結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺分子藥敏的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺分子藥敏的檢測(cè)方法，所要解決的是尋找分枝桿菌吡嗪酰胺的藥敏靶標(biāo)，在此基礎(chǔ)上提供一種吡嗪酰胺藥敏靶標(biāo)突變導(dǎo)致的吡嗪酰胺耐藥突變庫(kù)，以及通過(guò)分子藥敏技術(shù)進(jìn)行快速藥敏檢測(cè)的問(wèn)題。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單有效，臨床用戶(hù)可根據(jù)該實(shí)驗(yàn)方法，采取吡嗪酰胺的分子藥敏結(jié)果判斷對(duì)臨床結(jié)核病人的藥物敏感度進(jìn)行監(jiān)測(cè),指導(dǎo)用藥,減少耐吡嗪酰胺菌株的產(chǎn)生，給臨床應(yīng)用和科研研究提供了一種新的有效的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺分子藥敏的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺分子藥敏的檢測(cè) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病仍然是威脅人類(lèi)健康的主要傳染病之一，每年全世界有幾百萬(wàn)的新發(fā)結(jié)核 病例。我國(guó)在結(jié)核病的防控上投入了大量人力物力，盡管我國(guó)廣泛接種卡介苗(BCG)，并依 照WHO的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)治療結(jié)核病患者，但每年死于結(jié)核的人數(shù)依然徘徊于主要傳染病的前三位。 近年來(lái)，隨著耐藥結(jié)核以及耐多藥結(jié)核菌株的流行，結(jié)核與艾滋合并感染的增多，結(jié)核問(wèn)題 變得更為嚴(yán)重。持續(xù)升溫的結(jié)核問(wèn)題使得發(fā)達(dá)國(guó)家加強(qiáng)了結(jié)核基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面的 投入，包括臨床快速診斷，改良或研發(fā)新疫苗，研發(fā)新型抗結(jié)核藥物，以及研究結(jié)核桿菌同 宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制等。
[0003] 耐多藥結(jié)核和泛耐藥結(jié)核是威脅全人類(lèi)健康的重要問(wèn)題，對(duì)分離獲得的陽(yáng)性培養(yǎng) 標(biāo)本進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)耐藥監(jiān)測(cè)以及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。分枝桿菌藥敏測(cè) 試方法主要包括表型藥敏試驗(yàn)和分子藥敏試驗(yàn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展、分枝桿菌耐藥機(jī) 制研究逐步深入、相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)成為研究熱點(diǎn)，已經(jīng)建立了多種檢測(cè)分枝桿菌突變 基因的分子藥物敏感試驗(yàn)，無(wú)需培養(yǎng)，可直接檢測(cè)各種標(biāo)本，生物安全性好、檢測(cè)快速，如 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、DNA測(cè)序、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、線性探針技術(shù)、DNA芯 片技術(shù)等。
[0004] 吡嗪酰胺(PZA)是一種重要的一線抗結(jié)核藥物，無(wú)論在治療敏感結(jié)核患者還是耐 多藥結(jié)核患者中都具有顯著的殺菌活性，是一種不可或缺的藥物。有數(shù)據(jù)表明，耐多藥結(jié)核 病中吡嗪酰胺耐藥患者的比率有逐漸上升趨勢(shì)，一些國(guó)家和地區(qū)的耐藥率高達(dá)50.9%，而 耐多藥結(jié)核病患者發(fā)生吡嗪酰胺耐藥后，會(huì)進(jìn)一步惡化預(yù)后。因此，通過(guò)可靠的吡嗪酰胺藥 敏試驗(yàn)將耐多藥結(jié)核患者劃分為吡嗪酰胺耐藥者和敏感者，使用不同的治療方案，有潛在 的預(yù)后價(jià)值。
