雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒及其制備
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振?熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒的制備方法。將硝酸釓和硝酸銪溶解并與強(qiáng)堿反應(yīng)并經(jīng)加熱生長(zhǎng)得到銪摻雜氫氧化釓納米棒；再高溫?zé)Y(jié)得到銪摻雜氧化釓納米棒；然后經(jīng)過表面羥基化、氨基化、聚乙二醇化后，再經(jīng)過巰基化技術(shù)連接上RGD多肽和蝎氯毒素(CTX)多肽。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、條件可控、易于操作，其納米棒產(chǎn)物不僅尺寸?。ò糸L(zhǎng)約80納米，直徑約25納米），長(zhǎng)徑比低，經(jīng)RGD和CTX兩種多肽修飾后的納米棒不僅能穿越腦瘤的血腦及血瘤雙重屏障，而且還具有良好的核磁T1模式弛豫效率、熒光特性、早期膠質(zhì)瘤靶向及抑制特性，可用于早期腦膠質(zhì)瘤的臨床診療。
【專利說明】
雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒及其制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)惡性顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)。目前臨床對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療方式多為外科手術(shù)摘除、放射性治療和化學(xué)藥物治療等。但是，對(duì)腦膠質(zhì)瘤準(zhǔn)確定位、及時(shí)治療、減少對(duì)正常腦組織的傷害等副作用、延長(zhǎng)術(shù)后存活時(shí)間是處理早期腦膠質(zhì)瘤面臨的重大難題。因此，開發(fā)一種能高效診斷并能有效治療早期腦膠質(zhì)瘤的醫(yī)用材料對(duì)臨床腦瘤診療具有重要意義。目前，臨床上常用的腫瘤診斷方式有超聲造影、X射線成像、計(jì)算機(jī)斷層掃描成像(CT)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描成像(PET)、放射性核素成像、光學(xué)成像、磁共振成像等。但是，單一模式成像因其固有的成像缺陷，以及不能滿足臨床對(duì)復(fù)雜早期生理病理狀況的檢測(cè)；多模式成像能夠集多種成像優(yōu)勢(shì)于一體，使其相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，能為臨床疾病檢測(cè)提供更豐富的生理病變信息，磁共振-熒光雙模式成像就是其中之一。
[0003]目前，可用作增強(qiáng)磁共振成像的材料有很多，如四氧化三鐵、伽馬-三氧化二鐵、釓的螯合物及釓基納米顆粒。但是，四氧化三鐵和伽馬-三氧化二鐵是T2模式造影劑，對(duì)比增強(qiáng)效率低而用量大；而釓的螯合物在體內(nèi)易被血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)狀系統(tǒng)清除，血液循環(huán)時(shí)間短，造影效率也低，反復(fù)且大量使用又帶來體內(nèi)毒性增大。銪摻雜氧化釓納米棒是立方結(jié)構(gòu)的釓基無機(jī)納米顆粒，具有制備條件可控、顆粒尺寸可調(diào)、性能穩(wěn)定、分散性好、造影效率高而用量少的優(yōu)點(diǎn)。特別地，這種納米棒可進(jìn)行表面功能肽修飾，從而使其在生物成像、腫瘤靶向、癌癥治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。
[0004]制備Eu -G d 2 O 3納米材料的方法有許多，常見的一步法有溶膠凝膠法(CN103539192A)、固相燒結(jié)法(CN104926304A)、微波燃燒法(CN104973615A)等，兩步法總體分為銪摻雜氫氧化釓前驅(qū)體的制備及后期銪摻雜氧化釓納米棒的制備。銪摻雜氫氧化釓納米棒前驅(qū)體的制備有共沉淀法、溶膠凝膠法、水熱法等，后期銪摻雜氧化釓納米棒一般都是高溫?zé)Y(jié)法制備。公開號(hào)為CN103638532B、CN103539192B和CN104857532A的專利中，徐群淵和張華娟等分別報(bào)道了可用于磁共振成像及磁共振-熒光雙模式成像的氧化釓基造影劑制備方法。然而這些一步法的制備工藝太過簡(jiǎn)單，得到的材料物相不均勻、顆粒尺寸分布寬、含雜質(zhì)較多；兩步法制備時(shí)，共沉淀法及溶膠凝膠法制備的銪摻雜氫氧化釓前驅(qū)體顆粒尺寸太大，結(jié)晶性能差，高溫煅燒時(shí)所制備的銪摻雜氧化釓納米棒顆粒之間易發(fā)生嚴(yán)重的融合，其分散性差。由于腦腫瘤存在血腦屏障及血瘤屏障雙重阻礙，并且早期腦腫瘤尺寸小、并呈現(xiàn)網(wǎng)狀分散的特點(diǎn)，因此目前還未有涉及表面功能肽修飾并能靶向腦腫瘤影像增強(qiáng)納米材料。因此，設(shè)計(jì)一種尺寸小、分散性好、可穿越血腦和血瘤雙屏障的多功能銪摻雜氧化釓納米棒材料制備方法非常必要，而對(duì)這種小尺寸銪摻雜氧化釓納米棒材料進(jìn)行多功能化表面修飾更是不可或缺。
