本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種吡嗪酰胺水解酶及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：吡嗪酰胺是世界衛(wèi)生組織推薦用于治療結(jié)核病的一線藥物之一。該藥物本身沒(méi)有抗菌活性，而是在病原菌體內(nèi)被水解成吡嗪酸，從而在酸性ph環(huán)境中持續(xù)殺死存在于人群中結(jié)核桿菌的能力，可將治療時(shí)間由9-12個(gè)月縮短至6個(gè)月。盡管吡嗪酰胺在治療結(jié)核病方面的重要性已經(jīng)被人們認(rèn)可，但其作用機(jī)制可能是所有抗結(jié)核藥物中最不了解的。目前，越來(lái)越多的耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)已經(jīng)對(duì)吡嗪酰胺的抗菌活性構(gòu)成主要挑戰(zhàn)，吡嗪酰胺是沒(méi)有顯著抗菌活性的前體藥物，被代謝為其活性形式——吡嗪酸，通過(guò)由吡嗪酰胺水解酶基因編碼的水解酶活性水解生成吡嗪酸，用于殺死結(jié)核分枝桿菌。吡嗪酰胺水解酶中的突變是目前結(jié)核分枝桿菌中吡嗪酰胺抗性的主要機(jī)制。吡嗪酰胺水解酶已經(jīng)在許多微生物中發(fā)現(xiàn)，例如大腸桿菌，釀酒酵母。該酶可將吡嗪酰胺轉(zhuǎn)化為吡嗪酰酸。人們研究了某些細(xì)菌吡嗪酰胺水解酶的生物化學(xué)特征，并且已經(jīng)很好地表征了結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺水解酶mtpnca，但是在假諾卡氏菌(pseudonocardiacarboxydivorans)中吡嗪酰胺水解酶沒(méi)并沒(méi)有得到表征。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人在pseudonocardiacarboxydivorans中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)開放閱讀框架(orf)，與mtpnca具有62％的序列同源性。發(fā)明人克隆并表達(dá)了該基因，意外發(fā)現(xiàn)其是一種活性較高的吡嗪酰胺水解酶，特別適合治療已產(chǎn)生吡嗪酰胺耐藥性的患結(jié)核病的人群。因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種新的吡嗪酰胺水解酶及其編碼基因和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究并不懈努力，最終獲得了如下技術(shù)方案：一種吡嗪酰胺水解酶，該水解酶具有seqidno.1所示的氨基酸序列；或該水解酶是在seqidno.1所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上缺失、替換、插入或/和添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的保守性突變而獲得的具有水解吡嗪酰胺活性的保守性變異體。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所提供的吡嗪酰胺水解酶屬于半胱氨酸水解酶超家族中的一員。seqidno.1所示的氨基酸序列由191個(gè)氨基酸殘基組成。為了使上述蛋白質(zhì)便于純化，可在上述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基氨基酸序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述吡嗪酰胺水解酶蛋白質(zhì)可以人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述中的蛋白質(zhì)的編碼基因還可通過(guò)將seqidno.1所示的氨基酸序列中，缺失、置換、插入或添加一個(gè)至幾個(gè)并保持原有酶活性，或者連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明還提供了一種吡嗪酰胺水解酶的編碼基因，該基因編碼：(a)具有seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(b)具有衍生自缺失、置換、插入或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的seqidno.1所示的氨基酸序列并具有吡嗪酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步地，所述吡嗪酰胺水解酶的編碼基因?yàn)?i)、(ii)或(iii)的dna分子：(i)具有seqidno.2所示的核苷酸序列的dna分子；(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)所述的核苷酸序列雜交且編碼具有水解吡嗪酰胺活性的蛋白質(zhì)的dna分子；(iii)與(i)或(ii)所述dna分子的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的dna分子。進(jìn)一步，所述嚴(yán)格條件為鈉離子濃度為50-300mm的溶液中，反應(yīng)溫度為50-68℃。例如：在進(jìn)行分子雜交的過(guò)程中，可以為在6×ssc、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的sds的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×ssc，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的sds和1×ssc、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的sds各洗膜一次。