)。兩組小鼠靜脈注射Ramos細(xì)胞、HS Sultan細(xì)胞或IM-9細(xì)胞(1×106-2×106細(xì)胞)。然后由腫瘤移植后第1天或第5天開(kāi)始，按照以下的時(shí)間表對(duì)測(cè)試組小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射1mg/kg的如7.1.2單元中所述制備的S2C6 IgG，并監(jiān)測(cè)測(cè)試組小鼠的部分癱瘓或其它疾病體征。
異種移植模型時(shí)間表
7.1.3 外周血B細(xì)胞分離使用抗CD19和CD20二者的固定化抗體，通過(guò)正選擇分離外周血B細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定，最終分離的細(xì)胞群含有的B細(xì)胞超過(guò)85％。為了儲(chǔ)存，將所述細(xì)胞在含10％二甲基亞砜的胎牛血清(FBS)中稀釋至4×107細(xì)胞/ml，并儲(chǔ)存在液氮冷凍裝置中。
7.1.4 B細(xì)胞增殖測(cè)定解凍人外周血B細(xì)胞，并在5ng/ml重組人IL-4(Biosource)和各種稀釋度的抗-CD40單克隆抗體S2C6、G28-5(Bristol-Myers Squibb)或M3(Genzyme#80-3702-04)存在的情況下，在IMDM培養(yǎng)基+10％FBS中以1×105細(xì)胞/孔在96孔組織培養(yǎng)板中溫育。作為對(duì)照，細(xì)胞與IL-4和不相關(guān)對(duì)照單克隆抗體EXA2-1H8(抗假單胞菌外毒素)溫育。該板于37℃溫育3天，然后以0.5mCi3H-胸苷/孔脈沖16小時(shí)。使用Filtermate 196 HarvesterTM(Packard Instruments)將細(xì)胞收獲在96孔玻璃纖維濾器上，并與閃爍液混合。使用Topcount LSCTM(Packard Instruments)通過(guò)液閃記數(shù)檢測(cè)3H-胸苷摻入到新生DNA中的程度。
將選擇用來(lái)組成型表達(dá)高水平CD40L的Jurkat細(xì)胞系(“Jurkat/CD40L”)用作CD40L刺激細(xì)胞(Malik等，1996，J.Immunol.1563952-60)。為消除刺激細(xì)胞增殖，將它們用絲裂霉素(50mg/ml)的PBS溶液于37℃處理20分鐘，接著在PBS中洗滌3次，然后與B細(xì)胞混合。將B細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)與Jurkat/CD40L細(xì)胞混合，如上所述進(jìn)行測(cè)定。首先將B細(xì)胞和IL-4與刺激細(xì)胞(2.5×104細(xì)胞/孔)混合，接著立即加入抗CD40單克隆抗體。用固定濃度的刺激細(xì)胞滴定單克隆抗體，或者用固定濃度的單克隆抗體滴定刺激細(xì)胞。
7.1.5 CD40/CD40L結(jié)合測(cè)定在這些測(cè)定中使用Jurkat/CD40L細(xì)胞系作為靶細(xì)胞系。將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為2×107/ml，每個(gè)樣品50μl。在RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)+10％FBS中進(jìn)行結(jié)合。為測(cè)定受體飽和度，將Jurkat/CD40L細(xì)胞與增加濃度的CD40-Ig(CD40和人免疫球蛋白的可溶性融合蛋白)溫育(Noelle等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896550-6554)，洗滌并與綴合抗人免疫球蛋白的異硫氰酸熒光素(“FITC-抗-人Ig”)溫育。使用FacScanTM流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)評(píng)價(jià)產(chǎn)生的結(jié)合。將重組可溶性CD40-Ig(25μg/ml)在冰上與增加濃度的S2C6單克隆抗體預(yù)溫育1小時(shí)?？?CD40單克隆抗體G28-5、M3和抗假單胞菌外毒素(一種同種型對(duì)照品)被用于比較?？扇苄灾亟M人CD40配體(CD154-muCD8)作為與鼠CD8的融合蛋白產(chǎn)生并用FITC標(biāo)記，該配體得自Research Diagnostics，Inc.(Flanders，NJ)。以4倍終濃度稀釋可溶性CD40-Ig和抗-CD40單克隆抗體，在冰上預(yù)溫育1小時(shí)，然后在冰上與Jurkat細(xì)胞混合1小時(shí)。洗滌細(xì)胞，并用FITC-山羊抗人F(ab′)2(Jackson Labs，F(xiàn)c特異性#109-096-098)標(biāo)記。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定CD40結(jié)合的程度。
7.2結(jié)果7.2.1體外研究S2C6單克隆抗體促進(jìn)CD40/CD40L的相互作用為評(píng)價(jià)抗CD40單克隆抗體對(duì)可溶性CD40與在激活T細(xì)胞表面表達(dá)的CD40L的結(jié)合的影響，將增加濃度的各種CD40單克隆抗體與25μg/ml可溶性CD40-Ig預(yù)溫育，接著與Jurkat/CD40L細(xì)胞的復(fù)合體(complex)溫育。首先通過(guò)流式細(xì)胞儀用FITC標(biāo)記的抗CD40L核實(shí)在選擇的CD40L+Jurkat T細(xì)胞上的CD40L表達(dá)(未列出數(shù)據(jù))。然后使用FITC-山羊抗人Ig對(duì)Jurkat/CD40L細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量，測(cè)定結(jié)合在這些靶細(xì)胞上的CD40L的CD40，以檢測(cè)結(jié)合的CD40-Ig。用CD40-Ig滴定顯示受體飽和度約為25μg/ml CD40-Ig。使用飽和濃度的可溶性CD40，S2C6與CD40以0.25-2∶1(質(zhì)量∶質(zhì)量)的比率混合，導(dǎo)致CD40與CD40L的結(jié)合劑量依賴性增加(在約6μg/ml、13μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的濃度分別為約50％、100％、146％和220％)(圖4)。采用抑制性抗體M3的相似滴定以劑量依賴方式阻斷CD40/CD40L結(jié)合。相對(duì)于對(duì)照EXA2-1H8 Ig，G28-5單克隆抗體在高至25μg/ml的濃度顯示對(duì)CD40/CD40L結(jié)合沒(méi)有影響，在測(cè)試的最高濃度(50μg/ml)僅具有輕微刺激性。
