多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明特別涉及一種肺癌干細(xì)胞特異性結(jié)合多肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 2008年世界衛(wèi)生組織在其公布的報告中明確指出，非傳染性疾病正成為人類最為 致命的"殺手"，每年有大約500萬人死于癌癥。但整體來講，對于腫瘤的治療效果并不理 想。主要在于腫瘤發(fā)病機理尚不清楚，例如腫瘤的起源問題。腫瘤干細(xì)胞（CancerStem Cells，CSCs)理論的提出讓我們看到新的希望。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤組織具有異質(zhì) 性，所有的腫瘤細(xì)胞中，只有很小一部分細(xì)胞具有形成并維持腫瘤生長和異質(zhì)性的能力，這 一小部分細(xì)胞被稱作腫瘤干細(xì)胞。并且人們認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤起始和生長，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn) 移，以及耐藥性產(chǎn)生的根源。對于腫瘤干細(xì)胞的研究有利于我們更好的了解腫瘤發(fā)生發(fā)展 的過程和建立一種更有效的治療策略。
[0003] 目前，腫瘤干細(xì)胞的研究主要依賴于分子標(biāo)志物，然而多數(shù)實體瘤并沒有找到特 異的腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)志物。研究人員一直期望建立一種新的策略，建立一種不依賴于特 異分子標(biāo)志物的鑒定和分離腫瘤干細(xì)胞方法。近些年出現(xiàn)的表面展示技術(shù)可以在未知細(xì)胞 表面分子的情況下實現(xiàn)細(xì)胞特異性結(jié)合多肽的篩選。表面展示技術(shù)是利用基因工程手段實 現(xiàn)外源多肽(或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域）以融合蛋白形式在微生物表面進行展示的新型基因工程技 術(shù)，被展示的多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。細(xì)菌表面展 示技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞分選技術(shù)以快速、高通量的特點為展示技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用的熱點。但是， 如何利用上述表面展示技術(shù)進行肺癌干細(xì)胞特異性結(jié)合多肽篩選及進一步建立一種不依 賴于特異分子標(biāo)志物的鑒定和分離腫瘤干細(xì)胞的方法仍是業(yè)界亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種多肽，它包含SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3中任 一項所示的氨基酸序列。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于提供前述多肽的衍生物，它包括： (i)SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3中任一項所示的氨基酸序列中的一個以上氨基酸殘 基被取代形成的多肽， 或者，（ii)在SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3中任一項所示的氨基酸序列中的一個以上 氨基酸殘基內(nèi)引入取代基團而形成的多肽， 或者，（iii)權(quán)利要求1所述多肽與選定化合物融合形成的多肽， 或者，（iv)將選定的附加氨基酸序列融合于SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3中任一項所 示的氨基酸序列而形成的多肽。
[0006] 進一步的，所述多肽的衍生物包括： SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3中任一項所示氨基酸序列中的一個以上，優(yōu)選1~3個， 更優(yōu)選1~2個，尤其優(yōu)選1個保守性氨基酸殘基被取代形成的、能與非小細(xì)胞肺癌H460 細(xì)胞系中的肺癌干細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽。
[0007] 進一步的，所述多肽的衍生物包含SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3中任一項所示的 核心氨基酸序列，而在核心氨基酸序列兩端分別連接具有XI、X2個氨基酸的肽段，其中XI、 X2為0~7中的任一個整數(shù)。
[0008] 作為其中較為典型的案例之一，所述多肽的衍生物具有SEQIDNo. 4所示的氨基 酸序列。
[0009] 本發(fā)明的目的之三在于提供又一種多肽，它具有SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列， 并且其中的兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵，構(gòu)成環(huán)形多肽結(jié)構(gòu)。
