本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一類耐熱型植酸酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物性飼料中含有大量的植酸磷，但這些植酸磷不能被單胃畜禽動(dòng)物有效地利用，造成了無機(jī)磷的浪費(fèi)，同時(shí)未被利用的磷源通過糞便排泄到環(huán)境中，導(dǎo)致了環(huán)境污染。此外，植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物胃腸道中會(huì)與多種金屬離子如鈣、鎂、鋅、鐵等以及蛋白質(zhì)鰲合形成不溶性復(fù)合物，降低了動(dòng)物對(duì)這些營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用。植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸鹽的一類酶的總稱，它可以催化肌醇六磷酸(鹽或醋)脫掉磷酸基團(tuán)，從而分解動(dòng)物飼料中的天然有機(jī)磷。在飼料中添加植酸酶可以代替部分磷酸氫鈣，同時(shí)降低動(dòng)物糞便中的磷，減少了集約化畜牧場(chǎng)排除糞便中磷對(duì)環(huán)境的污染。目前，市場(chǎng)中的植酸酶多數(shù)有比較好的活性，但是很多耐熱性能一般。通常飼料生產(chǎn)中，酶制劑與飼料混勻后在80℃左右的高溫造粒，在此過程中酶易變性失活，解決這一問題的一種方法是利用包被劑和載體來提高酶的耐熱性，但這無疑會(huì)增加酶制劑的生產(chǎn)成本，而且采用包被處理酶制劑會(huì)嚴(yán)重影響其生物利用率；另一種經(jīng)濟(jì)有效的方法就是通過改良酶的基因提高其耐熱性。從酶的基因和結(jié)構(gòu)入手，篩選得到耐熱型植酸酶對(duì)降低目前飼用植酸酶的生產(chǎn)成本，提高其利用效率具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明目的是提供了一類耐熱型植酸酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，本發(fā)明通過人工基因突變和大量篩選的方法，對(duì)大腸桿菌來源的植酸酶ghph-1（氨基酸序列seqidno：2，編碼的核苷酸序列seqidno：1）進(jìn)行改良，優(yōu)選地，首先在ghph-1的第63位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，篩選得到熱穩(wěn)定性提高的突變體ghph-c，繼續(xù)以ghph-c為模板用易錯(cuò)pcr的方法對(duì)該基因進(jìn)行二輪隨機(jī)突變，經(jīng)過大批量篩選，得到熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的突變體ghph-c1、ghph-c2、ghph-c3、ghph-c4、ghph-c5、ghph-c6和ghph-c7。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了耐熱型單位點(diǎn)植酸酶突變體ghph-c，所述的植酸酶突變體ghph-c的氨基酸序列如seqidno：3所示，所述突變體ghph-c由氨基酸序列為seqidno：2的植酸酶的第63位氨基酸由arg變?yōu)閏ys獲得。本發(fā)明提供了耐熱型雙位點(diǎn)植酸酶突變體，所述雙位點(diǎn)植酸酶突變體包括：氨基酸序列如seqidno：4所示的ghph-c1、氨基酸序列如seqidno：5所示的ghph-c2、氨基酸序列如seqidno：6所示的ghph-c3和氨基酸序列如seqidno：7所示的ghph-c4。本發(fā)明提供了耐熱型三位點(diǎn)植酸酶突變體，所述三位點(diǎn)植酸酶突變體包括氨基酸序列如seqidno：8所示的ghph-c5和氨基酸序列如seqidno：9所示的ghph-c6。本發(fā)明提供了耐熱型五位點(diǎn)植酸酶突變體ghph-c7，其具有如seqidno：10所示的氨基酸序列。本發(fā)明提供了分別產(chǎn)生所述的植酸酶突變體的編碼基因。本發(fā)明提供了含有所述的植酸酶突變體的編碼基因的重組菌株。所述重組菌株為畢赤酵母gs115。本發(fā)明提供了所述的植酸酶突變體在用于制備水產(chǎn)類養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了所述的植酸酶突變體在用于制備畜禽類養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用，所述畜禽類包括豬、肉雞、蛋雞和鴨。進(jìn)一步的：所述植酸酶突變體用于飼料中時(shí)以液體酶制劑或固體酶制劑形式混勻在飼料中使用，其使用量為每克飼料中包含1~10u植酸酶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是：本發(fā)明基于seqidno：1的植酸酶ghph-1，所述植酸酶突變體首先在第63位的氨基酸有改變，置換方式為r63c；其次可能在第10位、第29位、第138位、第172位、第207位、第243位、第287位、第297位、第307位和第397位中一個(gè)或多個(gè)位置的氨基酸有改變，相應(yīng)的置換方式為：s10n、m29f、a138l、f172w、l207e、w243p、q287s、v297m、l307p、g311k和t397e。