[0005] 盡管PZA的耐藥對(duì)MDR-TB治療結(jié)局有潛在重要性，但由于檢測(cè)方法的局限性，吡嗪 酰胺需在體外酸性條件下才能發(fā)揮抗菌活性，而酸性條件下結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)狀況不佳， 致使常規(guī)的絕對(duì)濃度法或比例法較難測(cè)定PZA耐藥性。PZA藥敏試驗(yàn)在結(jié)核分枝桿菌藥敏實(shí) 驗(yàn)中并不常規(guī)進(jìn)行，通常無(wú)法獲得PZA的耐藥數(shù)據(jù)。因此，尋找新型的PZA耐藥性測(cè)定新方法 尤為重要。
[0006] pH值5.5的改良羅氏培養(yǎng)基和7H10/ll瓊脂，pH值6.0的MCTEC 460、MGIT 960或 Bact/ALERT液體快速培養(yǎng)與藥敏系統(tǒng)是目前常用的PZA表型藥敏試驗(yàn)方法，但這些方法的 藥敏結(jié)果并不可靠，主要原因是PZA發(fā)揮活性所需的酸性環(huán)境抑制了結(jié)核分枝桿菌的正常 生長(zhǎng)，pH值為5.5的酸性7H10平板上約20%-25%的結(jié)核患者臨床分離株不生長(zhǎng)，pH 6.0的 BACTEC 460液體培養(yǎng)系統(tǒng)中，3.5 %的菌株不生長(zhǎng);另一原因是使用過(guò)大菌體接種劑量(超 過(guò)107cfu/ml)會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的pH值升高，使PZA失活造成假耐藥性結(jié)果。
[0007] 也有采取液體培養(yǎng)基最低抑菌濃度(MIC)法和噬菌體擴(kuò)增(phaB)法進(jìn)行PZA的藥 物敏感性試驗(yàn)。最低抑菌濃度法是將含10%0ADC的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基pH值調(diào)整 至5.9，再將待檢細(xì)菌濃度調(diào)整濁度至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?相當(dāng)于lmg/mL)，用液體培養(yǎng)基作1:500 稀釋后待檢，分別采用10個(gè)藥物濃度(0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256耶/111〇進(jìn)行?2八耐 藥性的MIC檢測(cè)，以多32ug/mL作為PZA耐藥界定濃度。采用噬菌體生物擴(kuò)增法進(jìn)行測(cè)定時(shí)， PZA藥物濃度為200ug/mL，以加藥管與對(duì)照管噬菌斑減少90%作為?24敏感株的判斷標(biāo)準(zhǔn)， 操作過(guò)程中，特別注意需要用酸性液體培養(yǎng)基稀釋(1:500)后待檢。
[0008] 由于吡嗪酰胺表型藥敏結(jié)果的不確定性和諸多弊端，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到吡嗪酰胺 的分子藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法的重要性。結(jié)核分枝桿菌編碼吡嗪酰胺酶(PZase)的pncA基因突 變是對(duì)PZA耐藥性的主要機(jī)制。測(cè)定pncA基因突變即可反應(yīng)吡嗪酰胺耐藥與否。有數(shù)據(jù)表明 平均有87%的PZA耐藥株中pncA基因發(fā)生突變。pncA基因突變雖和PZA耐藥具有高度相關(guān) 性，但pncA基因突變高度多樣性，無(wú)法在當(dāng)前分子藥敏實(shí)驗(yàn)如MTBDRplus( Ha in Lifescience)和66116乂。61'1:(〇6。116丨(1)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，必須依賴(lài)0嫩測(cè)序技術(shù)或提高測(cè) 序技術(shù)的可信度來(lái)快速檢測(cè)PZA的敏感性。雖然許多分子藥敏方法，如PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCR-SSCP)，基因芯片等已用于檢測(cè)PZA耐藥菌株的pncA突變，但這些測(cè)試相比pncA測(cè)序都 比較繁瑣而且昂貴，此外分子檢測(cè)免去了培養(yǎng)菌株的過(guò)程，可將藥敏試驗(yàn)時(shí)間縮短到1天， 因此pncA基因測(cè)序是PZA的最佳分子藥敏檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在對(duì)與結(jié)核桿菌吡嗪酰胺藥敏檢測(cè)的方法進(jìn)一步的研究，并提供一種聯(lián) 合用PCR擴(kuò)增多種吡嗪酰胺靶基因，并通過(guò)測(cè)序的方式鑒定是否吡嗪酰胺耐藥的方法。
