一種中性植酸酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及一種中性植酸酶突變體及其在水產(chǎn) 飼料中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 磷是魚(yú)類所必需的重要礦物元素之一，魚(yú)體對(duì)磷的需要量高于其他礦物元素但飼 料中過(guò)量的磷被認(rèn)為是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要因素之一。因此，通過(guò)提高魚(yú)類對(duì)原料中 磷的利用率，適當(dāng)調(diào)整飼料中磷的含量，使其更接近魚(yú)的需要量，來(lái)降低養(yǎng)殖魚(yú)類磷的排放 量，是減少水環(huán)境污染的重要途徑。
[0003] 植酸酶作為一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的酶制劑，可分解植酸和植酸鹽，促進(jìn)飼料中 植酸和植酸鹽的分解，使磷、磷酸根結(jié)合的內(nèi)源性酶和其它營(yíng)養(yǎng)素得以釋放和利用，減少糞 磷對(duì)環(huán)境的污染，節(jié)省無(wú)機(jī)磷酸鹽的添加。多項(xiàng)研宄證明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中植酸酶替代部分磷 酸二氫鈣表現(xiàn)出了較好的養(yǎng)殖效果和環(huán)境效益。羅琳等（2007)在基本花鱸試驗(yàn)研宄表明 用中性植酸酶部分替代磷酸二氫鈣是完全可行的，并得出中性植酸酶l〇〇〇U/kg替代80% 左右的磷酸二氫鈣綜合生長(zhǎng)效果最佳，也證明中性植酸酶存在一定的廣譜應(yīng)用性。近期研 宄還表明中性植酸酶在有胃和無(wú)胃水產(chǎn)動(dòng)物均表現(xiàn)較好性能，可以在水產(chǎn)動(dòng)物胃腸道中釋 放大量的有效磷。
[0004] 但當(dāng)前市場(chǎng)上的植酸酶以酸性植酸酶為主，在pH 2. 5和5. 5條件下活性最高，而 在無(wú)胃水產(chǎn)動(dòng)物消化道中，由于沒(méi)有胃酸的分泌，消化道中PH約呈中性，不利于酸性植酸 酶發(fā)揮作用。因此目前急需開(kāi)發(fā)一種在中性PH范圍內(nèi)具有較高酶活的植酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，提供了一種中性植酸酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明通 過(guò)隨機(jī)突變的方法對(duì)植酸酶PHYA進(jìn)行改造，獲得一種突變體蛋白，其pH適用范圍更偏向中 性條件，有利于其在水產(chǎn)飼料中的廣泛應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
[0007] 所述植酸酶的一種編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供了一種植酸酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :1的植酸 酶的第87位氨基酸由Ser變?yōu)锳rg，第159位氨基酸由Gly變?yōu)長(zhǎng)ys，第198位氨基酸由 Ser 變?yōu)?Asp。
[0009] 上述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4〇
[0010] 本發(fā)明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3的植酸酶突變體基因的質(zhì) 粒。
[0011] 本發(fā)明再一方面提供了一種重組黑曲霉，是將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑曲霉中構(gòu)建得到 的。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述植酸酶突變體在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明篩選到的植酸酶突變體PHYAT3最適反應(yīng)pH為6. 5,在pH6. 5-7. 0范圍內(nèi)， 能保持80%以上的酶活，當(dāng)pH為8. 0時(shí)，仍能保持20%的酶活，取得了意料不到的技術(shù)效 果。與野生型相比，植酸酶突變體PHYAT3在中性范圍內(nèi)的酶活水平得到顯著提高，最適反 應(yīng)溫度未發(fā)生明顯變化。所述植酸酶突變體可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中，從而有利于減少飼 料中無(wú)機(jī)磷酸鹽的添加，降低養(yǎng)殖成本，同時(shí)還能有效減少水產(chǎn)動(dòng)物糞磷對(duì)環(huán)境的污染。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相對(duì)酶活曲線圖；
[0015] 圖2為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的溫度-相對(duì)酶活曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn) 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載 的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體 實(shí)施例的限定。
[0017] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1植酸酶基因的獲得
[0019] 根據(jù)公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，優(yōu)化了合成基因的密碼子并人工合成來(lái)源于 黑曲霉（Aspergillus niger)的植酸酶基因 PHYA (序列為SEQ ID NO :2)，其編碼的氨基酸 序列為 SEQ ID NO :1。
[0020] PCR引物和反應(yīng)條件如下：
[0021] 引物 I (F) :GCGCGAATTCATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0022] 引物 2(R) :TAAAGCGGCCGCTTAGGCGAAGCACTCGGC
[0023] 反應(yīng)條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸I. 5min， 30個(gè)循環(huán)后，72°C保溫10min。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，PHYA基因大小為1395bp。
[0024] 實(shí)施例2植酸酶突變體的構(gòu)建及篩選
[0025] 為了提高植酸酶PHYA的在中性條件下的酶活水平，申請(qǐng)人通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)對(duì) 該酶進(jìn)行了大量突變的篩選。
[0026] 以PHYA基因?yàn)槟０澹詫?shí)施例1所述引物1、2用GeneMorph II隨機(jī)突變PCR試 劑盒（Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、NotI進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣 酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置 培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加入150ul含有0.1 mM IPTG的 LB+Amp培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用pH 5. 0的緩沖液重懸，反復(fù) 凍融破壁，獲得含有植酸酶突變子的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0027] 分別取出40 μ 1裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊稀釋到pH 5. 0的緩沖液中， 另一塊稀釋到PH 7. 0的緩沖液中，分別加入相同pH值的20 μ 1底物，于37°C反應(yīng)30min 后，加入40ul終止液混勻以終止反應(yīng)，室溫放置IOmin顯色，分光光度計(jì)415nm處測(cè)定吸光 值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大部分植酸酶突變體在pH 5. 0條件下的酶活高于在pH 7. 0條件下的 酶活，只有少數(shù)突變體在PH 7.0條件下酶活高于在pH 5.0條件下的酶活，還有一些突變體 在pH 5.0和pH 7.0條件下的酶活水平比突變前均大幅下降。申請(qǐng)人通過(guò)對(duì)在pH 7.0條件 下的酶活水平顯著高于在pH 5. 0條件下酶活的突變體進(jìn)行DNA測(cè)序，最終獲得了能提高植 酸酶PHYA在中性pH范圍內(nèi)酶活水平的突變組合：S87R、G159K、S198D三點(diǎn)突變體和A66P、 N102R、S189R、S190P、T270K 五點(diǎn)突變體。
[0028] 將S87R、G159K、S198D三點(diǎn)突變體命名為PHYAT3,其氨基酸序列為SEQID NO :3， 其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
[0029] 將A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五點(diǎn)突變體命名為PHYAT5,其氨基酸序列為 SEQ ID NO :5,其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
[0030] 實(shí)施例3重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0031] 利用PCR分別擴(kuò)增植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5的基因片段，引物兩端引入 XbaI位點(diǎn)。引物序列如下：
[0032] 引物 3(F) ：GCTCTAGAATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0033] 引物 4(R) ：GCTCTAGATTAGGCGAAGCACTCGGC
[0034] PCR反應(yīng)條件為：94 °C變性5min ;然后94 °C變性30s，56 °C復(fù)性30s，72 °C延伸 I. 5min，30個(gè)循環(huán)后，72°C保溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PHYAT3、PHYAT5基因?yàn)?大小1395bp的片段。
[0035] 將上述獲得的植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5基因片段與表達(dá)載體pGAU分別進(jìn) 行限制性內(nèi)切酶XbaI單酶切，酶切