本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱中性蛋白酶基因、生產(chǎn)該嗜熱中性蛋白酶的工程菌jd-tp(大腸埃希氏菌escherichiacoli)、利用該基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的嗜熱中性蛋白酶、自催化剪切后獲得的成熟的嗜熱中性蛋白酶、該嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶在降解蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白酶，是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)或多肽的一類水解酶。按活性中心氨基酸殘基的種類可分成絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。按反應(yīng)的ph值可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。

蛋白酶在工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，蛋白酶是臨床上使用最早、用途最廣的藥用酶之一，可用于治療消化不良、消炎、活化血管及高血壓的治療。在食品工業(yè)中，蛋白酶可用于肉軟化、生產(chǎn)乳酪、啤酒去污及制備蛋白胨等。蛋白酶是加酶洗滌劑添加的主要酶類之一，用于清除蛋白污垢。除了可添加于日用洗滌劑中，蛋白酶還可用于醫(yī)用多酶洗滌劑中，用于降解手術(shù)器械上的血紅蛋白等。目前國內(nèi)市場的醫(yī)用多酶洗滌劑中添加的蛋白酶主要依靠進(jìn)口，價格較高，因此開發(fā)高活性和穩(wěn)定性的蛋白酶具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會和環(huán)境效益。

中性蛋白酶是最適反應(yīng)ph在7.0左右的蛋白酶，已被應(yīng)用于食品、洗滌劑及紡織等行業(yè)。但目前國內(nèi)從事中性蛋白酶研發(fā)和銷售的酶制劑企業(yè)很少，因此，中性蛋白酶的研發(fā)有較好的研究和應(yīng)用前景。

中國專利cn103667150公開了一種生產(chǎn)熱穩(wěn)定的中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌，所述中性蛋白酶最適反應(yīng)溫度70℃，最適反應(yīng)ph為7.2。酶在55℃下保溫1h酶活不下降。在60℃下，30min酶活力降低了5％，1h酶活力降低15％。

酶在實際應(yīng)用時條件復(fù)雜，而中性蛋白酶的缺點是穩(wěn)定性差，限制了它的應(yīng)用范圍。嗜熱酶與化學(xué)催化劑相比，具有催化效率高、底物專一性強(qiáng)及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是工業(yè)用酶非常有潛力的來源。所以，開發(fā)高活性、穩(wěn)定性的嗜熱中性蛋白酶，可為工業(yè)用蛋白酶提供優(yōu)質(zhì)候選酶。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是利用pcr方法從嗜熱細(xì)菌獲得一種嗜熱中性蛋白酶基因；

本發(fā)明的另一個目的是利用上述嗜熱中性蛋白酶基因通過生物工程技術(shù)構(gòu)建一種嗜熱中性蛋白酶工程菌；

本發(fā)明的再一個目的是利用上述嗜熱中性蛋白酶工程菌制備一種活性高、穩(wěn)定性好的嗜熱中性蛋白酶；

本發(fā)明利用上述嗜熱中性蛋白酶經(jīng)過自催化剪切獲得高活性、高穩(wěn)定性的成熟的嗜熱中性蛋白酶。

本發(fā)明的最后一個目的是通過對嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶的性質(zhì)研究，提供嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶在蛋白質(zhì)降解應(yīng)用領(lǐng)域中的應(yīng)用。

嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8于1995年從日本溫泉中分離，可在65～85℃生長，最適生長溫度為75℃。該菌的基因組測序已經(jīng)完成(ncbi基因組數(shù)據(jù)庫中檢索號nc_006461，masuir.,kurokawak.,nakagawan.,tokunagaf.,koyamay.,shibatat.,oshimat.,yokoyamas.,yasunagat.andkuramitsus.)，我們在其基因組中發(fā)現(xiàn)一個可能編碼嗜熱絲氨酸蛋白酶的基因(ttha0724)，其核苷酸序列如序列表seqidno.1所示，包含1305bp，編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表seqidno.2所示，包含434aa。經(jīng)signalp信號肽在線分析工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)分析確定蛋白序列中n末端第1～19位氨基酸為信號肽序列，通過質(zhì)譜分析蛋白分子量(如圖1所示)確定第20～109位氨基酸序列為n端前肽，第110～434位氨基酸序列為成熟的嗜熱中性蛋白酶(我們通過質(zhì)譜分析分子量確定切割位點在第109和110位氨基酸之間)。