這些數(shù)據(jù)清楚表明，S2C6單克隆抗體促進(jìn)CD40/CD40L相互作用。此外，S2C6在增加CD40/CD40L相互作用的能力方面與G28-5和M3不同。
在交互測(cè)定中，評(píng)價(jià)抗CD40單克隆抗體對(duì)可溶性CD40L與在B細(xì)胞表面表達(dá)的膜結(jié)合CD40的結(jié)合的影響。用可溶性CD40L滴定顯示，Ramos B細(xì)胞表面CD40飽和度約為10μg/ml。將增加濃度的各種抗CD40單克隆抗體與表達(dá)CD40的B細(xì)胞預(yù)溫育，接著將所述細(xì)胞與FITC標(biāo)記的可溶性CD40L溫育。然后通過(guò)對(duì)Ramos細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量，測(cè)定與靶B細(xì)胞上的CD40結(jié)合的標(biāo)記CD40L。使用飽和濃度的可溶性CD40L，將濃度范圍為0.04-2μg/ml的S2C6單克隆抗體與表達(dá)CD40的細(xì)胞混合，導(dǎo)致CD40L結(jié)合最大增加約51％-68％(圖5)。
在以上可溶性CD40的結(jié)果中，單克隆抗體G28-5對(duì)CD40/CD40L的相互作用幾乎沒(méi)有影響，與其相反，G28-5在所有的測(cè)試濃度均顯示抑制可溶性配體與CD40的結(jié)合。采用抑制性單克隆抗體M3的相似滴定也以劑量依賴方式阻斷CD40L/CD40結(jié)合。
這些數(shù)據(jù)表明，S2C6在增加CD40L/CD40相互作用的能力方面令人驚奇地與G28-5和M3不同。而且，在這些條件下，單克隆抗體G28-5和單克隆抗體M3在低至40ng/ml的濃度抑制可溶性CD40L與CD40的相互作用。7.2.2體外研究單克隆抗體S2C6增加B細(xì)胞對(duì)CD40/CD40L的反應(yīng)在存在抗CD40單克隆抗體(S2C6、G28-5或M3)的情況下，檢測(cè)原代外周B細(xì)胞對(duì)表達(dá)CD40L的細(xì)胞的生長(zhǎng)應(yīng)答。首先，在存在或不存在固定水平(30ng/ml)的各種單克隆抗體的情況下，將B細(xì)胞與增加數(shù)目的非增殖性Jurkat/CD40L細(xì)胞混合。然后通過(guò)在刺激后72小時(shí)加入3H-胸苷，檢測(cè)B細(xì)胞對(duì)處理的活化反應(yīng)。存在單克隆抗體M3時(shí)滴定T細(xì)胞導(dǎo)致B細(xì)胞增殖，與對(duì)照Ig觀察到的相似(圖6)。
盡管在沒(méi)有配體時(shí)單克隆抗體G28-5使某些B細(xì)胞活化(圖7)，但在存在G28-5時(shí)CD40L+T細(xì)胞滴定僅略微地增加B細(xì)胞增殖，超過(guò)單獨(dú)用G28-5觀察到的水平1.3倍。相反，在S2C6存在下B細(xì)胞增殖隨著T細(xì)胞刺激細(xì)胞數(shù)目的增加以劑量依賴方式增加，當(dāng)B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞刺激物的比率為4∶1時(shí)，B細(xì)胞增殖增加至僅用單克隆抗體刺激時(shí)的3倍以上。
這些數(shù)據(jù)證明，與M3和G28-5不同，S2C6令人驚奇地可與CD40L協(xié)同作用，通過(guò)CD40促進(jìn)B細(xì)胞增殖。
在該類型的第二個(gè)測(cè)定中，或者用抗CD40單克隆抗體滴定B細(xì)胞，或者將B細(xì)胞與非增殖性CD40L+T刺激細(xì)胞以固定比率4∶1(B∶T)混合，并用抗CD40單克隆抗體滴定B細(xì)胞(圖7)。
這些結(jié)果證明，在這些條件下，和單獨(dú)的G28-5相比，10μg/ml的單克隆抗體G28-5和配體使原始人外周血B細(xì)胞的活化增加2倍。S2C6明顯更具有活性，與單獨(dú)的S2C6相比，在配體存在下10μg/ml(最高測(cè)試水平)的S2C6以劑量依賴方式使B細(xì)胞增殖增加至16.2倍，達(dá)到令人吃驚的程度。
總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，S2C6與CD40混合增加CD40L結(jié)合。盡管S2C6自身以類似于G28-5的方式刺激B細(xì)胞增殖，但S2C6在其增加CD40L結(jié)合的能力以及隨后的CD40L介導(dǎo)的活化信號(hào)強(qiáng)度方面與G28-5不同。
8.實(shí)施例單克隆抗體S2C6抑制腫瘤生長(zhǎng)為評(píng)價(jià)天然單克隆抗體S2C6的抗腫瘤活性，將雌性C.B.-17 SCID小鼠分為兩組(20只小鼠/組)。每組的一半小鼠用抗-脫唾液酸-GM1處理，以鈍化宿主天然殺傷細(xì)胞活性(Murphy等，1992，Eur.J.Immunol.22241)。第二天，用Ramos、HS Sultan或IM-9細(xì)胞(1×106細(xì)胞)靜脈內(nèi)注射小鼠。然后用1mg/kg的如前文第7單元的材料和方法中所述的單克隆抗體S2C6 IgG腹膜內(nèi)注射小鼠，并監(jiān)測(cè)部分癱瘓或其它疾病發(fā)作體征。