本發(fā)明以植酸酶ghph-1為基礎(chǔ)，提供了包含r63c的單點(diǎn)突變體ghph-c，包含r63c/s10n的雙位點(diǎn)突變體ghph-c1、包含r63c/f172w的雙位點(diǎn)突變體ghph-c2、包含r63c/l207e的雙位點(diǎn)突變體ghph-c3、包含r63c/q287s的雙位點(diǎn)突變體ghph-c4；包含r63c/a138l/v297m的三位點(diǎn)突變體ghph-c5、包含r63c/f172w/g311k的三位點(diǎn)突變體ghph-c6；以及包含r63c/m29f/a138l/w243p/l307p的五位點(diǎn)突變體ghph-c7。本發(fā)明根據(jù)所取代的位置和氨基酸，與原始植酸酶ghph-1相比，改造后的突變體ghph-c以及ghph-c1、ghph-c2、ghph-c3、ghph-c4、ghph-c5、ghph-c6、ghph-c7在80℃處理3分鐘時(shí)的熱穩(wěn)定性是原來的1.9~3.3倍；同時(shí)得到的植酸酶突變體ghph-c6適應(yīng)的ph范圍更廣泛，在ph3~4的酸性環(huán)境中其相對(duì)酶活較未突變的ghph-1約提高了35%~60%，而ghph-c2和ghph-c6抵抗蛋白酶的降解能力有所提高，約為未突變的2倍。通過本發(fā)明技術(shù)方案得到的植酸酶可以有利于植酸酶在飼料中的廣泛應(yīng)用。附圖說明圖1表明本發(fā)明所述植酸酶突變體的熱穩(wěn)定性；圖2是本發(fā)明所述植酸酶突變體ghph-c6溫度曲線；圖3表明本發(fā)明所述植酸酶突變體對(duì)胃蛋白酶的耐受性。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，以下將結(jié)合較佳的實(shí)施例對(duì)本文發(fā)明做更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體實(shí)施例。以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行,或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。具體實(shí)施例中使用的試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。1.菌株和載體畢赤酵母gs115，質(zhì)粒ppic9k，大腸桿菌dh5α，大腸桿菌origamib，大腸桿菌bl21，質(zhì)粒pet21a(+)購自invitrogen公司。2．試劑與培養(yǎng)基質(zhì)粒提取試劑盒，片段純化回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；genemorphii隨機(jī)突變pcr試劑盒購自stratagene公司；氨芐青霉素，iptg等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。lb培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%nacl；md培養(yǎng)基：1.34%ynb，0.4mg/l生物素，2%葡萄糖；ypd培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；bmgy培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/l磷酸鉀緩沖液（ph6.0），1.34%ynb，0.4mg/l生物素，1%甘油；bmmy培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/l磷酸鉀緩沖液（ph6.0），1.34%ynb，0.4mg/l生物素，1%甲醇；bsm培養(yǎng)基：26.7ml85%的磷酸，0.93g二水硫酸鈣，14.9g二水硫酸鎂，4.13g氫氧化鉀，18.2g硫酸鉀，40g甘油，4.0mllpmt1。以上培養(yǎng)基為固體時(shí)加入2%的瓊脂粉。3．實(shí)驗(yàn)方法菌株培養(yǎng)條件：大腸桿菌37℃培養(yǎng)，酵母30℃培養(yǎng)。液體培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。畢赤酵母gs115轉(zhuǎn)化方法：將活化的畢赤酵母gs115接種到含有20mlypd液體培養(yǎng)基中，30℃搖瓶培養(yǎng)至od600為1.2～1.5后低溫離心收集菌體，依次用20ml冰冷無菌水和5ml濃度為1mol/l的冰冷山梨醇溶液清洗菌體，最后用1ml山梨醇溶液重懸菌體制得酵母感受態(tài)懸液。將100μl酵母感受態(tài)與10μl線性化載體混勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化的條件為1.5kv，6msec。