其中sds的中文名稱為十二烷基硫酸鈉，1×ssc包括0.15mol/lnacl和0.015mol/l檸檬酸；sds以及不同濃度倍數(shù)的ssc均為本領(lǐng)域的常用試劑。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供一種重組載體，包括上述的吡嗪酰胺水解酶的編碼基因。所述重組載體為將上述編碼基因插入出發(fā)載體(例如：pet28a)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化體，包含上述的重組載體。轉(zhuǎn)化體可以為重組菌，例如，將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體(例如：pet28a載體)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌。本發(fā)明還提供一種引物對(duì)，用于擴(kuò)增上述的吡嗪酰胺水解酶的編碼基因全長(zhǎng)及其任意片段。例如：引物對(duì)的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。上述所述蛋白質(zhì)、上述所述編碼基因、上述所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌中任一種在降解吡嗪酰胺和煙酰胺中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外，本發(fā)明還可以將吡嗪酰胺與吡嗪酰胺水解酶聯(lián)合用于治療結(jié)核病，特別是對(duì)于已產(chǎn)生吡嗪酰胺耐藥性的患結(jié)核病的人群。因此，本發(fā)明還提供一種治療結(jié)核病的藥物組合物，該藥物組合物包含上述的吡嗪酰胺水解酶。進(jìn)一步優(yōu)選地，該藥物組合物除含有上述的吡嗪酰胺水解酶外，還包含吡嗪酰胺。一種上述的吡嗪酰胺水解酶在水解酰胺鍵中的應(yīng)用。例如：用于水解吡嗪酰胺，煙酰胺等。在具體應(yīng)用的過(guò)程中，可以采用下面的方法：以吡嗪酰胺，煙酰胺為底物，在中性ph8.5條件，利用吡嗪酰胺水解酶對(duì)吡嗪酰胺，煙酰胺進(jìn)行酶解。所述的降解條件包括：反應(yīng)體系的溫度35-50℃，優(yōu)選為45℃，反應(yīng)體系的ph值為7.5-9.0，優(yōu)選為8.5。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)吡嗪酰胺水解酶的方法，該方法包括培養(yǎng)上述述的轉(zhuǎn)化體并由培養(yǎng)產(chǎn)物中收集吡嗪酰胺水解酶。收集的吡嗪酰胺水解酶可以進(jìn)一步進(jìn)行純化。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述的蛋白具有水解吡嗪酰胺的活性，屬于一種酰胺水解酶。并且該蛋白與其他已表征的吡嗪酰胺水解酶的氨基酸序列相比，相似性不大于65％，屬于半胱氨酸水解酶超家族中一員。本發(fā)明所述吡嗪酰胺水解酶最適天然底物為煙酰胺，且具有在中性及偏堿性ph條件下活性高的特性。本發(fā)明對(duì)吡嗪酰胺(pza)也有很好的酶活，實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明所述吡嗪酰胺水解酶，以pza為底物，在45℃、ph為8.5的條件下具有最高的酶活性，為17.20u/mg蛋白,一個(gè)酶活單位為每分鐘生成1μmol產(chǎn)物所需的酶量；該酶在35-50℃溫度范圍內(nèi)，酶活均較高；在ph6.5至ph10.0的ph值范圍內(nèi)，酶活均較高。該酶在ph7.5-10.0的條件下保持12h，依然有80％以上的酶活性，具有很好的ph耐受性。附圖說(shuō)明圖1為pnca-pse蛋白純化前后的sds-page電泳圖。圖2為吡嗪酰胺水解酶的活性隨溫度的變化的結(jié)果。圖3為吡嗪酰胺水解酶的活性隨ph的變化的結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、蛋白及基因的制備與功能1、pseudonocardiacarboxydivorans總dna的提取：采用pseudonocardiacarboxydivorans取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50mmtris緩沖液中(ph8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mmedta(ph8.0)，混勻后37℃放置20min；之后加入2毫升質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的sds，55℃放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍體積無(wú)水乙醇，回收dna，分別用70％無(wú)水乙醇洗2次；沉淀真空干燥，溶于0.5毫升te緩沖液(ph8.0，10mmtris，1mmedta)。2、合成seqidno.2所示的核苷酸序列根據(jù)seqidno.2所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物對(duì)如下：正向引物：5′-cgcggatccatggcacgagcgttgatcgtcgtc-3′，如seqidno.3所示；反向引物：5′-gggttcgaatcaggcggtgcggagctccacgc-3′，如seqidno.4所示；正向引物的下劃線部分為bamhi的酶切位點(diǎn)，反向引物的下劃線部分為hindш酶切位點(diǎn)。