絲氨酸蛋白酶一般以前體蛋白(pre-pro-protease)形式表達(dá)，包括信號肽序列、n端前肽和成熟酶區(qū)三部分。信號肽的功能是保證蛋白質(zhì)從生產(chǎn)細(xì)胞釋放到胞質(zhì)或胞外培養(yǎng)基中，在經(jīng)過細(xì)胞膜運輸?shù)郊?xì)胞外時被信號肽酶從前體蛋白上切下來。去除信號肽后的蛋白被稱為酶原(pro-protease)，通常是沒有活性的，其經(jīng)過處理后去除n端前肽，成為有活性的成熟酶，這種剪切起因于絲氨酸蛋白酶的自消化或自催化剪切。

由于嗜熱細(xì)菌人工培養(yǎng)周期長，所含嗜熱中性蛋白酶的量非常低，因此不能直接利用嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)物來生產(chǎn)嗜熱中性蛋白酶。將嗜熱中性蛋白酶基因克隆到可快速繁殖、易于培養(yǎng)的常溫宿主如大腸桿菌中，可有效解決上述問題。

如前所述，ttha0724基因共編碼434aa，如序列表seqidno.2所示，其中第1～19位氨基酸序列為信號肽序列，在大腸桿菌中表達(dá)時需要去除這段序列，同時去除第20位的cys，共去除蛋白n末端的20個氨基酸序列。因此，pcr上游引物的設(shè)計是從序列表seqidno.1所示的第61位核苷酸開始(第61～63位核苷酸編碼第21位氨基酸)，共包含1245bp，其編碼的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示的第21～434位氨基酸序列，共414aa，即本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶。培養(yǎng)嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8，提取基因組。利用pcr擴(kuò)增基因，得到本發(fā)明所述含有n端前肽的嗜熱中性蛋白酶基因，我們委托上海生工生物有限公司進(jìn)行基因測序，其核苷酸序列如序列表seqidno.1所示的第61～1305位核苷酸。其編碼的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示的第21～434位氨基酸，包含414aa。通過質(zhì)譜分析蛋白分子量(見圖1)，確定成熟的嗜熱中性蛋白酶應(yīng)從序列表seqidno.2所示的第110位的leu開始，即第20～109位氨基酸序列應(yīng)為n端前肽，不存在于成熟的嗜熱中性蛋白酶中，因此，成熟的嗜熱中性蛋白酶的序列長度預(yù)計為325個氨基酸(如序列表seqidno.3所示)，與sds-page檢測的成熟的嗜熱中性蛋白酶的分子大小一致(見圖3)。

我們將嗜熱中性蛋白酶基因裝載在pet系列載體上，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中，得到一株工程菌(命名為：jd-tp)，該工程菌已于2017年04月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所菌種中心，cgmcc)，保藏編號為cgmccno.14072，分類命名：大腸埃希氏菌(escherichiacoli)。

如本發(fā)明提供的工程菌菌株的特征如下：

1.菌體形態(tài)特征：菌體為兩端鈍圓的桿菌，革蘭氏陰性細(xì)菌。

2.培養(yǎng)特征：菌落為圓形半透明，中部突起，邊緣光滑。

3.菌株培養(yǎng)條件：平板培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，液體培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行，最適生長溫度37℃，最適ph7.0，培養(yǎng)基中加入100μg/ml的氨芐青霉素和30μg/ml的氯霉素。嗜熱中性蛋白酶的誘導(dǎo)條件為37℃振蕩培養(yǎng)至od600約為0.8時，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度0.2mmol/l，于20℃時180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。

4.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基(1l培養(yǎng)基的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nacl10g，蒸餾水溶解，定容至1l，1.034×10⁵pa高壓蒸氣滅菌20min)和lb固體培養(yǎng)基(在lb培養(yǎng)基配方中加入15g/l的瓊脂粉)。

工程菌表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞可溶性蛋白，通過細(xì)胞超聲破碎、加熱失活大腸桿菌雜蛋白，ni-nta親和層析進(jìn)行分離純化得到嗜熱中性蛋白酶。

純化后的嗜熱中性蛋白酶在85℃熱處理30min，可進(jìn)行自催化剪切去除n端前肽，經(jīng)ni-nta親和層析進(jìn)行分離純化得到成熟的嗜熱中性蛋白酶。