[0005]聚乙二醇(PEG)是一種具有優(yōu)良生物相容性的親水性高分子材料，是最常用的生物材料表面改性劑之一；它修飾后能大大增加納米材料在體內(nèi)的血液循環(huán)時(shí)間，從而提高納米材料腫瘤靶向幾率。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列多肽(RGD)，具有與細(xì)胞表面層黏連蛋白尚度未合黏附，對(duì)腦腫瘤表面尚表達(dá)的ανβ3等整合素有尚效革El向未合特性。竭氣毒素(CTX)是一種36肽神經(jīng)毒素，但其對(duì)哺乳動(dòng)物無毒并能穿過血腦屏障;而且其對(duì)早期腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的膜結(jié)合金屬蛋白酶-2呈現(xiàn)出特異性靶向結(jié)合，并且這種蛋白結(jié)合體還能因阻塞腦瘤細(xì)胞的氯離子通道而抑制腦腫瘤生長(zhǎng)。因此RGD肽與CTX肽同時(shí)連接在納米材料上，將能夠提高材料的腦瘤靶向效率并抑制腦瘤的生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)可控、易于操作的一種可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒的制備方法，以解決上述背景中提出的問題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案:
一種可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒的制備方法，包括以下步驟:
a)將六水合硝酸釓和六水合硝酸銪溶于去離子水中，形成濃度為0.025?0.1M的釓銪鹽溶液，其中銪的摻雜量為10?40mol%;然后將濃度為0.5?2M的氫氧化鈉水溶液逐滴加入，攪拌使其pH值達(dá)到13，經(jīng)反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)楹袣溲趸B和氫氧化釓白色沉淀的混合液A;
b)將混合液A轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，在100?250°C下水熱反應(yīng)12h，冷卻后用去離子水洗滌、真空干燥得到樣品，從而步驟a)所述氫氧化銪和氫氧化釓白色沉淀在加熱下成核生長(zhǎng)為銪摻雜氫氧化釓納米棒；
c)將干燥銪摻雜氫氧化釓納米棒在球磨機(jī)中研磨0.5-6h，再于300?900°C下燒結(jié)3~12h后，得到銪摻雜氧化IL納米棒；
d)將130?240mg銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在120?150mL、2.0?15wt%的四甲基氫氧化銨溶液B中，40?250°C反應(yīng)2?24h，冷卻后用去離子水離心洗滌三次，得到表面羥基化銪摻雜氧化IL納米棒；
e)將表面羥基化銪摻雜氧化釓納米棒分散在10mL二甲亞砜及四氯化碳的混合有機(jī)溶液C中，混合液C中二甲亞砜與四氯化碳的體積比為1:1?10，然后依次加入I?3mL氨丙基三乙氧基硅烷和30?90tiL去離子水，所得混合液D在40?120°C下磁力攪拌反應(yīng)2?24h后冷卻、離心分離、洗滌，干燥后得表面氨基化的銪摻雜氧化釓納米棒；
f)將40?60mg表面氨基化銪摻雜氧化IL納米棒超聲分散在1mL二甲亞砜中，然后加入雙功能化的Mal-PEG-NHS，雙功能化的Mal-PEG-NHS為兩端被馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺修飾的聚乙二醇，所得混合液E在室溫下磁力攪拌后，進(jìn)行離心分離、洗滌，干燥，得到PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒；
g)將15?25mg的PEG包覆銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入巰基化的環(huán)狀精氨酰?甘氨酰?天冬氨酸短肽，即HS-cRGD，所得混合液F室溫下磁力攪拌后，進(jìn)行離心分離、洗滌、干燥，得到RGD修飾的銪摻雜氧化釓納米棒；
h)將15?25mg的R⑶修飾的銪摻雜氧化IL納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入巰基化的蝎氯毒素，即HS-CTX，所得混合液G室溫下磁力攪拌后，進(jìn)行離心分離、洗滌、干燥，得到最終產(chǎn)物RGD和CTX雙多肽修飾的銪摻雜氧化釓納米棒。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟f)中，所述雙功能Mal-PEG-NHS的加入量為10?20mg，所得混合液E室溫下攪拌時(shí)間為12?48h。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟g)中，所述巰基化的環(huán)狀精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸短肽的加入量為I?10mg，所得混合液F在室溫下的磁力攪拌時(shí)間為12?48h。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟h)中，所述巰基化的蝎氯毒素的加入了為I?10mg，所得混合液G在室溫下的磁力攪拌時(shí)間為12?48h。