電擊后加入1ml山梨醇溶液，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中30℃溫育1h。5000rpm離心5min，收集菌體涂布于md篩選平板上倒置培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出陽性單克隆。植酸酶活性檢測(cè)根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《gb/t18634一2009》進(jìn)行；植酸酶活性定義是指樣品在溫度37℃、ph值5.5的條件下，每分鐘從5.0mmol/l植酸鈉中釋放1μmol無機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以u(píng)表示。實(shí)施例1：植酸酶基因的合成參考ghph-1的氨基酸序列（氨基酸序列如seqidno：2所示），人工合成該基因（核苷酸序列如seqidno：1所示），根據(jù)基因5’端設(shè)計(jì)ecorⅰ的引物，根據(jù)3’端設(shè)計(jì)notⅰ的引物引物序列如下：f-ghph-ecorⅰ：5’-agaattccaatccgaaccagaattaaa-3’（seqidno:11）；r-ghph-not?。?’-agcggccgctcaaagagaacaggcaggaat-3’（seqidno:12）。以合成基因ghph-1為模板，用上述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段切膠回收，用ecorⅰ和notⅰ雙酶切，連接到pet-21a(+)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，氨芐青霉素抗性lb平板篩選陽性克隆，測(cè)序驗(yàn)證得到pet-ghph。實(shí)施例2：植酸酶定點(diǎn)突變體篩選確定大腸桿菌植酸酶ghph-1的第63位的arg為待突變位點(diǎn)，針對(duì)性的設(shè)計(jì)飽和突變引物。ghph-63f：5’-gggacattactggnnncaacgtcttgttgct-3’（seqidno:13）；ghph-63r：5’-caacaagacgttgnnnccagtaatgtcccaa-3’（seqidno:14）。其中n代表a、t、c、g四種堿基。以重組載體pet-ghph為模板，加入突變位點(diǎn)的引物，用高保真酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)dpnⅰ酶切處理后電擊轉(zhuǎn)化origamib大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含amp的lb平板上篩選陽性克隆。將單克隆接種到96孔深孔板。每個(gè)平板接入2個(gè)原始克隆為對(duì)照。每孔裝入300ullb液體培養(yǎng)基（含有100μg/ml氨芐青霉素），37℃200rpm震蕩培養(yǎng)4小時(shí)后，轉(zhuǎn)移50ul菌液到新的96孔平板保種，在平板剩余菌液中添加200ul含有iptg的lb-amp培養(yǎng)基，使iptg終濃度為1mm，氨芐青霉素終濃度為100μg/ml，37℃200rpm搖床培養(yǎng)10h誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶。將誘導(dǎo)完成的菌液在80℃水浴3min破碎后，檢測(cè)植酸酶的剩余活性。將剩余酶活高于對(duì)照的突變體基因進(jìn)行測(cè)序。最終篩選到以ghph-1為出發(fā)模板的耐熱性提高的突變體r63c（第63位氨基酸由arg突變?yōu)閏ys），命名為ghph-c（氨基酸序列如seqidno：3所示）。實(shí)施例3：植酸酶隨機(jī)突變體篩選用genemorphii隨機(jī)突變pcr試劑盒（stratagene）將上述篩選到的ghph-c進(jìn)行隨機(jī)突變，同時(shí)用高保真酶擴(kuò)增ghph-1的基因序列構(gòu)建對(duì)照，使用的引物序列如下：f-ghph-ecor?。?’-agaattccaatccgaaccagaattaaa-3’；r-ghph-not?。?’-agcggccgctcaaagagaacaggcaggaat-3’。將切膠回收后的上述pcr產(chǎn)物和pet21a(+)載體用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和notⅰ進(jìn)行雙酶切，純化后的片段和pet21a(+)連接構(gòu)建表達(dá)載體pet-phym，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21中，在含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。得到ghph-1及隨機(jī)突變體的大腸桿菌表達(dá)菌株。將單克隆接種到96孔深孔板。每個(gè)平板接入2個(gè)原始克隆為對(duì)照。