以pseudonocardiacarboxydivorans總dna為模板，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系：10×緩沖液5μldntp4μlextaqdna聚合酶0.5μl正向引物1μl反向引物1μl模板0.5μl水38μlpcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，并用dna純化試劑盒(超薄離心柱型，天根公司生產(chǎn))純化。將純化的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明pcr產(chǎn)物的序列包括seqidno.2所示1-576位，并將其命名為pnca-psedna片段。3、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)將上述測(cè)序正確的pcr產(chǎn)物或人工合成的片段用bamhi和hindш雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切產(chǎn)物。2)將質(zhì)粒pet28a(cat.n069864-3,novogen)用bamhi和hindш雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切產(chǎn)物。3)將步驟1)的酶切產(chǎn)物和步驟2)的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將得到的轉(zhuǎn)化子用上述的正向引物和反向引物進(jìn)行菌落pcr，篩選到含有pnca-pse基因的重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，在pet28a的bamhi和hindш酶切位點(diǎn)之間插入了pnca-pse片段，該片段包括seqidno.2的自5′端起第1至576位的核苷酸，插入方向正確，將該重組質(zhì)粒命名為(pet28a-pnca-pse)。4、工程菌的制備將質(zhì)粒pet28a-pnca-pse電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌transetta(de3)(cat.n0cd801,全式金公司)后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，得到含有pet28a-pnca-pse質(zhì)粒的工程菌，記作transetta/pet28a-pnca-pse。用pet28a代替pet28a-pnca-pse，轉(zhuǎn)化大腸桿菌transetta(de3)，步驟同上，得到含有pet28a的重組菌，作為對(duì)照菌。將轉(zhuǎn)入pet28a的陽(yáng)性重組菌記作transetta/pet28a。5、吡嗪酰胺水解酶的制備和純化his60nisuperflowresin純化柱購(gòu)自takara公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為635660。gehitrapdesalting純化柱購(gòu)自gehealthcare公司，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為17-1408-01。將上述步驟4制備的transetta/pet28a-pnca-pse陽(yáng)性重組菌培養(yǎng)于含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3h；od600＝0.7時(shí)，加入iptg至其在lb培養(yǎng)基中的終濃度0.2mm，轉(zhuǎn)至18℃繼續(xù)培養(yǎng)16h。在3800rpm、15min條件下離心收集菌體，懸浮于pbs溶液(50mmtris-hcl，ph8.0，0.5mnacl，5mm咪唑)中，于冰浴中超聲破碎(60w，10min；超聲1s，停止2s)，之后12000rpm離心10min除去細(xì)胞碎片，取上清液；將上清液過(guò)his60nisuperflowresin純化柱，用5ml超純水沖洗，再用10ml溶液a(50mmtris-hcl，ph8.0，0.5mnacl，25mm咪唑)漂洗，最后用5ml溶液b(50mmtris-hcl，ph8.0，0.5mnacl，500mm咪唑)洗脫，收集洗脫液。然后將洗脫液用脫鹽柱gehitrapdesalting進(jìn)行脫鹽處理，用溶液c(50mmtris-hcl，ph8.5)進(jìn)行洗脫，得到pnca-pse純酶液。將步驟4制備的對(duì)照菌采用相同的步驟進(jìn)行培養(yǎng)和純化，得到的溶液作為對(duì)照酶液。sds-page電泳顯示純化的pnca-pse蛋白的分子量約為23kda，符合理論推斷的23kda。結(jié)果如圖1所示，圖1中，泳道m(xù)表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(100,75,50,37,25kda)；泳道1表示大腸桿菌transetta/pet28a-pnca-pse破菌后的上清液；泳道2表示ni-nta柱純化后的pnca-pse蛋白；泳道3表示gedesalting脫鹽柱純化后的pnca-pse蛋白?？梢钥闯鲆呀?jīng)獲得了pnca-pse蛋白。同時(shí)進(jìn)行了對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)，但對(duì)照菌并沒(méi)有得到目的蛋白。