[0010] 本發(fā)明以吡嗪酰胺的耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增、測(cè)序和序列比對(duì)為基礎(chǔ)、對(duì)來(lái)自純培養(yǎng) 物或病人肺部涂片陽(yáng)性標(biāo)本的結(jié)核分制桿菌復(fù)合群進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。吡嗪酰胺耐藥的 主要機(jī)制是編碼吡嗪酰胺酶的基因 pncA發(fā)生突變，吡嗪酰胺酶的作用是將前體藥物吡嗪酰 胺轉(zhuǎn)化成活性形式吡嗪酸(Ρ0Α)。
[0011] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的與吡嗪酰胺耐藥有關(guān)的基因。RpsA，核糖體蛋白S1 (Rvl630)是一個(gè)重要的參與反式翻譯的核糖體蛋白，參與降解有毒蛋白產(chǎn)物，是PZA藥物作 用的靶標(biāo)，該基因發(fā)生突變也會(huì)導(dǎo)致PZA耐藥結(jié)核菌株出現(xiàn)。panD，編碼天冬氨酸脫羧酶的 一個(gè)基因，又是一個(gè)新的吡嗪酰胺耐藥機(jī)制。少數(shù)耐PZA的菌株不發(fā)生pncA基因突變，而出 現(xiàn)了 rpsA和panD基因的突變，因此聯(lián)合檢測(cè)pncA、rpsA和panD的基因突變，包括上游啟動(dòng)子 區(qū)域，從分子水平提示PZA耐藥，以判斷分析是否吡嗪酰胺耐藥。
[0012] 第一方面發(fā)現(xiàn)并提供了與吡嗪酰胺耐藥有關(guān)的3個(gè)基因 pncA rpsA panD的序列， 以及檢測(cè)其突變的方法。
[0013] 整個(gè)過(guò)程分為三個(gè)步驟:從培養(yǎng)物（固體培養(yǎng)基/液體培養(yǎng)基)或直接用臨床標(biāo)本 (肺部的，涂片陽(yáng)性的，消化的）中提取DNA;用針對(duì)該三個(gè)基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，隨后對(duì)測(cè)序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析。根據(jù)突變基因 表，判讀測(cè)序結(jié)果、對(duì)吡嗪酰胺耐藥與否，簡(jiǎn)易、快速作出解釋。
[0014] 本發(fā)明的第二方面提供了一種用基因擴(kuò)增與測(cè)序比對(duì)的方法，判斷這3個(gè)基因是 否發(fā)生突變，總結(jié)了吡嗪酰胺耐藥相關(guān)的pncA rpsA panD三個(gè)靶基因常見(jiàn)的突變位點(diǎn)、并 根據(jù)這些常見(jiàn)突變位點(diǎn)判斷吡嗪酰胺分子藥敏的方法。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單有效，臨床用戶(hù)可根據(jù)該實(shí)驗(yàn)方法，采取吡嗪酰胺的 分子藥敏結(jié)果判斷對(duì)臨床結(jié)核病人的藥物敏感度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)用藥，減少耐吡嗪酰胺菌 株的產(chǎn)生，給臨床應(yīng)用和科研研究提供了一種新的有效的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 實(shí)施例1具體說(shuō)明本發(fā)明中吡嗪酰胺分子藥敏的檢測(cè)方法。
[0020] 1.試劑存儲(chǔ)及注意事項(xiàng)
[0021 ]引物/核苷酸混合物存儲(chǔ)在2-8°C，隔絕任何潛在的DNA污染源。如果需要長(zhǎng)期貯存 (超過(guò)4周），則儲(chǔ)存在_20°C條件下。為了避免反復(fù)凍融，可進(jìn)行分裝。在2_8°C儲(chǔ)存所有其他 試劑盒。不得使用過(guò)期試劑。
