專利名稱：吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核菌的培養(yǎng)基及其制備方法，尤其屬于吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種傳染性疾病，隨著對(duì)病人的治療，其耐藥性病人在逐漸增多，因此，對(duì)菌陽(yáng)患者作藥敏測(cè)試必不可少。在此之前，多偏重于監(jiān)測(cè)流行病學(xué)的耐藥趨勢(shì)，只作一線藥為主(不含吡嗪酰胺)的6種藥敏測(cè)試。當(dāng)耐藥特別是耐多藥患者增加后，逐漸強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療，因此增列藥敏品種勢(shì)在必行。吡嗪酰胺(PZA)是具有滅菌、殺菌活性的一線藥，過(guò)去排除在常規(guī)藥敏測(cè)試以外，其原因在于它只能在酸性培養(yǎng)基中測(cè)試，如匡鐵吉1990年在《中國(guó)防癆通訊》上發(fā)表的《92號(hào)土豆湯瓊脂培養(yǎng)基用于吡嗪酰胺藥敏實(shí)驗(yàn)初步探討》曾就酸性培養(yǎng)基數(shù)次作過(guò)配制，都很有效，但其不足一是由于其操較繁瑣；二是當(dāng)用土豆淀粉作為原料時(shí)，由于其它相配成分不易得到。進(jìn)入基因時(shí)代以來(lái)，雖然對(duì)吡嗪酰胺(PZA)的耐藥基因pncA在5年前已有闡明，如，但Davies等和Mitchison等闡述除pncA之外尚有其它未發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)理，只查基因型法如pncA是不夠、不可靠的，還要靠表型法如BACTEC460解決之。但BACTEC設(shè)備昂貴，培養(yǎng)基和試劑全賴進(jìn)口，費(fèi)用高，不能推廣使用，另外放射核素處理難度大，污染環(huán)境。
(三)、技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種成分簡(jiǎn)單、易于配置、酸堿度值(PH)穩(wěn)定、能滿足吡嗪酰胺活性需要、使結(jié)核菌生長(zhǎng)良好并具有易制備和推廣的吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基及其制備方法。
其技術(shù)內(nèi)容吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基，由下述容積百分比的成分制備成的培養(yǎng)基磷酸二氫鉀0.15、硫酸鎂＞0.015～0.03、枸櫞酸鎂0.0375、天門冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5，為使吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基的酸堿度值(PH)穩(wěn)定，故采用氧化還原電位在1100毫伏以上，酸堿度值(PH)在2.7以下的酸化離子水，其加入量36.25～38.13，2％孔雀綠水溶液0.5～0.625、吡嗪酰胺0.005或0.01。
吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基的制備，其步驟如下(1)、將磷酸二氫鉀0.15、硫酸鎂＞0.015～0.03、枸櫞酸鎂0.0375、天門冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、2％孔雀綠水溶液0.5～0.625、吡嗪酰胺0.005或0.01與36.25～38.13酸化離子水進(jìn)行混合，其酸化離子水氧化還原電位在1100毫伏以上，酸堿度值(PH)在2.7以下；(2)、對(duì)上述混合物進(jìn)行加熱至沸騰，直至上述混合物完全溶解；(3)、采用自然冷卻法將混合液體冷卻至室溫；(4)、將經(jīng)消毒紗布過(guò)濾后的全蛋液加入并攪拌至均勻；(5)、將2％孔雀綠水溶液加入并使其混勻；(6)、用當(dāng)量的鹽酸調(diào)節(jié)其培養(yǎng)基液的酸堿度值(PH)在5.2～5.4范圍內(nèi)；(7)、將吡嗪酰胺加入到培養(yǎng)基液中使其濃度達(dá)到要求的值；(8)、分裝經(jīng)121℃高壓滅菌的試管內(nèi)，每管加含藥培養(yǎng)基5毫升；(9)、斜置血清凝固器內(nèi)，斜面高度占試管的三分之二，在90℃、1.5小時(shí)或85℃、1小時(shí)間歇兩次；(10)冷卻后，37℃無(wú)菌試驗(yàn)24小時(shí)。
培養(yǎng)基斜面顏色鮮艷，表面光滑無(wú)泡。
藥物敏感性測(cè)定按照1996年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果PZA藥敏培養(yǎng)基(凝固前)的最適pH。