應(yīng)用大腸桿菌工程菌(jd-tp)表達(dá)的嗜熱蛋白經(jīng)蛋白酶活性實驗鑒定具有蛋白酶活力；該嗜熱蛋白即為本發(fā)明所述的嗜熱中性蛋白酶，其氨基酸序列如序列表seqidno.2所示的第21～434位氨基酸序列，包含414aa，分子量約46kda。嗜熱中性蛋白酶能在高溫條件(65～90℃)下催化酪蛋白降解，最適反應(yīng)溫度為85℃，可在ph5.0～11.0的范圍內(nèi)催化反應(yīng)，最適ph為7.5。嗜熱中性蛋白酶有很強(qiáng)的耐熱性，在中性及堿性條件下保持很高的催化活力及穩(wěn)定性；嗜熱中性蛋白酶經(jīng)85℃溫育，經(jīng)自催化剪切去除n端前肽后得到分子量約35kda的成熟的嗜熱中性蛋白酶(其氨基酸序列如序列表seqidno.3所示氨基酸序列，成熟的嗜熱中性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為75℃，最適反應(yīng)ph為6.5，穩(wěn)定性不如嗜熱中性蛋白酶，但85℃的半衰期仍達(dá)到60h；該嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶運用到生產(chǎn)中，有儲運成本低、催化效率高等優(yōu)點。該嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶可催化酪蛋白及bsa等蛋白質(zhì)水解，在降解蛋白質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。

將本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，本發(fā)明不限于特定的表達(dá)載體，優(yōu)選的表達(dá)載體采用真核或原核表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選為pet22b載體。

上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，適宜的宿主細(xì)胞包括原核和真核細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。如大腸桿菌bl21(de3)、bl21(de3)plyss及transetta(de3)在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌transetta(de3)菌株。

以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照“分子克隆實驗指南”(第三版，科學(xué)出版社，2002年)。

本發(fā)明所述的嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8(jcm10941)是一種已知菌種，購自日本japancollectionofmicroorganisms，rikenbioresourcecenter。

本發(fā)明中用到的原核表達(dá)載體pet22b和大腸桿菌宿主菌bl21(de3)和bl21(de3)plyss是本技術(shù)領(lǐng)域人員常用載體和宿主菌，可購自美國novagen公司，該公司的網(wǎng)址：http://www.novagen.com?？梢酝ㄟ^公司給定的聯(lián)系方式購買，或通過該公司在國內(nèi)各省市的代理公司購買。

本發(fā)明使用的大腸桿菌transetta(de3)是一種本領(lǐng)域普遍使用的宿主細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，該公司的網(wǎng)址是：http://transgen.com.cn，可以通過公司給定的聯(lián)系方式購買，或通過該公司在國內(nèi)各省市的代理公司購買。

本發(fā)明通過所構(gòu)建的表達(dá)嗜熱中性蛋白酶的大腸桿菌表達(dá)體系，提供大量生產(chǎn)具有蛋白酶活性且穩(wěn)定性好的重組嗜熱中性蛋白酶及利用純化的嗜熱中性蛋白酶生產(chǎn)成熟的嗜熱中性蛋白酶的方法，包括以下幾個步驟：

(1)通過ncbigenbank搜索得到來自嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8的嗜熱絲氨酸蛋白酶ttha0724基因序列(1305bp，編碼434aa)，利用在線分析工具signalp分析蛋白序列中前19個aa為分泌信號肽序列，在大腸桿菌中表達(dá)要去除蛋白酶自身的信號肽序列，同時去除了第20位的半胱氨酸，因此設(shè)計pcr引物時，上游引物從第21位氨基酸密碼子處(第61位堿基處)開始，下游引物中去除終止密碼子，擴(kuò)增得到嗜熱中性蛋白酶基因片段，利用表達(dá)載體pet22b插入位點下游的his6標(biāo)簽使蛋白的c末端帶有his6標(biāo)簽便于純化；培養(yǎng)嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8，提取其基因組作為模板pcr擴(kuò)增目的基因片段，并將其連接到質(zhì)粒表達(dá)載體pet22b上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；

(2)將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌transetta(de3)宿主細(xì)胞中，構(gòu)建重組大腸桿菌jd-tp；