每孔裝入300ullb液體培養(yǎng)基（含有100μg/ml氨芐青霉素），37℃200rpm震蕩培養(yǎng)4h后，轉(zhuǎn)移50ul菌液到新的96孔平板保種，在平板剩余菌液中添加200ul含有iptg的lb-amp培養(yǎng)基，使iptg終濃度為1mm，氨芐青霉素終濃度為100μg/ml，37℃200rpm搖床培養(yǎng)10h誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶。將誘導(dǎo)完成的菌液在80℃水浴3min破碎后，檢測(cè)植酸酶的剩余活性。將剩余酶活高于對(duì)照的突變體基因進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果獲得以下突變體：ghph-c第10位的突變體r63c/s10n（命名為ghph-c1），氨基酸序列如seqidno：4所示。ghph-c第172位的突變體r63c/f172w（命名為ghph-c2），氨基酸序列如seqidno：5所示。ghph-c第207位的突變體r63c/l207e（命名為ghph-c3），氨基酸序列如seqidno：6所示。ghph-c第287位的突變體r63c/q287s（命名為ghph-c4），氨基酸序列如seqidno：7所示。ghph-c第138位和第297位同時(shí)突變的突變體r63c/a138l/v297m（命名為ghph-c5），氨基酸序列如seqidno：8所示。ghph-c第172位和第311位同時(shí)突變的突變體r63c/f172w/g311k（命名為ghph-c6），氨基酸序列如seqidno：9所示。ghph-c第29位，第138位，第243位，第307位同時(shí)突變的突變體r63c/m29f/a138l/w243p/l307p（命名為ghph-c7），熱穩(wěn)定性較隨機(jī)突變前有明顯提高，氨基酸序列如seqidno：10所示。實(shí)施例4：耐熱型植酸酶在畢赤酵母中的表達(dá)驗(yàn)證人工合成上述篩選到的植酸酶突變體基因，并構(gòu)建到ppic9k質(zhì)粒上，得到各突變體在畢赤酵母中的表達(dá)載體ppic-phym；將各突變體的表達(dá)載體用salⅰ酶切線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母gs115中，md平板篩選得到各突變體表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化子并轉(zhuǎn)接到y(tǒng)pd平板中活化。挑取活化后的轉(zhuǎn)化子接于bmgy培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)18h后，離心獲得菌體。將適量菌體轉(zhuǎn)入bmmy培養(yǎng)基中，使菌體濃度達(dá)到od600=1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每24h添加培養(yǎng)體積1%的甲醇。誘導(dǎo)表達(dá)96h后，將培養(yǎng)液離心獲得上清，測(cè)定發(fā)酵液上清中植酸酶活力和熱穩(wěn)定性，結(jié)果顯示突變后得到的植酸酶ghph-c、ghph-c1、ghph-c2、ghph-c3、ghph-c4、ghph-c5、ghph-c6、ghph-c7在80℃處理3min后耐熱性較ghph-1分別提高了0.95倍、1.53倍、2.01倍、1.98倍、1.87倍、1.61倍、2.26倍和2.10倍。以上結(jié)果表明將ghph-c第10位的ser突變?yōu)閍sn得到的突變體；或?qū)⑵涞?72位的phe突變?yōu)閠rp得到的突變體；或?qū)⑵涞?07位的leu突變?yōu)間lu得到的突變體；或?qū)⑵涞?87位的gln突變?yōu)閟er得到的突變體；或?qū)⑵涞?38位的ala突變?yōu)閘eu，同時(shí)第297位的val突變?yōu)閙et得到的突變體；或?qū)⑵涞?72位的phe突變?yōu)閠rp，同時(shí)第311位的gly突變?yōu)閘ys得到的突變體；或?qū)⑵涞?9位的met突變?yōu)閜he，同時(shí)第138位的ala突變?yōu)閘eu，第243位的trp突變?yōu)閜ro，第307位的leu突變?yōu)閜ro得到的突變體，其耐熱性有進(jìn)一步提高。實(shí)施例5：植酸酶突變體在10l發(fā)酵罐中制備將保種于甘油管中的畢赤酵母劃線于ypd平板上，30℃倒置培養(yǎng)3天長(zhǎng)出單菌落，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落繼續(xù)在ypd平板上劃線培養(yǎng)，如此活化三代得到的畢赤酵母單菌落接種于20mlbmgy培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)24h。以2%的接種量接種到300mlbmgy培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)至od600為5，用作種子液接種發(fā)酵罐。