[0011]在本發(fā)明的方法中，為得到純凈的分離產(chǎn)物，在步驟e)、f)、g)、h)中需進(jìn)行分離和洗滌操作。可以用任何合適的方法進(jìn)行分離，優(yōu)選為離心分離，離心速度優(yōu)選為5000?8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間優(yōu)選為5?30min。用于洗滌的試劑優(yōu)選為二甲基亞砜、二次水和乙醇。為獲得純化產(chǎn)物，離心和洗滌次數(shù)分別為6次，兩次為二甲基亞砜洗滌，兩次為二次水洗滌，最后兩次為乙醇洗滌。分離純化后的納米顆粒可以濕態(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在適當(dāng)溫度下烘干，烘干溫度優(yōu)選為-20?-50°C。
[0012]與現(xiàn)在技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明制備所得雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，所制備的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒不僅尺寸小(棒長(zhǎng)約80納米，直徑約25納米)，長(zhǎng)徑比低，分散性好，經(jīng)R⑶和CTX兩種多肽修飾后可穿越腦瘤的血腦及血瘤雙重屏障，而且具有很好的Ti弛豫效應(yīng)、熒光成像能力和腦膠質(zhì)瘤靶向功能，還能有效抑制早期腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，在早期腦膠質(zhì)瘤的診療領(lǐng)域具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0013]圖1是煅燒得到Eu-Gd2O3納米棒的相分析及形貌觀察圖。
[0014]圖2是Eu-Gd2O3納米棒包覆PEG前后的透射電鏡圖。
[0015]圖3是對(duì)Eu-Gd2O3納米棒進(jìn)行表面PEG包覆及多肽修飾的示例性步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017]本發(fā)明提供的制備銪摻雜氧化釓納米棒及表面修飾的方法路線由于對(duì)設(shè)備、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等無苛刻要求，因此易于進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)且易量產(chǎn)。以下是本發(fā)明的示例性的具體實(shí)施方案，通過這些實(shí)施方案可以更充分地理解本發(fā)明的上述及其它優(yōu)點(diǎn)。
[0018]實(shí)施例1
稱量1.806g六水合硝酸釓、0.446g六水合硝酸銪溶于10mL去離子水中，然后在攪拌下逐滴加入IM氫氧化鈉溶液，并監(jiān)測(cè)混合液pH變化，當(dāng)pH值達(dá)到13時(shí)，停止滴加氫氧化鈉溶液。繼續(xù)攪拌5min，經(jīng)反應(yīng)后得含有氫氧化IL和氫氧化銪白色沉淀的混合液A。將混合液A轉(zhuǎn)移至200mL反應(yīng)釜中，置于180°C條件下反應(yīng)12h，冷卻后將所得沉淀物用去離子水洗滌三次，真空干燥后得到銪摻雜氫氧化IL前驅(qū)體。將銪摻雜氫氧化IL前驅(qū)體在球磨機(jī)中研磨2h分散后，在400°c空氣中燒結(jié)8h，冷卻后得到銪摻雜氧化釓納米棒(即Eu-Gd2O3 NRs)。將200mg的Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在120mL、7.0wt.%的四甲基氫氧化銨溶液B中，180°C反應(yīng)6h，冷卻后用去離子水洗滌離心三次，得到表面羥基化Eu-Gd2O3納米棒;將200mg羥基化Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在10mL 二甲亞砜及四氯化碳的混合有機(jī)溶液C中，然后依次加入3mL氨丙基三乙氧基硅烷和90tiL去離子水，所得混合液D在70°C下磁力攪拌反應(yīng)12h后冷卻、離心分離、洗滌三次，干燥后得表面氨基化的Eu-Gd2O3納米棒;將50mg表面氨基化Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在1mL二甲亞砜中，然后加入20mg雙功能化的Mal-PEG-NHS，所得混合液E在室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后得PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒;將20mg的PEG包覆銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入5mg巰基化的環(huán)狀RGD(即HS-cRGD)，所得混合液F室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后得RGD修飾的銪摻雜氧化IL納米棒;將20mg的R⑶修飾的Eu-Gd203納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入5mg巰基化的蝎氯毒素(S卩HS-CTX)，所得混合液G室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后的最終產(chǎn)物R⑶和CTX雙多肽修飾的Eu-Gd2O3納米棒(即RGD-Eu-Gd2O3-CTX NRs )。