實(shí)施例2、以吡嗪酰胺為底物驗(yàn)證蛋白功能酶活單位定義為1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol吡嗪酸所需的酶量。(一)最適溫度用ph8.5的50mmtris-hcl緩沖液稀釋實(shí)施例1的步驟5中的pnca-pse純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。將稀釋后的酶液記作稀釋酶液。溶液a組成：由50mm，ph8.5的50mmtris-hcl緩沖液和吡嗪酰胺溶液組成；吡嗪酰胺在溶液a中的濃度為100μm。實(shí)驗(yàn)組：活性測(cè)定反應(yīng)體系為0.5ml，由0.475ml溶液a和0.025ml稀釋酶液；反應(yīng)體系的ph值為8.5；反應(yīng)體系在特定溫度范圍(25-60℃)內(nèi)溫育10min后，加入0.05ml10％三氯乙酸終止反應(yīng)，過(guò)0.22μm的有機(jī)濾膜，然后上樣20μl于hplc,檢測(cè)產(chǎn)物吡嗪酸的量。液相條件：c18色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：268nm柱溫：30℃流速：0.5ml/min流動(dòng)相：甲醇：水(10:90)結(jié)果如圖2a所示。圖2a表明，吡嗪酰胺水解酶具有酰胺酶活性。在45℃條件下，吡嗪酰胺水解酶具有最高的酶活性；將此溫度下的酶活反應(yīng)體系吡嗪酸產(chǎn)物的峰面積作為相對(duì)活性100％，其他溫度下酶活反應(yīng)體系吡嗪酸產(chǎn)物的峰面積與此最高酶活體系吡嗪酸產(chǎn)物的峰面積的比值作為相對(duì)活性。在30-50℃條件下均具有50％以上的活性。對(duì)照組：以對(duì)照菌transetta/pet28a獲得的蛋白(記作對(duì)照酶液)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個(gè)溫度條件下，對(duì)照酶液都沒(méi)有水解吡嗪酰胺的活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。(二)最適ph如下各組中的稀釋酶液均是用各組中的緩沖液稀釋實(shí)施例1的步驟5中的pnca-pse純酶液得到的。實(shí)驗(yàn)組：活性測(cè)定反應(yīng)體系為0.5ml，分別由0.475ml溶液b(b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8或b9)和0.025ml稀釋酶液組成；溶液b1的組成：50nah2po4-na2hpo4緩沖液和吡嗪酰胺(pza)；吡嗪酰胺在溶液b1中的濃度為100μm；溶液b1的ph值為5.5。溶液b2的組成：與溶液b1的組成相同，溶液b2的ph值為6.0。溶液b3的組成：與溶液b1的組成相同，溶液b3的ph值為6.5。溶液b4的組成：與溶液b1的組成相同，溶液b4的ph值為7.0。溶液b5的組成：與溶液b1的組成相同，溶液b5的ph值為7.5。溶液b6的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmtris-hcl緩沖液。溶液b6的ph值為7.5。溶液b7的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmtris-hcl緩沖液。溶液b7的ph值為8.0。溶液b8的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmtris-hcl緩沖液。溶液b8的ph值為8.5。溶液b9的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmtris-hcl緩沖液。溶液b9的ph值為9.0。溶液b10的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmglycine-naoh緩沖液。溶液b10的ph值為9.0。溶液b11的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmglycine-naoh緩沖液。與溶液b11的ph值為9.5。溶液b12的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmglycine-naoh緩沖液。溶液b12的ph值為10.0。溶液b13的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmglycine-naoh緩沖液。溶液b13的ph值為10.5。溶液b13的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmnah2po4-na2hpo4緩沖液替換為50mmglycine-naoh緩沖液。溶液b13的ph值為11.0。將反應(yīng)體系在45℃，溫育10min后，加入0.05ml10％三氯乙酸終止反應(yīng)，過(guò)0.22μm的有機(jī)濾膜，然后上樣20μl于hplc,在268nm處檢測(cè)產(chǎn)物吡嗪酸的量。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。結(jié)果如圖3a所示。吡嗪酰胺水解酶在ph為6.5至10.0之間的條件下均具有不錯(cuò)的吡嗪酰胺水解酶的活性，即可以降解吡嗪酰胺。表明吡嗪酰胺水解酶在ph8.5條件下具有最高酶活性。以此最高酶活反應(yīng)體系吡嗪酸產(chǎn)物的峰面積作為相對(duì)活性100％，其他ph下酶活反應(yīng)體系吡嗪酸產(chǎn)物的峰面積與此最高酶活體系吡嗪酸產(chǎn)物的峰面積的比值作為相對(duì)活性。