(3)在上述的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)嗜熱中性蛋白酶；

(4)分離純化所述的嗜熱中性蛋白酶；

(5)純化的嗜熱中性蛋白酶在85℃溫育30min，經(jīng)過自催化剪切去除n端前肽，經(jīng)ni-nta純化得到成熟的嗜熱中性蛋白酶；

(6)測定嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶的基本酶學(xué)性質(zhì)。

其中，所述步驟(1)中嗜熱中性蛋白酶基因通過ecori和xhoi雙酶切連入經(jīng)同樣處理的表達(dá)載體pet22b。

步驟(4)中，包括以下步驟：

a)將發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，按1g濕菌體加入10ml緩沖液的量加入50mmol/ltris-hcl(ph8.0)緩沖液超聲破碎20min，12000rpm離心20min收集上清，于70℃熱處理30min，12000rpm離15min，收集上清即為粗酶液；

b)將粗酶液經(jīng)ni-nta層析分離，得到純酶，洗脫液為含100mmol/l咪唑的20mmol/ltris-hcl(ph8.0)緩沖液。

通過本發(fā)明上述方法分離純化得到的嗜熱中性蛋白酶和成熟的嗜熱中性蛋白酶產(chǎn)品，其純度達(dá)98％以上，在最佳反應(yīng)條件下，酶的比活力為5145u/mg和2230u/mg。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)通過pcr擴(kuò)增得到嗜熱中性蛋白酶基因，將其連入表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)；

(2)設(shè)計了簡便的純化工藝，獲得較高的回收率和較好的純化效果；

(3)嗜熱中性蛋白酶和成熟的嗜熱中性蛋白酶具有較高的最適反應(yīng)溫度，較寬的反應(yīng)溫度和ph范圍，及極高的穩(wěn)定性，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：成熟的嗜熱中性蛋白酶的質(zhì)譜圖。

圖2：嗜熱中性蛋白酶經(jīng)ni－nta純化的sds-page電泳圖譜，其中1：超聲后的上清液在70℃熱處理30min的樣品；2：50mmol/l咪唑洗脫液；3：100mmol/l咪唑洗脫液；4：200mmol/l咪唑洗脫液；m：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白標(biāo)記。

圖3：成熟的嗜熱中性蛋白酶的sds-page電泳圖譜，其中m：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白標(biāo)記；1：嗜熱中性蛋白酶于85℃熱處理15min的樣品；2：嗜熱中性蛋白酶于85℃熱處理30min的樣品；3：經(jīng)ni-nta純化后的成熟的嗜熱中性蛋白酶。

圖4：嗜熱的中性蛋白酶的溫度－活力曲線；

圖5：嗜熱的中性蛋白酶的溫度穩(wěn)定性曲線；

圖6：嗜熱的中性蛋白酶的ph－活力曲線；

圖7：嗜熱的中性蛋白酶的ph穩(wěn)定性曲線；

圖8：成熟的嗜熱中性蛋白酶的溫度-活力曲線；

圖9：成熟的嗜熱中性蛋白酶的溫度穩(wěn)定性曲線；

圖10：成熟的嗜熱中性蛋白酶的ph－活力曲線；

圖11：成熟的嗜熱中性蛋白酶的ph穩(wěn)定性曲線；

圖12：嗜熱中性蛋白酶降解酪蛋白和bsa的sds-page電泳圖譜，其中m：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白標(biāo)記；1：嗜熱中性蛋白酶在85℃降解2.5mg/ml的bsa15min的樣品；2：2.5mg/ml的bsa在85℃溫育15min的樣品；3：未處理的2.5mg/ml的bsa樣品；4：嗜熱中性蛋白酶在85℃降解5mg/ml的酪蛋白15min的樣品；2：5mg/ml的酪蛋白在85℃溫育15min的樣品；3：未處理的5mg/ml的酪蛋白樣品。

具體實施方式

實施例1：嗜熱中性蛋白酶工程菌的構(gòu)建及蛋白表達(dá)，包括以下步驟：

(1)嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8的培養(yǎng)和基因組dna的提取

1l嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)基的組成是：蛋白胨4.0g、酵母抽提物2.0g、nacl1.0g、castenholz鹽溶液10.0ml，蒸餾水1.0l，調(diào)整ph值至7.2，1.034×10⁵pa高壓蒸汽滅菌20min。

castenholz鹽溶液：氨三乙酸1.0g、caso4·2h2o0.6g、mgso4·7h2o1.0g、nacl0.08g、kno31.03g、nano36.89g、na2hpo41.11g、fecl3·6h2o溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03％)10.0ml、nitsch's微量元素10.0ml、蒸餾水1.0l，調(diào)整ph至8.2，過濾除菌。

nitsch's微量元素：h2so40.5ml、mnso4·xh2o2.2g、znso4·7h2o0.5g、h3bo30.5g、cuso4·5h2o0.016g、na2moo4·2h2o0.025g、cocl2·6h2o0.046g、蒸餾水1.0l，過濾除菌。