發(fā)酵生產(chǎn)工藝：bsm培養(yǎng)基，ph4.8、溫度30℃、攪拌速率500rpm、通風(fēng)量1.5(v/v)，溶氧控制在20%以上發(fā)酵過程分為三個(gè)階段：（1）菌體培養(yǎng)階段：按8%比例接入種子液，30℃培養(yǎng)20~24h，使發(fā)酵液中甘油耗盡；（2）饑餓階段：當(dāng)碳源甘油耗盡后，暫不補(bǔ)加任何碳源，待溶氧上升至80%饑餓階段結(jié)束；（3）誘導(dǎo)表達(dá)階段：用氨水或磷酸調(diào)節(jié)ph至所需值，流加甲醇誘導(dǎo)，并且保持溶氧在20%以上，誘導(dǎo)時(shí)間為160~200h；待發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液通過板框過濾機(jī)處理得到粗酶液，用于酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用測(cè)試。實(shí)施例6：植酸酶突變體的其它酶學(xué)性質(zhì)分析按照常規(guī)方法對(duì)實(shí)施例5中得到粗酶液的ph曲線及胃蛋白酶耐受性進(jìn)行測(cè)定。對(duì)各突變體的ph曲線測(cè)定（ph3.0~8.0），ghph-c、ghph-c1、ghph-c2、ghph-c3、ghph-c4、ghph-c5和ghph-c7與未突變的植酸酶ghph-1比較，其反應(yīng)ph曲線基本無差異，最適ph均為5.0；ghph-c6的最適ph仍為5.0，但是在ph3~4條件下，其相對(duì)酶活明顯高于ghph-1（圖2），說明改造后的ghph-c6適應(yīng)的ph范圍更廣泛，尤其是在酸性環(huán)境中，能更好的發(fā)揮作用。用胃蛋白酶對(duì)植酸酶突變體進(jìn)行處理（蛋白酶：植酸酶=1：200，ph3.0，37℃處理1h），結(jié)果如圖3所示。與ghph-1相比，ghph-c、ghph-c1、ghph-c2、ghph-c3、ghph-c4、ghph-c5、ghph-c6、ghph-c7對(duì)抵抗胃蛋白酶降解的能力基本無差異，但ghph-c2和ghph-c6抗胃蛋白的能力有所提高，剩余的相對(duì)酶活力由39.86%分別提高到68.55%和72.36%。實(shí)施例7：植酸酶突變體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用試驗(yàn)產(chǎn)品：20000u/ml的液體植酸酶ghph-c6。將液體植酸酶按照每千克飼料2000u植酸酶的比例噴涂到沉水魚糧中，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)中進(jìn)行試驗(yàn)；其中對(duì)照1是普通沉水魚糧喂養(yǎng)草魚（添加10kg/t磷酸二氫鈣），對(duì)照2為沉水魚糧（添加2kg/t磷酸二氫鈣）喂養(yǎng)草魚；試驗(yàn)組為沉水魚糧（添加2kg/t磷酸二氫鈣，同時(shí)添加2000u/kg的本實(shí)施例中制備的植酸酶ghph-c6），試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1植酸酶突變體ghph-c6在草魚養(yǎng)殖中使用效果對(duì)照1對(duì)照2試驗(yàn)組增重率（%）298.34±12.43236.54±8.92310.67±10.63肥滿度1.961±0.0922.040±0.0731.981±0.065飼料系數(shù)1.753±0.0682.116±0.0531.672±0.091實(shí)施例8：植酸酶突變體在畜禽類養(yǎng)殖中的應(yīng)用試驗(yàn)材料：5000u/g植酸酶成品ghph-c6選取體重相近和產(chǎn)蛋性能相似的30周齡產(chǎn)蛋高峰期羅曼蛋雞1200只，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每處理組5重復(fù)，每一重復(fù)60只雞。試驗(yàn)共進(jìn)行10周，在正式試驗(yàn)進(jìn)行前預(yù)試一周，試驗(yàn)期間每天添料2次（7:00/14:00），每天光照時(shí)長(zhǎng)16h，前5周溫度為10°c，后5周溫度為15°c，每天下午16:00撿蛋并稱重。對(duì)照組基礎(chǔ)日糧（i組）參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中褐殼蛋雞（產(chǎn)蛋率＞85%）營養(yǎng)需要推薦值配制（有效磷0.36%），處理ii組在基礎(chǔ)日糧中降低有效磷至0.22%，處理iii組及處理iv組分別在處理ii組基礎(chǔ)上添加100g和300g植酸酶。每周以重復(fù)為單位觀察記錄雞的產(chǎn)蛋枚數(shù)、破蛋數(shù)、蛋重、死亡情況等，計(jì)算日平均產(chǎn)蛋率、平均蛋重、破蛋率和死亡率，結(jié)果如表2。