一種七肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物制藥與化妝品等領域，具體設及一種合成屯膚及其應用。
【背景技術】
[0002] 自二十世紀中葉W來，隨著人們生活水平的提高W及細胞生物學、分子生物學等 學科的飛速發(fā)展，科學家們對于衰老機制的探索取得了長足的進步，其中廣泛研究的理論 有自由基-氧化應激學說，炎性學說，免疫學說，線粒體DNA學說等，其中，自由基-氧化應 激學說最受重視，并能與其他學說聯(lián)系起來，起到紐帶作用。該學說的發(fā)展始于Harman于 1956年提出，他認為自由基才是真正引發(fā)的機體老化的罪魅禍首，也是引起機體組織惡性 增生等各種惡性疾病的關鍵所在。1990年，美國Sohal教授發(fā)展了該學說，率先提出了氧化 應激的概念，并在自由基學說的基礎上發(fā)展形成了 "自由基-氧化應激學說"。具體而言， 正常的機體自身建立并形成一套完善的防御系統(tǒng)W規(guī)避自由基的損傷和破壞，如細胞內(nèi)存 在的各種抗氧化物酶，如Superoxide Dismutase, SOD ;Glutathione Peroxidase, GSH-Px 等，機體清除氧自由基的能力與其活性的高低直接相關。一旦機體因內(nèi)因或外因?qū)е伦杂?基增加過量從而無法及時清除時，由于自由基都帶有不成對的單電子，可W攻擊體內(nèi)細胞， 會氧化生物膜不飽和脂肪酸、誘導蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、甚至損傷細胞核及線粒體DNA或RNA 等，從而損傷細胞和組織，最終導致機體功能的缺失和老化相關疾病的發(fā)生。因此，清除體 內(nèi)過量的自由基在預防某些疾病的過程中具有重要作用。
[0003] 生物活性膚是具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，是具有促進免疫 調(diào)節(jié)、抗菌、降血壓、抗癌、抗氧化等作用的二膚到復雜的線性、環(huán)形結構的不同膚類的總 稱，由25個天然氨基酸通過膚鍵W不同組成和排列方式構成?；钚阅w安全性極高，是當前 國際食品界最熱口的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子?，F(xiàn)代營養(yǎng)學表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消 化道酶作用后并不完全W游離氨基酸的形式吸收，大多W低膚的形式吸收，并且低膚比游 離氨基酸具有更高的營養(yǎng)價值和生物效價。
[0004] 樣品清除自由基的能力是評價其抗氧化活性最常見的方法。清除體內(nèi)過量的自由 基在預防某些疾病的過程中具有重要作用。ABTS，2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并嚷挫-6-橫 酸）二錠鹽，是一種水溶性物質(zhì)，可被Mn〇2氧化為比較穩(wěn)定的藍綠色ABTS自由基，此自由 基在736nm有穩(wěn)定的最大吸收峰，抗氧化劑能夠提供氨原子將自由基還原為無色ABTS， 可根據(jù)溶液在736nm處的吸光度變化來評估抗氧化劑清除ABTS+的能力。DPPH(1,1-二 苯基-2-苦阱基）是一種醇溶性物質(zhì)，在醇溶液中生成W氮原子為中屯、的穩(wěn)定自由基、并 呈深紫色，該自由基在522皿處有最大吸收峰，加入抗氧化樣品后，溶液會稱色，可W通 過其吸光值的變化來檢測樣品的抗氧化活性。FRAP方法（Ferricre化Cingantioxidant potentialAssay)是測定物質(zhì)抗氧化能力的一種方法。原理是酸性條件下抗氧化物可W還 原F'erric-tripyridyltriazine(!V^-TPT幻產(chǎn)生藍色的化2+-了?12,隨后在 596nm測定藍 色的化2^-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。W上=種模型操作簡便、快捷、可控性好 得到廣泛應用。 陽〇化]構建細胞氧化損傷模型是評價樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細胞由 于來源豐富、取材方便，是體外生物實驗中的常用材料。自由基首先攻擊紅細胞膜上的脂 質(zhì)和蛋白質(zhì)，使細胞膜破損，釋放出紅細胞中的血紅蛋白，稱為紅細胞溶血。AAPH、&〇2和 Hemin為常用的誘導紅細胞溶血的物質(zhì)。樣品清除體系中存在的自由基從而抑制紅細胞溶 血。原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫(yī)學界已被廣泛用于細 胞形貌及其超微結構的表征，其原理是通過檢測探針掃描樣品時所產(chǎn)生的原子間相互作用 力來獲得樣品形貌結構信息，經(jīng)計算機軟件處理成像。自由基攻擊細胞膜使之結構和功能 喪失，發(fā)生細胞溶血。運一結論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對照組、損傷組和保護組紅 細胞形貌得到進一步驗證。