[0010] 本發(fā)明的目的之四在于提供前述多肽或其衍生物在制備非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞 系肺癌干細(xì)胞檢測和/或分離試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的之五在于提供前述多肽或其衍生物在制備非小細(xì)胞肺癌H460的治 療藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的目的之六在于提供一種分離的多核苷酸或其變異體，它能夠編碼前述的 多肽或其衍生物。
[0013] 本發(fā)明的目的之七在于提供包含編碼前述多肽或其衍生物的多核苷酸或其變異 體的表達載體。
[0014] 本發(fā)明的目的之八在于提供包含前述多核苷酸或其變異體或前述載體的宿主細(xì) 胞。
[0015] 本發(fā)明的目的之九在于提供一種熒光素標(biāo)記的多肽，它包含： 前述多肽或其衍生物， 以及，用以標(biāo)記所述多肽或其衍生物的熒光素分子。
[0016] 本發(fā)明的目的之十在于提供一種多肽標(biāo)記的磁性粒子，它包含前述多肽或其衍生 物以及磁性粒子，其中，所述磁性粒子包括磁性納米粒子或超順磁納米粒子。
[0017] 本發(fā)明的目的之i^一在于提供一種非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞系肺癌干細(xì)胞檢測和 /或分離試劑或試劑盒，它包含前述多肽或其衍生物。
[0018] 本發(fā)明的目的之十二在于提供一種用于治療非小細(xì)胞肺癌H460的藥物組合物， 包含可藥用載體及前述多肽或其衍生物。
[0019] 本發(fā)明采用細(xì)菌隨機多肽庫體外展示技術(shù)和流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選出與非小細(xì) 胞肺癌H460細(xì)胞系中的肺癌干細(xì)胞特異性結(jié)合的細(xì)菌，經(jīng)基因測序及體外細(xì)胞結(jié)合實驗 鑒定后，得到與肺癌干細(xì)胞特異性結(jié)合的13肽，具有SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 3所示的 序列，其可分別命名為"HCBP-1肽"、"HCBP-2肽"及"HCBP-3肽"。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點至少在于：該HCBP-1肽~HCBP-3肽，特別是其中 的HCBP-1肽可與非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞系中的肺癌干細(xì)胞特異性結(jié)合，而對正常肺成纖 維細(xì)胞HLF細(xì)胞、多種肺癌細(xì)胞及人間充質(zhì)干細(xì)胞無特異性結(jié)合作用，顯示出多肽對肺癌 腫瘤細(xì)胞的特異性選擇。同時，該HCBP-1肽~HCBP-3肽的制備方法簡單易行，適于規(guī)?；?工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明為肺癌干細(xì)胞的鑒定、分離及靶向治療等提供了重要的理論和實踐基礎(chǔ)， 具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0021] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0022] 圖1A- 1B顯示了非小細(xì)胞肺癌H460腫瘤干細(xì)胞的富集擴增，其中，圖1A顯示了 細(xì)胞培養(yǎng)在有血清的環(huán)境中單層貼壁生長，保持分化狀態(tài)。圖1B顯示了少量的細(xì)胞在無血 清培養(yǎng)體系中持續(xù)分離生長，形成球狀的克隆球，保持干細(xì)胞狀態(tài)。
[0023] 圖2A-2B顯示了本發(fā)明非小細(xì)胞肺癌H460腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合細(xì)菌（以下簡稱 特異細(xì)菌，而圖中所示cell是作為空白對照的腫瘤干細(xì)胞)的富集過程，其中，圖2A示出了 隨著分選次數(shù)的增加，特異細(xì)菌對腫瘤干細(xì)胞的結(jié)合效率逐步增長，圖2B示出了隨著分選 次數(shù)的增加，特異細(xì)菌對H460貼壁細(xì)胞的結(jié)合效率并沒有增加。
[0024] 圖3顯示了本發(fā)明篩選所得特異細(xì)菌與肺正常成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞，肺癌細(xì)胞 系A(chǔ)549、H1299細(xì)胞，人間充質(zhì)干細(xì)胞MSC細(xì)胞的結(jié)合效率均很低。
[0025] 圖4A-4B顯示了篩選出來的3個細(xì)菌克隆(分別含HCBP-1肽~HCBP-3肽)與腫瘤 干細(xì)胞和貼壁H460細(xì)胞的結(jié)合情況，圖4A示出了HCBP-1的細(xì)菌與腫瘤干細(xì)胞的結(jié)合效率 可達52. 3 %，而與貼壁細(xì)胞的結(jié)合效率只有0. 6 %，圖4B示出了HCBP-2的細(xì)菌與腫瘤干 細(xì)胞的結(jié)合效率可達38. 6 %，而與貼壁細(xì)胞的結(jié)合效率只有0. 5 %。圖4C示出了HCBP-3 的細(xì)菌與腫瘤干細(xì)胞的結(jié)合效率可達37.2 %，而與貼壁細(xì)胞的結(jié)合效率只有0.9 %。
[0026] 圖5顯示了熒光顯微鏡鑒定腫瘤干細(xì)胞的結(jié)果，其中，富集了腫瘤干細(xì)胞的克隆 球表面結(jié)合了大量FITC標(biāo)記的HCBP-1多肽