表2植酸酶突變體ghph-c6蛋雞養(yǎng)殖中的使用效果處理產(chǎn)蛋率(%)平均蛋重(g)料蛋比破蛋率(%)死亡率(%)i96.6±0.6260.4±0.222.24±0.051.6±0.192.27±0.12ii95.7±0.4860.0±0.272.26±0.042.4±0.173.05±0.27iii96.5±0.4960.4±0.192.25±0.042.0±0.133.01±0.19iv96.8±0.5660.9±0.112.25±0.061.7±0.142.19±0.13注：同列上標(biāo)小寫字母不同者表示差異顯著（p<0.05）與未添加植酸酶的ii組相比，添加植酸酶的iii和iv組，其產(chǎn)蛋率、平均蛋重、和平均增重都有所提高，而料蛋比、破蛋率和死亡率有所降低，這說明本發(fā)明的植酸酶突變體有利于ghph-c6蛋雞的生長(zhǎng)和產(chǎn)蛋，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)增加植酸酶ghph-c6的添加量使蛋雞的生長(zhǎng)和產(chǎn)蛋狀況有進(jìn)一步改善。改良后植酸酶突變體的熱穩(wěn)定性有顯著提高，同時(shí)能改善草魚的增重狀況以及蛋雞的生長(zhǎng)產(chǎn)蛋狀況，由此推測(cè)在飼料行業(yè)中會(huì)有很好的應(yīng)用前景。以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。sequencelisting<110>青島紅櫻桃生物技術(shù)有限公司<120>一類耐熱型植酸酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用<130><160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>1233<212>dna<213>人工序列<400>1caatccgaaccagaattaaagcttgaatccgttgttattgtttctagacatggtgttcgt60gcccctactaagtttacccaacttatgcaagatgttactccagatgcctggccaacctgg120ccagttaagttaggagaattgacccctagaggtggtgaattgattgcctacttgggacat180tactggcgtcaacgtcttgttgctgatgaacttttgcctaagtgtggatgtcctcaatca240ggacaagttgctattattgccgatgttgatgaacgtacccgtaagactggagaagccttt300gctgccggtttagcccctgattgtgctattaccgttcatcatcaagccgatacctcatca360cctgatccactcttcaacccattaaagaccggagtttgtcaattagatgttgccaacgtt420actagagccattttggaaagagccggaggatctattgctgattttactggtcattaccaa480accgcctttcgtgaattggaaagagttcttaactttccacaatctaacttgtgtcttaag540cgtgaaaagcaagatgaatcatgttccttgactcaagctcttccatccgaacttaaggtt600tccgccgataacgtttccttgactggtgctgtttcattagcctctatgcttaccgaaatt660tttcttttacaacaagctcaaggtatgccagaaccaggatggggtcgtattaccgattca720catcagtggaacactcttttgtcacttcataacgcccaatttgatcttcttcaacgtacc780cctgaagttgctcgatctcgtgctactccacttctggatcttattaagaccgctttgact840cctcatccaccacaaaagcaagcctacggtgttactcttcctacctccgttttattcatt900gccggacatgatactaacttagctaacttgggaggagctttggaattaaactggaccctt960ccaggtcaaccagataacactccaccaggtggagaattggtttttgaaagatggcgtcgt1020ctttcagataactcacagtggattcaagtttcattggtttttcaaaccttgcaacaaatg1080cgtgataagactccattgtccttaaacaccccaccaggagaagttaagttgaccttggcc1140ggttgtgaagaacgtaacgcccaaggtatgtgttccttagccgggtttacccaaattgtt1200aacgaagctcgtattcctgcctgttctctttga1233<210>2<211>410<212>prt<213>人工序列<400>2glnsergluprogluleulysleugluservalvalilevalserarg151015hisglyvalargalaprothrlysphethrglnleumetglnaspval202530thrproaspalatrpprothrtrpprovallysleuglygluleuthr354045proargglyglygluleuilealatyrleuglyhistyrtrparggln505560argleuvalalaaspgluleuleuprolyscysglycysproglnser65707580glyglnvalalaileilealaaspvalaspgluargthrarglysthr859095glyglualaphealaalaglyleualaproaspcysalailethrval100105110hishisglnalaaspthrserserproaspproleupheasnproleu115120125lysthrglyvalcysglnleuaspvalalaasnvalthrargalaile130135140leugluargalaglyglyserilealaaspphethrglyhistyrgln145150155160thralaphearggluleugluargvalleuasnpheproglnserasn165170175leucysleulysargglulysglnaspglusercysserleuthrgln180185190alaleuprosergluleulysvalseralaaspasnvalserleuthr195200205glyalavalserleualasermetleuthrgluilepheleuleugln210215220glnalaglnglymetprogluproglytrpglyargilethraspser225230235240hisglntrpasnthrleuleuserleuhisasnalaglnpheaspleu245250255leuglnargthrprogluvalalaargserargalathrproleuleu260265270aspleuilelysthralaleuthrprohisproproglnlysglnala275280285tyrglyvalthrleuprothrservalleupheilealaglyhisasp290295300thrasnleualaasnleuglyglyalaleugluleuasntrpthrleu305310315320proglyglnproaspasnthrproproglyglygluleuvalpheglu325330335argtrpargargleuseraspasnserglntrpileglnvalserleu340345350valpheglnthrleuglnglnmetargasplysthrproleuserleu355360365asnthrproproglygluvallysleuthrleualaglycysgluglu370375380argasnalaglnglymetcysserleualaglyphethrglnileval385390395400asnglualaargileproalacysserleu405410<210>3<211>410<212>prt<213>人工序列<400>3glnsergluprogluleulysleugluservalvalilevalserarg151015hisglyvalargalaprothrlysphethrglnleumetglnaspval202530thrproaspalatrpprothrtrpprovallysleuglygluleuthr354045proargglyglygluleuilealatyrleuglyhistyrtrpcysgln505560argleuvalalaaspgluleuleuprolyscysglycysproglnser65707580glyglnvalalaileilealaaspvalaspgluargthrarglysthr859095glyglualaphealaalaglyleualaproaspcysalailethrval100105110hishisglnalaaspthrserserproaspproleupheasnproleu115120125lysthrglyvalcysglnleuaspvalalaasnvalthrargalaile130135140leugluargalaglyglyserilealaaspphethrglyhistyrgln145150155160thralaphearggluleugluargvalleuasnpheproglnserasn165170175leucysleulysargglulysglnaspglusercysserleuthrgln180185190alaleuprosergluleulysvalseralaaspasnvalserleuthr195200205glyalavalserleualasermetleuthrgluilepheleuleugln210215220glnalaglnglymetprogluproglytrpglyargilethraspser225230235240hisglntrpasnthrleuleuserleuhisasnalaglnpheaspleu245250255leuglnargthrprogluvalalaargserargalathrproleuleu260265270aspleuilelysthralaleuthrprohisproproglnlysglnala275280285tyrglyvalthrleuprothrservalleupheilealaglyhisasp290295300thrasnleualaasnleuglyglyalaleugluleuasntrpthrleu30531031532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