在對(duì)納米棒表面氨基化、PEG包覆、RGD和CTX修飾的過程中需進(jìn)行離心分離和洗滌操作。離心過程中，離心速度為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為lOmin。洗滌過程中，用于洗滌的試劑分別為二甲基亞砜、二次水和乙醇。為獲得純化產(chǎn)物，離心和洗滌次數(shù)分別為6次，兩次為二甲基亞砜洗滌，兩次為二次水洗滌，最后二次為乙醇洗滌。分離純化后的納米顆?？梢詽駪B(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在-20?-50 °C的低溫下真空烘干24小時(shí)后儲(chǔ)存。
[0019]實(shí)施例2
準(zhǔn)確稱量1.355 g六水合硝酸IL、0.893 g六水合硝酸銪溶于100 mL去離子水中，然后在攪拌下逐滴加入2M氫氧化鈉溶液，并監(jiān)測(cè)混合液pH變化，當(dāng)pH值達(dá)到13時(shí)，停止滴加氫氧化鈉溶液。繼續(xù)攪拌5min，經(jīng)反應(yīng)后得含有氫氧化釓和氫氧化銪白色沉淀物的混合液A。將混合液A轉(zhuǎn)移至200mL反應(yīng)釜中，置于200°C條件下反應(yīng)12h，冷卻后將所得沉淀物用去離子水洗滌三次，真空干燥后得到銪摻雜氫氧化IL前驅(qū)體。將銪摻雜氫氧化IL前驅(qū)體研磨3h分散后，在600°C空氣氛圍中燒結(jié)6h，冷卻后得到銪摻雜氧化釓納米棒(SPEu-Gd2O3 NRs)。將180mg Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在120mL、7.0wt.%的四甲基氫氧化銨溶液B中，200°C反應(yīng)6h，冷卻后用去離子水離心洗滌三次，得到表面羥基化Eu-Gd2O3納米棒;將180mg羥基化Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在10mL 二甲亞砜及四氯化碳的混合有機(jī)溶液C中，然后依次加入ImL氨丙基三乙氧基硅烷和30tiL去離子水，所得混合液D在90°C下磁力攪拌反應(yīng)12h后冷卻、離心分離、洗滌三次，干燥后得表面氨基化的Eu-Gd2O3納米棒;將60mg表面氨基化Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在1mL二甲亞砜中，然后加入1mg雙功能化的Mal-PEG-NHS，所得混合液E在室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后得PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒;將22mg的PEG包覆銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入6mg巰基化的環(huán)狀RGD(即HS-cRGD)，所得混合液F室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后得RGD修飾的銪摻雜氧化IL納米棒;將22mg的R⑶修飾的Eu-Gd203納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入6mg巰基化的蝎氯毒素(S卩HS-CTX)，所得混合液G室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后的最終產(chǎn)物R⑶和CTX雙多肽修飾的Eu-Gd2O3納米棒(即RGD-Eu-Gd2O3-CTX NRs )。在對(duì)納米棒表面氨基化、PEG包覆、RGD和CTX修飾的過程中需進(jìn)行離心分離和洗滌操作。離心過程中，離心速度為6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為8min。洗滌過程中，用于洗滌的試劑分別為二甲基亞砜、二次水和乙醇。為獲得純化產(chǎn)物，離心和洗滌次數(shù)分別為6次，兩次為二甲基亞砜洗滌，兩次為二次水洗滌，最后二次為乙醇洗滌。分離純化后的納米顆?？梢詽駪B(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在-20?-50 °C的低溫下真空烘干24小時(shí)后儲(chǔ)存。
[0020]實(shí)施例3