用單克隆抗體S2C6治療患有Ramos人B細(xì)胞淋巴瘤(圖8A)、HS Sultan多發(fā)性骨髓瘤(圖8B)或IM-9多發(fā)性骨髓瘤(圖8C)的動(dòng)物，明顯減小了腫瘤塊以及所后的與腫瘤相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。在平行研究中，存在抗-脫唾液酸-GM1時(shí)療效得到維持，提示在單克隆抗體S2C6存在時(shí)存活率增加不是緣于非特異性NK細(xì)胞的活性。IM-9細(xì)胞系是一種類似于多發(fā)性骨髓瘤的侵襲性腫瘤模型，該細(xì)胞系分泌作為疾病替代標(biāo)志的人Ig。
用單克隆抗體S2C6治療患IM-9疾病的小鼠明顯增加動(dòng)物的存活。這些研究清楚顯示，S2C6對(duì)小鼠中移入的人腫瘤具有有效的抗腫瘤活性。
9.實(shí)施例單鏈抗-CD40免疫毒素融合蛋白結(jié)合CD40-Ig在大腸桿菌中以包含體表達(dá)BD1-S2C6 sFv(單鏈抗-CD40免疫毒素，一種由bryodin 1(BD1)的氨基酸序列(Francisco等，1997，J.Biol.Chem.272(39)24165-24169)融合至單克隆抗體S2C6可變區(qū)組成的融合蛋白)，使其變性和重折疊。
簡(jiǎn)而言之，使用TRIZOL試劑(Life Technologies)，按照生產(chǎn)商的建議由S2C6雜交瘤細(xì)胞分離總RNA。基本上按照Gilliland等所述(Tissue Antigens，471-20(1996))，使用與J-C接點(diǎn)下游約100個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的引物，進(jìn)行輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的cDNA第一鏈的合成。然后給所述第一鏈加聚鳥苷酸尾，并通過(guò)使用與聚鳥苷酸尾互補(bǔ)的poly-C錨式引物和將約50個(gè)堿基嵌套入用于第一鏈合成的引物中的引物的PCR進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)PCR引物以在PCR產(chǎn)物的5′和3′末端產(chǎn)生獨(dú)特限制位點(diǎn)。用EcoRI和HindIII消化含有輕鏈可變區(qū)編碼序列和重鏈可變區(qū)編碼序列的兩個(gè)PCR產(chǎn)物，并將其連接入已用相同酶消化的pUC19中。獲得的質(zhì)粒pSG5和pSG10包含分別編碼S2C6 VL和S2C6 VH的DNA。對(duì)兩種質(zhì)粒的DNA測(cè)序，并驗(yàn)證其與親代單克隆抗體的氨基酸末端序列匹配。
按照Gilliland等所述以VH-VL取向?qū)2C6的VH片段和VL片段“縫合”在一起(重疊延伸PCR)，并連接到克隆載體中。隨后通過(guò)限制酶消化將BD1-G28-5 sFv的sFv片段(Francisco等，1997，J.Biol.Chem.27224165-24169)從pSE151中去除，并在其原位連接S2C6sFv。獲得的質(zhì)粒pSG40含有在誘導(dǎo)型T7啟動(dòng)子控制下的BD1-S2C6sFv編碼基因。
為了表達(dá)pSG40，將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS細(xì)胞中，并在T-肉湯培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)所述細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到OD600＝1.0時(shí)，用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)細(xì)胞3小時(shí)。隨后，通過(guò)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)超聲波裂解，并通過(guò)離心分離為不溶性包含體的BD1-S2C6 sFv融合蛋白，如下對(duì)其進(jìn)行變性和重折疊在7M胍中以5mg/ml溶解包含體，通過(guò)快速稀釋(1∶100)到含0.3M L-精氨酸和2mM DTT的PBS中重折疊，并對(duì)20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)透析，以隨后純化。
使用Blue Sepharose隨后在固定化CD40-Ig上親和層析，分離重折疊的蛋白。
然后在ELISA中測(cè)試純化蛋白對(duì)固定化CD40-Ig的結(jié)合。用0.5μg/ml的CD40-Ig包被微量滴定板，接著在25μg/ml S2C6單克隆抗體(▲)、25μg/ml對(duì)照抗體BR96(●)或無(wú)過(guò)量抗體(■)存在下，加入純化BD1-S2C6 sFv在含1％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的PBS(pH7.4)中的稀釋液。通過(guò)加入BD1特異性兔抗血清(Seattle Genetics，Inc.，Bothell，Washington)，接著加入綴合山羊抗兔Ig的辣根過(guò)氧化物酶，檢測(cè)BD1-S2C6 sFv與固定化受體的結(jié)合。
加入過(guò)量S2C6單克隆抗體完全抑制BD1-S2C6 sFv與CD40-Ig的結(jié)合，但加入對(duì)照單克隆抗體不能完全抑制BD1-S2C6 sFv與CD40-Ig的結(jié)合(圖9)。
10.實(shí)施例在治療CD40陽(yáng)性惡性腫瘤時(shí)給予重組S2C6給患CD40陽(yáng)性惡性腫瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和結(jié)腸癌或其它癌癥)的患者注射重組人源化S2C6-抗-CD40單克隆抗體(具有鼠CDR和人構(gòu)架區(qū))或重組嵌合抗體(包含S2C6可變區(qū)和人抗體恒定區(qū))。體外制備重組抗體。治療可在病程中的任意時(shí)間開(kāi)始，可伴隨或不伴隨化療。
治療方案包括每周注射一次在鹽水或其它生理上相容的溶液中稀釋的所述藥物。
重組S2C6使用的劑量范圍為0.1mg/m2(患者的體表面積)至1000mg/m2，優(yōu)選劑量為100-500mg/m2。