向購買自日本微生物菌種保藏中心的嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8的干菌體中加入0.5ml已滅菌的上述嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)基，重懸菌體后全部轉(zhuǎn)移到已裝有5ml上述嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)基的試管中，混勻；從中吸取0.5ml菌液轉(zhuǎn)移到另裝有5ml上述嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)基的試管，置于75℃振蕩培養(yǎng)7天。然后將菌體轉(zhuǎn)移至裝有100ml上述嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)基的錐形瓶中75℃振蕩培養(yǎng)7天。

離心收集3ml菌體，用axygen基因組提取試劑盒(杭州維特潔生化技術(shù)有限公司)提取嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)引物設(shè)計及pcr擴(kuò)增酶基因制備重組載體

thermusthermophilushb8基因組已經(jīng)測序完成，在基因組中含有一個可能的嗜熱蛋白酶基因ttha0724，如序列表seqidno.1所示，包含1305bp，編碼434aa，如序列表seqidno.2所示。經(jīng)signalp信號肽在線分析工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)分析確定其中第1～19位氨基酸序列為信號肽序列，在大腸桿菌中表達(dá)時需要去除這段序列，同時去除了第20位的cys，共去除蛋白n末端的20個氨基酸序列。因此，pcr上游引物的設(shè)計是從序列表seqidno.1所示的第61位核苷酸開始(第61～63位核苷酸編碼第21位氨基酸)，下游引物中不包含終止密碼子(如序列表seqidno.1所示的第1303～1305位核苷酸)，使基因的3’端融合了載體上編碼6xhis標(biāo)簽序列(6xhis標(biāo)簽的核苷酸序列見pet22b的質(zhì)粒圖譜)，它是表達(dá)的該蛋白的純化標(biāo)簽。其編碼的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示的第21～434位氨基酸序列，共414aa，即本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶。引物序列如下：

嗜熱中性蛋白酶基因的上游引物：

aatctaggatccccagaccccaccg，橫線處為限制酶bamhi識別位點；

嗜熱中性蛋白酶基因的下游引物：

aggtgtctcgagggggaagcagtaggtg，橫線處為限制酶xhoi識別位點。

設(shè)計好的引物委托上海生工生物工程有限公司合成。利用合成的引物，通過pcr法以步驟(1)制備的thermusthermophilushb8基因組為模板擴(kuò)增得到嗜熱中性蛋白酶基因。

pcr反應(yīng)：在100μl反應(yīng)體系中含2μl染色體dna，1μl上游引物，1μl下游引物，46μl超純水，50μl2×easytaq酶混合液(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。每個循環(huán)中95℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸80s，共30個循環(huán)。pcr反應(yīng)結(jié)束后以1.0％(g/ml)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測產(chǎn)物，分子量與預(yù)期的大小一致(1245bp)。pcr產(chǎn)物使用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的dna片段凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化的嗜熱中性蛋白酶基因片段。

利用bamhi和xhoi切割位點將純化后的嗜熱中性蛋白酶基因重組到表達(dá)載體pet22b中，連接后成為重組表達(dá)質(zhì)粒，用于在大腸桿菌中產(chǎn)生重組嗜熱中性蛋白酶。

上述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建步驟具體如下：

雙酶切反應(yīng)：將上述得到純化的嗜熱中性蛋白酶基因與表達(dá)載體pet22b分別用bamhi和xhoi進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系50μl：

40μl樣品

5μl限制性內(nèi)切酶，其中bamhi和xhoi各2.5μl

5μl限制酶切緩沖液k

混合，37℃酶切6小時，酶切反應(yīng)完成后，在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在紫外燈下從膠中切下目標(biāo)dna帶，使用dna凝膠回收試劑盒回收酶切后的表達(dá)載體pet22b片段和嗜熱中性蛋白酶基因片段。