酸化離子水配制的不含馬鈴薯淀粉的改良L-J培養(yǎng)基，在不同pH時(shí)，結(jié)核菌生長(zhǎng)及對(duì)PZA的敏感性見(jiàn)表1。表1 人型結(jié)核分支桿菌(H37Rv)在不同pH的PZA藥敏培養(yǎng)基中4周生長(zhǎng)情況凝固前pH不含PZA10ug/ml50ug/ml4.4 - - -4.8 - - -5.2 + + -5.4 ++ + -5.6 ++ + +-6.8(常規(guī)條件下) +++++++++注+-為50％陽(yáng)性結(jié)果顯示，在不同pH時(shí)含PZA(10、50μg/ml)或不含PZA的培養(yǎng)基上，接種人型結(jié)核分支桿菌H37Rv，4周觀察結(jié)果。當(dāng)培養(yǎng)基凝固前pH5.2～5.4時(shí)，人型結(jié)核分支桿菌在對(duì)照管上生長(zhǎng)良好，在含PZA50μg/ml的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。因此選擇pH5.2～5.4為PZA藥敏試驗(yàn)的最適酸堿度，含PZA50μg/ml為低濃耐藥管。
某些標(biāo)準(zhǔn)分支桿菌在含PZA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，見(jiàn)表2。
表2、標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)PZA的藥敏試驗(yàn) 4周觀察情況含PZA藥敏培養(yǎng)基pH5.3(凝固前)菌株10ug/ml 50ug/ml 100ug/ml不含PZAH37Rv+- - ++牛型結(jié)核分支桿菌+++ ++ ++ ++鳥(niǎo)分支桿菌 ++++ ++++++++++++胞分支桿菌 ++++ ++++++++++++偶發(fā)分支桿菌+++ +++ +++ +++恥垢分支桿菌+++ +++ +++ +++瘰癘分支桿菌+++ +++ +++ +++人型結(jié)核分支桿菌(H37Rv)在含PZA50μg/ml的酸化離子水配制的培養(yǎng)基上受抑制，牛型結(jié)核分支桿菌及其它5株非結(jié)核分支桿菌在100μg/ml藥物濃渡下仍生長(zhǎng)良好。
接種量用10-3mg/ml，在不含藥的對(duì)照管上生長(zhǎng)的菌落不呈融合狀，菌落大且粗糙。
用酸化離子水配制的PZA藥敏培養(yǎng)基，對(duì)120株臨床分離株進(jìn)行測(cè)定，其中60株門診分離株中，有3株在低濃度管內(nèi)(50μg/ml)生長(zhǎng)，5株在高濃度管內(nèi)(100μg/ml)生長(zhǎng)，PZA耐藥率為13。3％。1株標(biāo)準(zhǔn)的耐INH低濃度株，對(duì)PZA敏感，1株耐5種藥的標(biāo)準(zhǔn)株，對(duì)PZA耐藥。從患者中分離的60株中，其中15株完全耐藥株，對(duì)PZA呈高濃度耐藥。
有關(guān)細(xì)菌的接種量，我們采用了1996年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》所規(guī)定的10-3mg，與其它的藥敏試驗(yàn)相同的菌量，有利于批量操作。4周報(bào)告結(jié)果顯示超過(guò)4周后pH會(huì)有所升高，到第8周。高濃度管呈陽(yáng)性生長(zhǎng)。在酸化離子水配制藥敏測(cè)試的不含吡嗪酰胺(PZA)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)核分支桿菌菌落較改良L-J培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大且粗糙。H37Rv在含PZA10μg/ml的培養(yǎng)基上呈陽(yáng)性生長(zhǎng)，因此采用50μg/ml為低濃管，這與方松[9]的報(bào)道一致。
本發(fā)明配置簡(jiǎn)單、由于不采用馬鈴薯淀粉而采用的是酸化離子水，使得培養(yǎng)基不沉淀結(jié)塊、2％孔雀綠水溶液用量?jī)H為改良羅氏培養(yǎng)基的二分之一或不到，能滿足吡嗪酰胺活性需要、結(jié)核菌生長(zhǎng)良好、可在任何實(shí)驗(yàn)室做吡嗪酰胺(PZA)藥敏實(shí)驗(yàn)，易制備和推廣應(yīng)用，由于不采用BACTEC檢測(cè)，所以沒(méi)有放射核素，不會(huì)存在環(huán)境污染問(wèn)題。
(四)、具體實(shí)施方案吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基，由下述容積百分比的成分制備成的培養(yǎng)基磷酸二氫鉀0.15、硫酸鎂0.02、枸櫞酸鎂0.0375、天門冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、酸化離子水37.25、2％孔雀綠水溶0.5。