注射途徑為通過(guò)或外周靜脈連線(access line)或中樞靜脈連接線靜脈內(nèi)注射。所述藥物作為輸注液而不是靜脈推注給藥。
通過(guò)檢測(cè)a)在外周血中的總淋巴細(xì)胞數(shù)目以及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的數(shù)目；b)T淋巴細(xì)胞(輔助T4淋巴細(xì)胞和溶細(xì)胞T8淋巴細(xì)胞)的體外活性；和/或c)使用諸如計(jì)算層析X射線照相術(shù)(CT)掃描、磁共振成像(MRI)掃描、X射線成像、骨掃描成像和腫瘤活檢采樣包括骨髓抽提(BMA)的技術(shù)檢測(cè)腫瘤形態(tài)學(xué)的變化，監(jiān)測(cè)重組S2C6的治療功效。
根據(jù)以上獲得的結(jié)果，開(kāi)發(fā)最適宜治療CD40陽(yáng)性惡性腫瘤的治療方案，即對(duì)免疫系統(tǒng)能力的影響最小，并達(dá)到腫瘤消退和完全根除腫瘤細(xì)胞的最終目標(biāo)。
11.微生物保藏根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，1999年5月25日將分泌天然單克隆抗體S2C6的雜交瘤S2C6保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassass，Virginia 20110-2209，指定的的保藏號(hào)為PTA-110。
12.具體的實(shí)施方案、參考文獻(xiàn)的引用本文所述的具體實(shí)施方案不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，除了本文描述的本發(fā)明以外，根據(jù)前述和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。這樣的修改應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
本文引用的各種參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)、專利和科學(xué)出版物，其公開(kāi)的內(nèi)容都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
說(shuō)明書的核苷酸和氨基酸序列<110>SEATTLE GENETICS，INC.<120>重組抗-CD40抗體及其用途<130>9632-009-228<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>336<212>DNA<213>小家鼠<220><221>CDS<222>(1)..(336)<400>1gat gtt gtg gtg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15gct caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt gta cac agt 96Ala Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30aat gga aac acc ttt tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45cca aaa ctc ctg atc tac aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa act 288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr85 90 95aca cat gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc caa 336Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln100 105 110<210>2<211>112<212>PRT<213>小家鼠<400> 2Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr85 90 95Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln100 105 110<210>3<211>16<212>PRT<213>小家鼠<400>3Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu His1 5 10 15<210>4<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>4Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>5Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr1 5<210>6<211>342<212>DNA<213>小家鼠<220><221>CDS<222>(1)..(342)<400>6gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gtg aag cct ggg gct 48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15tca gtg aag atc tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac 96Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30tac ata cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45gga cgt gtt att cct aac aat gga ggc act agt tac aac cag aag ttc 192Gly Arg Val