酶切后的嗜熱中性蛋白酶基因片段與表達(dá)載體pet22b片段的連接：取1μl上述步驟回收的酶切后的表達(dá)載體pet22b片段，加入10倍摩爾量的酶切后的嗜熱中性蛋白酶基因片段，加入1μlt4dna連接酶緩沖液，0.5μlt4dna連接酶(購自大連寶生物工程有限公司)，無菌水補(bǔ)足至10μl，混勻后于16℃水浴連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌transetta(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含終濃度為100μg/ml氨芐青霉素和30μg/ml氯霉素的lb瓊脂平板，于37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接菌于含100μg/ml氨芐青霉素和30μg/ml氯霉素的5mllb液體培養(yǎng)基，在37℃、180rpm下振蕩培養(yǎng)6h，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi酶切質(zhì)粒鑒定重組質(zhì)粒，得到大小兩個片段，其大小分別與表達(dá)載體pet22b和嗜熱中性蛋白酶基因片段大小一致。質(zhì)粒的提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及外源dna的轉(zhuǎn)化方法參照“分子克隆實驗指南”(第三版，科學(xué)出版社，2002年)。

(3)重組嗜熱中性蛋白酶的表達(dá)與制備

上述重組表達(dá)質(zhì)粒可轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)系列細(xì)胞中，如bl21(de3)、bl21(de3)plyss、bl21(de3)plyse、rosetta(de3)及transetta(de3)細(xì)胞等，獲得高表達(dá)的嗜熱中性蛋白酶。

在本實施例中使用大腸桿菌菌株bl21(de3)、bl21(de3)plyss及transetta(de3)為宿主細(xì)胞，優(yōu)化為transetta(de3)得到可高效表達(dá)嗜熱中性蛋白酶的工程菌jd-tp，具有抗氨芐青霉素和氯霉素兩種抗性，表達(dá)的酶蛋白是可溶性蛋白。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法參照“分子克隆實驗指南”(第三版，科學(xué)出版社，2002年)。

將上述構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株bl21(de3)和bl21(de3)plyss，分別涂布含終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的lb固體平板和含終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素和30μg/ml的氯霉素的lb固體平板，于37℃倒置培養(yǎng)過夜。分別挑取表達(dá)宿主菌為大腸桿菌bl21(de3)、bl21(de3)plyss及transetta(de3)各一個單菌落分別接菌于含100μg/ml氨芐青霉素【表達(dá)宿主菌為bl21(de3)】及100μg/ml氨芐青霉素和30μg/ml氯霉素【表達(dá)宿主菌為bl21(de3)plyss及transetta(de3)】的5mllb液體培養(yǎng)基，在37℃、180rpm下振蕩培養(yǎng)至od600為0.8，加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度0.25mmol/l，于25℃、180rpm下振蕩培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)嗜熱中性蛋白酶的表達(dá)。以6000rpm離心10分鐘，收集菌體，按1g濕菌體加入10ml緩沖液的量加入50mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0)重懸菌體，置冰水浴中超聲波破碎細(xì)胞(功率約200w)3分鐘，12000rpm離心20min所得上清液，按實施例2(1)中蛋白酶活力的測定方法測上清液的蛋白酶活力，分別為53.6、95.4和125.2u/ml，因此優(yōu)化大腸桿菌菌株transetta(de3)為表達(dá)本發(fā)明嗜熱中性蛋白酶的宿主菌，構(gòu)建的重組工程菌命名為jd-tp。

挑取上述工程菌jd-tp單菌落，接種于5mllb液體培養(yǎng)基(含終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素和30μg/ml的氯霉素)中，在37℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)過夜。按1：100(體積比)的接種量接種于5mllb液體培養(yǎng)基(含終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素和30μg/ml的氯霉素)中，在37℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)至od600為2.0左右。重新按1：100(體積比)的接種量接種于500mllb培養(yǎng)基(含終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素和30μg/ml的氯霉素)，在37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至od600為0.8(約2～3小時)，加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度0.2mmol/l，于20℃、180rpm下振蕩培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)嗜熱中性蛋白酶的表達(dá)。

以6000rpm離心10分鐘，收集菌體，按1g濕菌體加入10ml緩沖液的量加入50mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0)重懸菌體，置冰水浴中超聲波破碎細(xì)胞(功率約200w)20min，12000rpm離心20min所得上清液置于70℃水浴中熱處理半小時，可以使部分大腸桿菌雜蛋白變性沉淀，12000rpm離心20min所得上清液，即為嗜熱中性蛋白酶粗酶液。