[0022] 必須始終將病人標(biāo)本和來(lái)自病人標(biāo)本的培養(yǎng)物視為具有潛在傳染性材料。來(lái)自高 危病人的標(biāo)本和來(lái)自這些標(biāo)本的培養(yǎng)物必須始終作標(biāo)記并在適當(dāng)?shù)陌踩h(huán)境操作。嚴(yán)格遵 守國(guó)家、地方的安全和環(huán)境法規(guī)。要求穿戴合適的防護(hù)服和手套。標(biāo)本處理和制備過(guò)程，包 括熱滅活環(huán)節(jié)，必須在二級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。在進(jìn)行熱滅活步驟之前，標(biāo)本必須在防氣溶 膠轉(zhuǎn)子內(nèi)離心處理。只能在安全柜內(nèi)打開(kāi)防氣溶膠轉(zhuǎn)子。熱滅活后，可用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)子在安全柜 之外離心標(biāo)本。擴(kuò)增時(shí)遵循通用注意事項(xiàng)，所有用于DNA提取、擴(kuò)增的試劑和材料都不得含 有DNA酶。
[0023] 2.DNA 提取
[0024] 本實(shí)施例中所述的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，其基因組抽提方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員 常用的細(xì)菌基因組分離及提取方法。
[0025] 可用固體培養(yǎng)基（如羅氏培養(yǎng)基、Middlebrook 7H10)或液體培養(yǎng)基（如BACTEC MGIT960)生長(zhǎng)的細(xì)菌，以及直接涂片陽(yáng)性的標(biāo)本(肺部標(biāo)本hDNA提取工作區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離擴(kuò)增 DNA 區(qū)。
[0026]具體的，刮取一滿(mǎn)環(huán)羅氏斜面上的分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性菌落，重懸至lmL的PBS溶液 中，置95°C的金屬浴中加熱滅活15min，8000rpm離心10min,棄上清后收獲沉淀，按照Qiagen 的細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取分枝桿菌基因組DNA，主要步驟如下：加25μ1蛋白酶K和200μ1 AL緩沖液(不含乙醇)顛倒混勻后56°C水浴消化4h，加入180μ1溶菌酶重懸，置37°C水浴消化 至少lh，再加入200μ1的無(wú)水乙醇，徹底混勻，將裂解混合液全部轉(zhuǎn)移至QIAamp核酸純化柱， 并置于2ml的收集管中，8000rpm離心lmin，棄去流出液，轉(zhuǎn)移純化柱至一個(gè)新的2ml離心管， 加入500μ1清洗緩沖液AW1，8000rpm離心lmin，同樣再用500μ1清洗緩沖液AW2清洗一次， 13000rpm離心3min徹底棄去離心廢液，將核酸純化柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml滅菌離心管，敞開(kāi)室 溫放置2min干燥，使乙醇揮發(fā)完全，加入洗脫液(TE緩沖液，可56°C先預(yù)熱），室溫放置lmin， 13000rpm離心2min，收集洗脫的分枝桿菌DNA溶液，使用后，置于-20°C保存。
[0027] 3.擴(kuò)增
[0028]目的基因的擴(kuò)增引物如下：
[0036] 2、panD 基因
[0037] panD F:5'-TCAACGGTTCCGGTCGGCTGCT-3'
[0038] panD_R:5 '-TATCCGCCACTGCTGCACGACCTT-3 '
[0039] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)650bp，含有panD全長(zhǎng)基因420bp。
[0041 ] 3、rpsA 基因：
[0042] rpsA F，5，-GGCC GCAGCTGGGACGCGGC 3,，
[0043] rpsA R，5'-CGGTCCAGCGCTCCGTCTGC 3'
[0044] 擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)1506bp,含有rpsA全長(zhǎng)基因1446bp。
[0047] 4.基因擴(kuò)增反應(yīng)體系

[0049] 在無(wú) DNA的房間中，準(zhǔn)備擴(kuò)增混合物48ul，應(yīng)在另一區(qū)加 DNA標(biāo)本。