制備步驟如下(1)、將磷酸二氫鉀0.15、硫酸鎂＞0.015～0.03、枸櫞酸鎂0.0375、天門冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、2％孔雀綠水溶液0.5、吡嗪酰胺0.005(0.01)與37.25酸化離子水進(jìn)行混合，酸化離子水的氧化還原電位在1174毫伏，酸堿度值(PH)在2.65；(2)、對(duì)上述混合物進(jìn)行加熱至沸騰，直至上述混合物完全溶解；(3)、采用自然冷卻法將混合液體冷卻至室溫；(4)、將經(jīng)消毒紗布過(guò)濾后的全蛋液加入并攪拌至均勻；(5)、將2％孔雀綠水溶液加入并使其混勻；(6)、用當(dāng)量的鹽酸調(diào)節(jié)其培養(yǎng)基液的酸堿度值(PH)在5.2～5.4范圍內(nèi)；(7)、將吡嗪酰胺加入到培養(yǎng)基液中使其濃度達(dá)到要求的值；(8)、分裝經(jīng)121℃高壓滅菌的試管內(nèi)，每管加含藥培養(yǎng)基5毫升；(9)、斜置血清凝固器內(nèi)，斜面高度占試管的三分之二，在90℃、1.5小時(shí)；(10)冷卻后，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)做無(wú)菌試驗(yàn)24小時(shí)。
配置出的吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基斜面顏色鮮艷，表面光滑無(wú)泡。
權(quán)利要求
1.吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基，由下述容積百分比的原料制備成的培養(yǎng)基磷酸二氫鉀0.15、硫酸鎂＞0.015～0.03、枸櫞酸鎂0.0375、天門冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、酸化離子水36.25～38.13、2％孔雀綠水溶液0.5～0.25、吡嗪酰胺0.005或0.01
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基，其特征在于酸化離子水的氧化還原電位應(yīng)在1100毫伏以上，酸堿度值(PH)在2.7以下。
3.權(quán)利要求1所述的吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基的制備方法，其步驟如下(1)、將磷酸二氫鉀0.15、硫酸鎂＞0.015～0.03、枸櫞酸鎂0.0375、天門冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、2％孔雀綠水溶液0.5～0.625、吡嗪酰胺0.005或0.01與36.25～38.13酸化離子水進(jìn)行混合；(2)、對(duì)上述混合物進(jìn)行加熱至沸騰，直至上述混合物完全溶解；(3)、采用自然冷卻法將混合液體冷卻至室溫；(4)、將經(jīng)消毒紗布過(guò)濾后的全蛋液加入并攪拌至均勻；(5)、將2％孔雀綠水溶液加入并使其混勻；(6)、用當(dāng)量的鹽酸調(diào)節(jié)其培養(yǎng)基液的酸堿度值(PH)在5.2～5.4范圍內(nèi)；(7)、將吡嗪酰胺加入到培養(yǎng)基液中使其濃度達(dá)到要求的值；(8)、分裝經(jīng)121℃高壓滅菌的試管內(nèi)，每管加含藥培養(yǎng)基5毫升；(9)、斜置血清凝固器內(nèi)，斜面高度占試管的三分之二，在90℃、1.5小時(shí)或85℃、1小時(shí)間歇兩次；(10)冷卻后，在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)做無(wú)菌試驗(yàn)24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基及其制備方法。解決目前利用酸性培養(yǎng)基制備時(shí)的操作較繁瑣、配制成分多、不宜在任何實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行、檢測(cè)設(shè)備昂貴，且放射核素處理難度大，污染環(huán)境等問(wèn)題。其技術(shù)方案吡嗪酰胺藥敏培養(yǎng)基，由磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素、甘油、全蛋液、酸化離子水、2％孔雀綠水溶液、吡嗪酰胺。其制備方法對(duì)上述混合物加熱直至完全溶解；自然冷至室溫；加入全蛋液并攪勻；加入2％孔雀綠水溶液并混勻；用鹽酸調(diào)節(jié)其培養(yǎng)基的pH在5.2～5.4；加入吡嗪酰胺使其濃度達(dá)要求值；分裝經(jīng)121℃高壓滅菌試管內(nèi)，每管加5毫升；斜置血清凝固器內(nèi)，在90℃、1.5小時(shí)或85℃、1小時(shí)間歇兩次；冷卻后在37℃無(wú)菌條件下試驗(yàn)24小時(shí)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1392249SQ0213871
公開(kāi)日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月26日
發(fā)明者程冬娥, 黃喬蓉, 陳明, 曹雁閣, 黃莉紅, 陳瑛, 梁莉, 張?zhí)烀?申請(qǐng)人:武漢鋼鐵(集團(tuán))公司