準(zhǔn)確稱量1.806g六水合硝酸|L、0.446g六水合硝酸銪溶于10mL去離子水中，然后在攪拌下逐滴加入2M氫氧化鈉溶液，并監(jiān)測(cè)混合液pH變化，當(dāng)pH值達(dá)到13時(shí)，停止滴加氫氧化鈉溶液。繼續(xù)攪拌5min，經(jīng)反應(yīng)后得含有氫氧化釓和氫氧化銪白色沉淀物的混合液A。將混合液A轉(zhuǎn)移至200mL反應(yīng)釜中，置于250°C條件下反應(yīng)12h，冷卻后將所得沉淀物用去離子水洗滌三次，真空干燥后得到銪摻雜氫氧化IL前驅(qū)體。將銪摻雜氫氧化IL前驅(qū)體在球磨機(jī)中研磨3h分散后，在800°C空氣氛圍中燒結(jié)8h，冷卻后得到銪摻雜氧化釓納米棒(即Eu-Gd2O3NRs)。將220mg Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在150mL、7.0wt.%的四甲基氫氧化銨溶液B中，250°C反應(yīng)6h，冷卻后用去離子水離心洗滌三次，得到表面羥基化Eu-Gd2O3納米棒;將220mg羥基化Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在10mL 二甲亞砜及四氯化碳的混合有機(jī)溶液C中，然后依次加入2mL氨丙基三乙氧基硅烷和60tiL去離子水，所得混合液D在90°C下磁力攪拌反應(yīng)12h后冷卻、離心分離、洗滌三次，干燥后得表面氨基化的Eu-Gd2O3納米棒;將60mg表面氨基化Eu-Gd2O3納米棒超聲分散在1mL二甲亞砜中，然后加入1mg雙功能化的Mal-PEG-NHS，所得混合液E在室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后得PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒;將25mg的PEG包覆銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入8mg巰基化的環(huán)狀RGD(即HS-cRGD)，所得混合液F室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后得RGD修飾的銪摻雜氧化IL納米棒;將25mg的R⑶修飾的Eu_Gd203納米棒超聲分散在3mL 二甲亞砜中，然后加入Smg巰基化的蝎氯毒素(S卩HS-CTX)，所得混合液G室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌三次，干燥后的最終產(chǎn)物R⑶和CTX雙多肽修飾的Eu-Gd2O3納米棒(即RGD-Eu-Gd2O3-CTXNRs)。在對(duì)納米棒表面氨基化、PEG包覆、RGD和CTX修飾的過程中需進(jìn)行離心分離和洗滌操作。離心過程中，離心速度為5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5min。洗滌過程中，用于洗滌的試劑分別為二甲基亞砜、二次水和乙醇。為獲得純化產(chǎn)物，離心和洗滌次數(shù)分別為6次，兩次為二甲基亞砜洗滌，兩次為二次水洗滌，最后二次為乙醇洗滌。分離純化后的納米顆?？梢詽駪B(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在-20?-50 °C的低溫下真空烘干24小時(shí)后儲(chǔ)存。
[0021]本發(fā)明中雙肽修飾的銪摻雜氧化釓納米棒是通過多步法制備而得:室溫下共沉淀后繼續(xù)水熱反應(yīng)獲得銪摻雜氫氧化釓納米棒前驅(qū)體;然后煅燒前驅(qū)體得到銪摻雜氧化釓納米棒;隨后采取一些列的反應(yīng)處理對(duì)其進(jìn)行表面修飾，最終獲得R⑶和CTX雙多肽修飾的銪摻雜氧化釓納米棒。圖1是煅燒得到銪摻雜氧化釓納米棒的掃描電鏡圖，由該圖可見所得銪摻雜氧化釓納米棒呈良好分散的納米棒，其長(zhǎng)度約為80納米，直徑約為25納米。圖2為銪摻雜氧化釓納米棒包覆PEG前后的透射電鏡圖，從圖中可以看出，銪摻雜氧化釓納呈良好分散納米棒狀結(jié)構(gòu)，PEG均勻地包覆在納米棒表面。圖3是對(duì)銪摻雜氧化釓納米棒進(jìn)行表面PEG包覆及多肽修飾的示例性步驟，由圖中可以看出銪摻雜氧化釓納米棒表面修飾過程邏輯嚴(yán)密、科學(xué)合理、操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保。
[0022]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒的制備方法，其特征在于包含以下步驟:a)將六水合硝酸釓和六水合硝酸銪溶于去離子水中，形成濃度為0.025?0.1M的釓銪鹽溶液，其中銪的摻雜量為10?40mol%;然后將濃度為0.5?2M的氫氧化鈉水溶液逐滴加入，攪拌使其pH值達(dá)到13，經(jīng)反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)楹袣溲趸B和氫氧化釓白色沉淀的混合液A;b)將混合液A轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，在100?250°C下水熱反應(yīng)12h，冷卻后用去離子水洗滌、真空干燥得到樣品，從而步驟a)所述氫氧化銪和氫氧化釓白色沉淀在加熱下成核生長(zhǎng)為銪摻雜氫氧化釓納米棒;c)將銪摻雜氫氧化釓納米棒干燥研磨分散后，在高溫爐中燒結(jié)一定時(shí)間后，得到銪摻雜氧化釓納米棒;d)將銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在四甲基氫氧化銨溶液B中，升溫反應(yīng)一定時(shí)間，冷卻后用去離子水離心、洗滌三次，得到表面羥基化銪摻雜氧化釓納米棒;e)將羥基化銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在10mL 