Ile Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60aag ggc aag gcc ata tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac 240Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gaa ctc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gca aga gaa ggg atc tac tgg tgg ggc cac ggc acc act ctc aca gtc 336Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val100 105 110tcc tca 342Ser Ser<210>7<211>114<212>PRT<213>小家鼠<400>7Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Val Ile Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala ValTyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val100 105 110Ser Ser<210>8<211>6<212>PRT<213>小家鼠<400>8Thr Gly Tyr Tyr Ile His1 5<210>9<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>9Arg Val Ile Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>10<211>4<212>PRT<213>小家鼠<400>10Glu Gly Ile Tyr1<210>11<211>48<212>DNA<213>小家鼠<400>11agatctagtc agagccttgt acacagtaat ggaaacacct ttttacat48<210>12<211>21<212>DNA<213>小家鼠<400>12acagtttcca accgattttc t 21<210>13<211>18<212>DNA<213>小家鼠<400>13actggctact acatacac 18<210>14<211>51<212>DNA<213>小家鼠<400>14cgtgttattc ctaacaatgg aggcactagt tacaaccaga agttcaaggg c51<210>15<211>12<212>DNA<213>小家鼠<400>15gaagggatct ac 1權(quán)利要求
1.一種包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的分子，所述分子(a)免疫特異性地結(jié)合CD40，和(b)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在一級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
2.一種包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的分子，所述分子(a)免疫特異性地結(jié)合CD40，和(b)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1或2的分子，所述分子含有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者含有SEQ ID NO7的氨基酸序列，或者既含有SEQ IDNO2的氨基酸序列，也含有SEQ ID NO7的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1或2的分子，它是一種抗體。
5.權(quán)利要求1或2的分子，它是一種融合蛋白，含有為非抗體的第二種分子的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的分子，它含有融合至SEQ ID NO7或融合至SEQ ID NO2的bryodin(BD1)的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1或2的分子，它是一種抗體，包含由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6的可變區(qū)和人恒定區(qū)。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分子，該分子是純化的。
9.一種純化的蛋白，它含有的氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO7具有至少95％的同一性，所述蛋白(a)免疫特異性地結(jié)合CD40；和(b)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
10.一種純化的蛋白，所述蛋白(a)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(b)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(c)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
11.一種純化的蛋白，所述蛋白(a)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(b)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(c)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。
12.一種分離的核酸，它含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14或SEQ ID NO15。