對(duì)照組：以對(duì)照菌transetta/pet28a獲得的蛋白(記作對(duì)照酶液)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個(gè)ph條件下，對(duì)照酶液都沒(méi)有降解吡嗪酰胺的活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。(三)酶熱穩(wěn)定性用ph8.5的50mmtris-hcl緩沖液稀釋實(shí)施例1的步驟5中的pnca-pse純酶液，用稀釋后的酶液以吡嗪酰胺為底物進(jìn)行酶活測(cè)定。將稀釋后的酶液記作稀釋酶液。將稀釋酶液在37℃水浴放置孵育，每隔5分鐘取樣，測(cè)定酶的殘余活性。結(jié)果顯示，酶在37℃10min任可以保持50％殘余酶活。本發(fā)明測(cè)定了pnca-pse在37℃的熱穩(wěn)定性。結(jié)果如圖2b所示。(四)ph耐受性將稀釋酶液分別在ph7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5.10.0、10.5、11.0條件下放置12h后，以吡嗪酰胺為底物測(cè)定殘余酶活。結(jié)果顯示ph7.5-10.0條件下仍然具有60％以上的相對(duì)酶活。說(shuō)明該酶具有良好的ph耐受性。結(jié)果如圖3b所示。(五)底物特異性將稀釋酶液分別在相同濃度(摩爾濃度為100μm)的不同底物條件下進(jìn)行酶活測(cè)定，底物分別為吡嗪酰胺、煙酰胺、異煙酰胺、丙酰胺、異丁酰胺、苯甲酰胺。以不同酰胺底物測(cè)得酶活，僅吡嗪酰胺與煙酰胺測(cè)出酶活，其中對(duì)煙酰胺的酶活最高，為36.25u/mg，對(duì)吡嗪酰胺的酶活為17.20u/mg。因此，該吡嗪酰胺水解酶對(duì)吡嗪酰胺、煙酰胺具有很強(qiáng)的底物特異性，并對(duì)這兩種雜環(huán)酰胺類底物具有較高的催化活性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>湖北大學(xué)<120>一種吡嗪酰胺水解酶與其編碼基因和應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>191<212>prt<213>pseudonocardiacarboxydivoranswsc1212<400>1metalaargalaleuilevalvalaspvalglnasnaspphecysglu151015glyglyalaleualavalalaglyglyalaalavalalaalaglyile202530glyproleualathrglyglyargaspglyargvaltyrasphisval354045valalathrargaspvalhisvalaspproglyprohispheserasp505560thrproaspphevalaspsertrpproprohiscysargalaglythr65707580proglyalaserphehisproalaleuaspvalalaproileglucys859095valpheasplysglyalatyrthrseralatyrserglypheglugly100105110alaseralaasngluserglyalaproleuglyasptrpleuthrglu115120125hisglyvalthrgluvalaspvalvalglyleualathrasphiscys130135140valargalathralaleuaspalaalaargleuglyleualathrthr145150155160valleuleuhishiscysalaglyvalalaprogluthrthrgluarg165170175alaleualaalaleuthrglualaglyvalgluleuargthrala180185190<210>2<211>576<212>dna<213>pseudonocardiacarboxydivoranswsc1212<400>2atggcacgagcgttgatcgtcgtcgacgtccagaacgacttctgcgagggcggcgccctc60gcggtggccggcggggccgccgtggccgccgggatcgggccgctcgcgaccggtggccgc120gacgggcgggtctacgaccacgtcgtcgccacccgggacgtgcacgtggacccggggccg180cacttctccgacaccccggacttcgtcgactcctggccgccgcactgccgcgcggggacg240ccgggcgcgtcgttccacccggcactggacgtggcgccgatcgagtgcgtcttcgacaag300ggcgcctacaccagcgcctactccgggttcgagggcgcgagcgcgaacgagtcgggcgcc360ccgctgggcgactggctcaccgagcacggggtgaccgaggtcgacgtcgtcggcctggcg420accgaccactgcgtccgggcgaccgcgctcgacgcggcccggctcgggctggcgacgacg480gtgctgctgcaccactgcgccggggtggcaccggagacgacggagcgggcgctcgccgcg540ctgaccgaggccggcgtggagctccgcaccgcctga576<210>3<211>33<212>dna<213>人工序列<400>3cgcggatccatggcacgagcgttgatcgtcgtc33<210>4<211>32<212>dna<213>人工序列<400>4gggttcgaatcaggcggtgcggagctccacgc32當(dāng)前第1頁(yè)12