二甲亞砜及四氯化碳的混合有機(jī)溶液C中，然后依次加入I?3mL氨丙基三乙氧基硅烷和30?90UL去離子水，所得混合液D在加熱下磁力攪拌反應(yīng)后冷卻、離心分離、洗滌，干燥后得表面氨基化的銪摻雜氧化釓納米棒;f)將表面氨基化的銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在1mL二甲亞砜中，然后加入兩端分別被馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺修飾的聚乙二醇(Mal-PEG-NHS)，即雙功能化的聚乙二醇，所得混合液E在室溫下磁力攪拌后離心分離、洗滌，干燥后得PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒;g)將PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入巰基化的環(huán)狀精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸短肽，S卩HS-cRGD，所得混合液F室溫下磁力攪拌后，進(jìn)行離心分離、洗滌、干燥后得RGD修飾的銪摻雜氧化釓納米棒;h)將R⑶修飾的銪摻雜氧化IL納米棒超聲分散在3mL二甲亞砜中，然后加入巰基化的蝎氯毒素，即HS-CTX，所得混合液G在室溫下磁力攪拌一定時(shí)間后，進(jìn)行離心、分離、洗滌、干燥后得到最終產(chǎn)物RGD和CTX雙多肽修飾的銪摻雜氧化釓納米棒。2.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化釓納米棒的制備方法，其特征在于，步驟c)中，將干燥的銪摻雜氫氧化釓納米棒在球磨機(jī)中研磨0.5-6h，再于300?900°C下燒結(jié)3~12h。3.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟d)中，將130?240mg銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在120?150mL、2.0?15^%的四甲基氫氧化銨溶液B中，40?250。(:反應(yīng)2?24 ho4.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟e)中，將130?240mg銪摻雜氧化釓納米棒超聲分散在10mL二甲亞砜和四氯化碳的混合液C中，于40?120°C下磁力攪拌反應(yīng)2?24h，其中二甲亞砜與四氯化碳的體積比為1:1?10。5.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟f)中，所述表面氨基化的銪摻雜氧化釓納米棒的加入量為40?60mg，Mal-PEG-NHS的加入量為10?20mg，所得混合液E在室溫下的攪拌時(shí)間為12?48h。6.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟g)中，所述PEG包覆的銪摻雜氧化釓納米棒的加入量為15?25mg，巰基化的環(huán)狀精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸短肽的加入量為I?I Omg，所得混合液F室溫下磁力攪拌時(shí)間為12?48h。7.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟h)中，所述RGD修飾的銪摻雜氧化釓納米棒的加入量為15-25mg，巰基化的蝎氯毒素的加入量為I?1mg，所得混合液G在室溫下的磁力攪拌時(shí)間為12?48h。8.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟e)、f)、g)、h)中，離心分離的離心轉(zhuǎn)速為5000?8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5?30min。9.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟e)、f)、g)、h)中，用于洗滌的試劑為二甲基亞砜、二次水和乙醇，每種試劑各洗滌兩次，總共洗滌6次。10.如權(quán)利要求1所述的可用于體內(nèi)靶向增強(qiáng)磁共振-熒光雙模式成像和抑制早期腦膠質(zhì)瘤的雙多肽修飾銪摻雜氧化IL納米棒的制備方法，其特征在于，步驟e )、f)、g)、h)中，干燥溫度為-5?_50°C。
【文檔編號(hào)】A61K49/14GK105963715SQ201610476470
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】黃忠兵, 吳治, 尹光福, 蒲曦鳴, 廖曉明
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)