13.一種分離的核酸，它含有編碼含SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的蛋白的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的分離的核酸，它含有編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白包含(a)由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6的重鏈可變區(qū)，和(b)人恒定區(qū)。
15.一種分離的核酸，它含有編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白包含的氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO7具有至少95％的同一性。
16.一種包含編碼蛋白的核苷酸序列的分離的核酸，所述蛋白與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，并且所述蛋白增加CD40配體與CD40的結(jié)合至少45％。
17.一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的分離的核酸，所述融合蛋白包含融合至SEQ ID NO7或SEQ ID NO2的bryodin 1(BD1)的氨基酸序列。
18.一種分離的核酸，它在高嚴(yán)格條件下與由編碼DNA序列組成的DNA的反向互補(bǔ)物雜交，所述編碼DNA序列對(duì)由選自SEQ IDNO2和SEQ ID NO7的氨基酸序列組成的蛋白進(jìn)行編碼，所述分離的核酸編碼免疫特異性結(jié)合CD40的蛋白。
19.一種重組細(xì)胞，它含有的重組核酸載體包含編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，并且所述蛋白增加CD40配體與CD40的結(jié)合至少45％。
20.一種重組細(xì)胞，它含有的重組核酸載體包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14或SEQ ID NO15。
21.一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)包含編碼蛋白的重組核苷酸序列的細(xì)胞，所述蛋白與保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，并且所述蛋白增加CD40配體與CD40的結(jié)合至少45％，以使所述蛋白由所述細(xì)胞表達(dá)；和(b)回收所表達(dá)的蛋白。
22.一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)包含編碼蛋白的重組核苷酸序列的細(xì)胞，所述蛋白包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，以使由所述核苷酸序列編碼的蛋白由所述細(xì)胞表達(dá)；和(b)回收所表達(dá)的蛋白。
23.一種藥用組合物，它包括(a)包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一種分子，其量可有效治療或預(yù)防癌癥，所述分子(i)免疫特異性結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入；和(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
24.一種藥用組合物，它包括(a)一種治療或預(yù)防癌癥有效量的純化蛋白，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入；和(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
25.一種藥用組合物，它包括(a)一種治療或預(yù)防癌癥有效量的純化蛋白，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生；和(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
26.一種藥用組合物，它包括(a)包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一種分子，其量可有效激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述分子(i)免疫特異性結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入；和(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
27.一種藥用組合物，它包括(a)一種純化蛋白，其量可有效激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入；和(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
28.一種藥用組合物，它包括(a)一種純化蛋白，其量可有效激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生；和(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
29.權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)的藥用組合物，它還含有CD40配體。
30.一種在患者中治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給予所述患者一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一種分子，其量可有效治療或預(yù)防癌癥，所述分子(i)免疫特異性結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