[0050] 具體的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 °C加熱15分鐘，94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘，擴(kuò)增30個(gè) 循環(huán)，隨后，72°C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物冷卻保存至4°C，為確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)本不加上樣 緩沖液，直接取5μ1加入1%瓊脂糖凝膠中電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為pncA全長(zhǎng)基因726bp， rpsA基因1506bp，panD基因650bp。獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，用ABI 377測(cè)序儀或其他型號(hào)測(cè)序儀測(cè) 序。
[0051 ] 5.質(zhì)量控制
[0052]為了確認(rèn)檢測(cè)方法的正確性能和試劑的正常功能，需每一批用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn) 株H37Rv做1個(gè)質(zhì)控，目的基因 pncA、rpsA和panD能正常擴(kuò)增出大小正確的片段，測(cè)序結(jié)果為 野生型無(wú)突變。
[0053] 6.判讀結(jié)果
[0054] 獲取測(cè)序結(jié)果，用DNAstar、Vector NTI等生物信息學(xué)軟件或登陸NCBI網(wǎng)站用 Blast進(jìn)行序列比對(duì)。野生型序列表示檢測(cè)區(qū)沒(méi)有發(fā)生可檢出的突變。因此，試驗(yàn)菌株對(duì)吡 嗪酰胺敏感。如果發(fā)生突變，則突變序列與野生型序列不一致，將突變的堿基序列與氨基酸 序列通過(guò)查閱附表進(jìn)行分析，如果是附表中的突變，則表示試驗(yàn)菌株對(duì)耐藥。如果不是附表 中的突變，對(duì)該陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)一步進(jìn)行表型藥敏實(shí)驗(yàn)，以確定是否吡嗪酰胺耐藥。
[0055] pncA基因發(fā)生以下突變的判斷為吡嗪酰胺耐藥：-12T>C、-llA>G、-7T>C、+ l-+ 18del、3G>A、23A>C、29A>C、37T>C、52T>C、71G>A、79-81del、139A>G、161C>T、169C>T、173T> C、196T>C、226A>C、233G>A、241T>G、245A>G、271-273del、280T>C、281T>C、286A>G、331-333del、364-366del、388-396del、391-393del、395G>C、401C>A、407A>G、408InsA、415G>C、 416T>G、416T>C、422A>C、476T>G、485G>A、502A>C、521A>G、524T>G、538-561del;
[0056] rpsA基因發(fā)生以下突變的判斷為吡嗪酰胺耐藥：1299G>C，1420C>T，1421G>T;
[0057] pan D基因發(fā)生以下突變的判斷為吡嗪酰胺耐藥:39C>G，62A>G，145A>G，350T>C， 382G>T，389A>G400C>T，413T>C。
[0058] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種結(jié)核桿菌吡嗪酰胺藥敏檢測(cè)的方法，其特征在于，所述方法對(duì)pncA、rpsA、panD 中任意一種基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)測(cè)序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析來(lái)判斷吡嗪酰 胺的耐藥性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌吡嗪酰胺藥敏檢測(cè)的方法，其特征在于，所述方法包 括以下步驟:從培養(yǎng)物中提取DNA;對(duì)權(quán)利要求1所述的三種基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105950726SQ201610326412
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】劉偉, 沈瑤杰
【申請(qǐng)人】杭州市疾病預(yù)防控制中心, 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院