[0006] 皮膚老化主要是人的遺傳傾向性（也稱為年代老化）和人對環(huán)境應激的生理反應 (也稱為光老化）的結果。光老化是外界環(huán)境對皮膚的生物學應答的效果，是可被廣泛應 用的老化實驗模型。皮膚對光老化的應答通常與正常的水合作用的缺乏、皮膚下垂W及線 條和皺紋外觀有關。UVB照射可使成纖維細胞內(nèi)活性氧（reactiveO巧genspecies,RO巧 堆積，超過了其清除能力，打破氧化與抗氧化平衡，發(fā)生氧化應激反應，調(diào)節(jié)一系列程序化 的細胞反應，甚至調(diào)控衰老相關的信號通路，促進細胞衰老的發(fā)生。人皮膚成纖維細胞是人 皮膚產(chǎn)膠原蛋白的主要場所，其數(shù)量的多少和細胞膠原蛋白的產(chǎn)率與皮膚衰老狀態(tài)息息相 關。因此，人皮膚成纖維細胞的存活率和膠原蛋白的產(chǎn)率是被廣泛認可的評價皮膚衰老狀 態(tài)的指標。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有體外抗氧化活性、保護紅細胞溶血W及促進人皮膚 成纖維細胞的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的合成屯膚，可應用于生物制藥與化妝品等領域。
[0008] 本發(fā)明WABTS自由基、DPPH自由基清除實驗、FRAP實驗、APPH誘導的紅細胞溶 血實驗W及紫外損傷人皮膚成纖維細胞來評價多膚的抗氧化及抗皮膚衰老活性。
[0009] 本發(fā)明所述的合成屯膚縮寫為EY抑ALA，分子量826. 2。序列為： Glu-Tyr-Phe-Asp-Ala-Leu-Ala。其中， Glu表示英文名稱為Glutamicacid,中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應殘基； Tyr表示英文名稱為Tyrosine,中文名稱為酪氨酸的氨基酸的相應殘基； Phe表示英文名稱為地enyIalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應殘基； Asp表示英文名稱為Aspartic acid,中文名稱為天冬氨酸的氨基酸的相應殘基； Ala表示英文名稱為Alanine,中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應殘基； Leu表示英文名稱為Leucine,中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應殘基。
[0010] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標準Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多膚合 成方法。將目標多膚的C-端簇基W共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后W運 個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的簇基作用形成膚鍵。不斷重復運一過程，即 可W得到目標多膚產(chǎn)物。合成反應完成后，去除保護基，將膚鏈與樹脂分離，即得到目標產(chǎn) 物。多膚合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0011] 本發(fā)明將終濃度為1-100嗦/血的合成屯膚與正常人血紅細胞混勻，解育，經(jīng) AAPH損傷2h后，使得細胞溶血抑制率為58. 12%~89. 51%。用100嗦/mL的本發(fā)明合成多 膚處理后的與僅用AAPH損傷的紅細胞組相比，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序，呈現(xiàn) 餅狀結構，T-SOD活力由2. 5976m甜rot/ml上升到5. 3830m甜rot/ml，結果表明，合成多 膚處理后紅細胞的SOD活性有較大提高，可在生物醫(yī)藥與化妝品等制備領域應用。
[0012] 本發(fā)明將濃度為1-10帖/血的合成多膚加入人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液中解育，經(jīng) 中波紫外（UVB)80mJ/cm2損傷后，與模型組相比，使得細胞存活率提高了0-6. 86%。同時，膠 原蛋白得率由模型組的11. 9512+1.2067嗦/mL上升為合成多膚組的13. 1951 ±1.6583 嗦/mU膠原蛋白得率提高了4. 29-10. 41%。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術效果： 本發(fā)明首次合成了該膚，并且采用了體外化學抗氧化方法檢測了合成多膚的抗氧化活 性，所述合成多膚具有很強的ABTS+自由基清除能力，同時應用于AAPH損傷的正常人紅細 胞進行保護，使得紅細胞溶血率顯著降低，SOD活性有較大的提高，同時，合成多膚對紫外損 傷的人皮膚成纖維細胞的生長具有促進作用，同時能促進其膠原蛋白的產(chǎn)生。
【附圖說明