31.一種在患者中治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給予所述患者一定量的一種純化蛋白，其量可有效治療或預(yù)防癌癥，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
32.一種在患者中治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給予所述患者一定量的一種純化蛋白，其量可有效治療或預(yù)防癌癥，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。
33.一種激活或增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予所述患者一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一種分子，其量使得所述患者的免疫應(yīng)答被激活或增強(qiáng)，所述分子(i)免疫特異性結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
34.一種在患者中激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予所述患者一定量的一種純化蛋白，其量使得所述患者的免疫應(yīng)答被激活或增強(qiáng)，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
35.一種在患者中激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予所述患者一定量的一種純化蛋白，其量使得所述患者的免疫應(yīng)答被激活或增強(qiáng)，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。
36.一種在患者中治療或預(yù)防免疫疾病的方法，該方法包括給予所述患者一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一種分子，其量可有效治療或預(yù)防免疫疾病，所述分子(i)免疫特異性結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
37.一種在患者中治療或預(yù)防免疫疾病的方法，該方法包括給予所述患者一定量的一種純化蛋白，其量可有效治療或預(yù)防免疫疾病，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的天然單克隆抗體S2C6相比，在初級(jí)氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代或插入。
38.一種在患者中治療或預(yù)防免疫疾病的方法，該方法包括給予所述患者一定量的一種純化蛋白，其量可有效治療或預(yù)防免疫疾病，所述蛋白(i)與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，(ii)使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％，和(iii)不是由雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6產(chǎn)生。
39.權(quán)利要求30-38中任一項(xiàng)的方法，該方法還包括給予所述患者CD40配體。
40.權(quán)利要求30-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者是人。
41.權(quán)利要求4的抗體，它不是同種型IgG1。
42.一種人類以外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物或包含一種或多種編碼蛋白的轉(zhuǎn)基因的分離細(xì)胞，所述蛋白與雜交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏號(hào)為PTA-110)分泌的單克隆抗體S2C6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40，并且所述蛋白使CD40配體與CD40的結(jié)合增加至少45％。
43.一種藥用組合物，它包含(a)免疫特異性結(jié)合CD40的一種分子，所述分子增加CD40配體與CD40的結(jié)合；(b)CD40配體；和(c)一種藥學(xué)上可接受的載體，它們的量可有效治療或預(yù)防癌癥或免疫疾病，或可有效激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
44.一種在患者中治療或預(yù)防癌癥或免疫疾病的方法，該方法包括給予所述患者(a)免疫特異性結(jié)合CD40的一種分子，所述分子增加CD40配體與CD40的結(jié)合；和(b)CD40配體，它們的量對(duì)所述治療或預(yù)防有效。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述方法是用于治療癌癥。
46.權(quán)利要求30-32和45中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥為實(shí)體瘤。
47.權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療癌癥、炎癥性疾病和免疫系統(tǒng)疾病或缺陷的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括給予增強(qiáng)CD40與CD40配體結(jié)合的CD40結(jié)合蛋白。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1369015SQ00811357
公開(kāi)日2002年9月11日 申請(qǐng)日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月8日
發(fā)明者C·B·西加爾, A·F·瓦爾, J·A·弗蘭西斯科, 小H·P·菲爾 申請(qǐng)人:西雅圖基因公司