我們在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時即設(shè)計將嗜熱中性蛋白酶的c末端融合了his6標(biāo)簽，因此可以用ni-nta親和層析柱純化得到本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶：向上述嗜熱中性蛋白酶粗酶液中滴加5mol/lnacl至終濃度為0.4mol/l，混勻后用0.45μm微孔濾膜過濾雜質(zhì)，將濾液加入到層析柱中，調(diào)低流速至0.6ml/min，使嗜熱中性蛋白酶充分與ni結(jié)合，重復(fù)上柱2次。用10倍柱體積20mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0)洗去未結(jié)合的蛋白；用5倍柱體積含20mmol/l咪唑的20mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0)洗去非特異結(jié)合的雜蛋白。然后用2.5倍柱體積的含50、100、150及200mmol/l咪唑的20mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0)洗脫，流速控制在0.4ml/min，收集洗脫液，應(yīng)用sds-page檢測，結(jié)果如圖2所示，嗜熱中性蛋白酶主要在含100mmol/l咪唑的洗脫液中，在46kda處有一蛋白帶，與嗜熱中性蛋白酶的理論大小相符。將含嗜熱中性蛋白酶的洗脫液裝入透析袋中，用1l20mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0)于4℃透析，每隔2h換透析液，重復(fù)透析3次。透析后的樣品用聚乙二醇20000濃縮，得到純化的嗜熱中性蛋白酶。

上述純化后的嗜熱中性蛋白酶在85℃溫育30min，經(jīng)過自催化剪切去除n端前肽，獲得成熟的嗜熱中性蛋白酶，經(jīng)ni-nta親和層析柱純化獲得成熟的嗜熱中性蛋白酶，操作步驟同上，結(jié)果如圖3所示，成熟的嗜熱中性蛋白酶主要在含100mmol/l咪唑的洗脫液中，在35kda處有一蛋白帶。將純化后的蛋白用濃縮管ultracel-10k(millipore)濃縮至1mg/ml，通過質(zhì)譜分析蛋白分子量，如圖1所示，確定成熟的嗜熱中性蛋白酶為如序列表seqidno.2所示的第110位氨基酸開始至434位氨基酸結(jié)束，包含325aa(如序列表seqinno.3所示)，理論分子量約35kda，與sds-page檢測的結(jié)果相符。

本發(fā)明利用pcr方法獲得嗜熱細(xì)菌thermusthermophilushb8的嗜熱中性蛋白酶基因，使用該基因表達(dá)出嗜熱中性蛋白酶。所述的嗜熱中性蛋白酶以可溶性蛋白形式表達(dá)，使用ni-nta親和層析法純化制備了本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶。將純化的嗜熱中性蛋白酶于85℃溫育30min，經(jīng)自催化剪切，ni-nta親和層析法純化制備了本發(fā)明的成熟的嗜熱中性蛋白酶。

實施例2：重組嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶的性質(zhì)

(1)最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

溫度是影響酶催化活力的重要因素。以酪蛋白為底物，在50-90℃范圍內(nèi)測定本發(fā)明所述重組嗜熱中性蛋白酶的活力，以酶的相對活力對溫度作圖，如圖4所示，嗜熱中性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為85℃，并且在65～90℃范圍內(nèi)，保持80％以上的酶活力。成熟的嗜熱中性蛋白酶的活力-溫度曲線見圖5，其最適反應(yīng)溫度為75℃，并且在65-85℃范圍內(nèi)，酶活力都維持在較高水平，接近最高活力；在50-90℃范圍內(nèi)成熟的嗜熱中性蛋白酶保持了70％以上的酶活力，有較寬的反應(yīng)溫度范圍。

蛋白酶活力的檢測：使用酪蛋白作為底物，用folin酚法測定蛋白酶活性。用于該測定的酪蛋白底物的制備：將1g酪蛋白溶于100ml0.2mol/l磷酸鹽緩沖液(ph7.5)中配置成含1％酪蛋白的底物溶液。取0.05ml底物溶液在85℃溫育5min，之后加入0.05ml的酶溶液，于85℃反應(yīng)15min。之后加入0.1ml10％三氯乙酸(tca)溶液終止反應(yīng)，室溫下靜置15min，于12000rpm離心10min，取0.1ml上清液，加入0.5ml的0.4mol/l碳酸鈉和0.1ml的folin酚溶液混勻，靜置20min后用uv-1601分光光度計于655nm處測定吸光度值，對照為在加酶液前先加10％tca，其余處理相同。在上述反應(yīng)條件下，酶活力單位定義為1min水解酪蛋白釋放1μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位。

將濃度為0.1mg/ml的嗜熱中性蛋白酶在85℃中保溫不同時間，按上述蛋白酶活力的檢測方法分別測定嗜熱中性蛋白酶及成熟的嗜熱中性蛋白酶的殘余活力。嗜熱中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖6所示，嗜熱中性蛋白酶在85℃的半衰期為8d；在第9天時，酶依然保留約46％的酶活力。成熟的嗜熱中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示，成熟的嗜熱中性蛋白酶在85℃的半衰期為60h；在第4天時，酶依然保留約40％的酶活力。說明本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶和成熟的嗜熱中性蛋白酶具有非常好的熱穩(wěn)定性。

(2)最適反應(yīng)ph和ph穩(wěn)定性

以酪蛋白為底物，85℃下測定嗜熱中性蛋白酶和成熟的嗜熱中性蛋白酶在ph4.0～12.0范圍內(nèi)的活力，使用的緩沖液是50mmol/l檸檬酸-檸檬酸鈉(ph4.0～6.0)，na2hpo4-nah2po4緩沖液(ph6.0～8.0)，tris-hcl緩沖液(ph8.0～9.0)，甘氨酸-naoh緩沖液(ph9.0～11.0)，碳酸氫鈉-naoh緩沖液(ph11～12)。嗜熱中性蛋白酶的活力-ph曲線如圖8所示，嗜熱中性蛋白酶在ph6.0至11.0之間能夠有效地催化酪蛋白的水解，最適ph為7.5和11.0，在中性及堿性條件下可發(fā)揮最大催化活性。成熟的嗜熱中性蛋白酶的活力-ph曲線如圖9所示，成熟的嗜熱中性蛋白酶在ph5.0至10.0之間能夠有效地催化酪蛋白的水解，最適ph為6.5，在中性條件下發(fā)揮最大催化活性。

將0.1mg/ml的酶液分別于上述不同的ph值的緩沖液(ph4.0～12.0)中85℃溫育1h后，測定剩余的酶活性。以處理前的酶活力定義為100％，分別計算不同ph值條件下剩余酶活性。嗜熱中性蛋白酶的ph穩(wěn)定性曲線如圖10所示，嗜熱中性蛋白酶在ph5.0～10.0的范圍內(nèi)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，活力沒有損失，都有一定程度的增加。成熟的嗜熱中性蛋白酶的ph穩(wěn)定性曲線如圖11所示，成熟的嗜熱中性蛋白酶在ph6.0～11.0的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，剩余酶活力保持在70％以上。相比于嗜熱中性蛋白酶，成熟的嗜熱中性蛋白酶的穩(wěn)定性有所降低。

(3)金屬離子對嗜熱中性蛋白酶活力的影響

按實施例2(1)中蛋白酶的活力檢測方法，在嗜熱中性蛋白酶與底物酪蛋白進(jìn)行反應(yīng)的體系中，分別加入不同的金屬離子(cu²⁺，ca²⁺，ba²⁺，k⁺，na⁺，fe³⁺，mg²⁺和ni²⁺)，金屬離子的終濃度為1mmol/l，以不加金屬離子的反應(yīng)體系中的酶活力定義為100％，分別測定加入金屬離子后各反應(yīng)體系中蛋白酶的相對酶活力。結(jié)果如表1所示，k⁺、cu²⁺、ni²⁺和mg²⁺可一定程度地提高酶活力，ca²⁺和ba²⁺對酶活力沒有影響。fe³⁺對酶有一定抑制作用(約10％)。因此，本發(fā)明的嗜熱中性蛋白酶是金屬離子非依賴型酶。

表1.金屬離子對酶活力的影響

實施例3：嗜熱中性蛋白酶降解蛋白質(zhì)的分析

為了檢測嗜熱中性蛋白酶對不同蛋白底物的降解能力，將50μl0.1mg/ml嗜熱中性蛋白酶分別與5mg/ml的酪蛋白和2.5mg/ml的bsa等體積混合于85℃溫育15min后利用sds-page觀察底物降解情況(圖12)。電泳顯示酪蛋白和bsa在15min內(nèi)全部降解，說明嗜熱中性蛋白酶具有很強(qiáng)的蛋白水解能力，在降解蛋白質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有很高的應(yīng)用潛力。

本發(fā)明所公開的內(nèi)容，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域研究人員在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。

<110>吉林大學(xué)

<120>一種嗜熱中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其應(yīng)用

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