多肽修飾的聚(甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-co-蟾毒靈)納米制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤靶向遞送與緩釋給藥系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽修飾的聚（甲 基丙烯酸寡聚乙二醇酯-CO-蟾毒靈）納米制劑及其制備方法。尤其是一種纈氨酸-精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽（cRGD)修飾的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Co-蟾 毒靈）納米粒(簡稱P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開了蟾毒靈（bufalin)是蟾蜍毒素中的主要有效成分，對多種惡性腫 瘤具有良好的治療效果，但是，其較強的毒副作用和不溶于水的缺陷極大地限制了其在臨 床上的廣泛應(yīng)用。近幾十年來，合成納米材料載體的靶向遞送系統(tǒng)由于其獨特的優(yōu)勢而備 受國內(nèi)外關(guān)注，將藥物包裹在靶向遞送載體可以有效地降低藥物的毒副作用，提高藥物的 溶解性，增強藥物的靶向性，改善治療效果。若干生物降解材料如聚乳酸、聚乳酸-羥基乙 酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇等已經(jīng)廣泛的被用做藥物的遞送載體，取得了一定的治療效果。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)公開了蟾毒靈納米制劑常以物理包埋的方式制備（Peihao Yin，et al. Bufalin-Ioaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles: preparation, cellular uptake, tissue distribution, and anticancer activity, International Journal of Nanomedicine 2012，7:3961-3969)。所述物理包埋法有操作簡單、藥物損失率低、適用范 圍廣泛等優(yōu)點，但其通常存在藥物不可控釋放、藥物附載率低（一般小于10%)等嚴重缺陷。 實踐顯示，物理包埋法制得的納米藥物中，蟾毒靈與納米載體間是依靠疏水-疏水相互作 用較弱的作用力以一種松散的聚集體的形式存在，在外界環(huán)境發(fā)生劇烈改變時如靜脈注射 時產(chǎn)生的剪切力、循環(huán)過程中導致的劇烈稀釋等常常造成疏水-疏水相互作用被破壞，導 致蟾毒靈與納米載體分離。該種藥物的早釋現(xiàn)象使得納米載體無法充分發(fā)揮其應(yīng)有的優(yōu) 勢，致使納米藥物制劑的療效改善有很大的提升空間。
[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)制備的藥物制劑中蟾毒靈過早釋放、包載率低等不足，本申請 的發(fā)明人擬采用化學改性的方法，利用化學鍵這種強的作用力將多個蟾毒靈分子與納米載 體連接起來，提供一種新的多肽修飾的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Ct蟾毒靈）納米制 劑的制備方法，其中以P (OEGMA-Cf BSMA)為基礎(chǔ)材料采用酯化與氨解反應(yīng)將CRGD和蟾毒 靈共價改性到聚合物上得到P(OEGMA-CrRGD-Ctbufalin);使制得的附載蟾毒靈的腫瘤 靶向納米藥物能有效降低蟾毒靈的毒副作用、提高水溶性和腫瘤靶向性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種多肽修飾的聚（甲基丙烯酸寡聚 乙二醇酯-Ct蟾毒靈）納米制劑及其制備方法。尤其是一種纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽（cRGD)修飾的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Ct蟾毒靈）納米粒(簡 稱 P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin)及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明中，以P(Oegm-C^bsma)為基礎(chǔ)材料采用酯化與氨解反應(yīng)將cRGD和蟾毒 靈共價改性到聚合物上制得多肽修飾的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯蟾毒靈）納米 制劑（以下簡稱？郵6獻-^〇-1〇-^〇-131^1;[11))。制得的腫瘤革巴向納米藥物能有效降低其中 的蟾毒靈的毒副作用、提高水溶性和腫瘤靶向性；其中的POEGM的長鏈能使納米載體有效 的逃逸網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而達到長循環(huán)的目的，有助于取得較好的治療效果；同時， 使其中的革巴向分子cRGD有效的發(fā)揮其對腫瘤血管的革巴向效果。
[0007] 本發(fā)明的多肽修飾的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Ct蟾毒靈）納米制劑為共 價連接蟾毒靈、cR⑶修飾的納米粒，(簡稱P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin))，其中，POEGMA具 有長循環(huán)功效，cRGD是能夠有效主動靶向腫瘤血管的靶向肽，蟾毒靈以其不溶于水的特 點形成納米粒子的疏水核。該給藥系統(tǒng)還具有運送不同抗癌藥物的功能。
[0008] 進一步，本發(fā)明的提供了一種纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽 (cRGD)修飾和蟾毒靈共價連接的聚合物（P(OEGM-CtRGD-CiHxifalin))的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的還提供了（cRGD)修飾和蟾毒靈共價連接的藥物為疏水核的膠束納米粒 子的制備方法。
[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，有效的將蟾毒靈連接到聚合物載體上，使之能夠 有效避免傳統(tǒng)物理包埋蟾毒靈的方法在體內(nèi)運輸過程中的早釋問題，從而最大限度地發(fā)揮 藥物療效。
[0011] 本發(fā)明所述的 P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin)納米粒子是以 P (OEGMA-Ct BSMA) 為載體，以蟾毒靈為模型藥制成共價連接蟾毒靈的納米藥物，其粒徑為10-2000 nm。
[0012] 本發(fā)明所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)聚合物的合成方法包括步驟： (1) 制備 BSM : 將一定量巰基乙醇、三乙胺和丙烯酸叔丁酯溶于有機溶劑中，室溫攪拌，點板跟蹤反應(yīng) 進程，最后采用柱層析的方式純化產(chǎn)物；所述的巰基乙醇、三乙胺和丙烯酸叔丁酯的摩爾比 為1 :0. 1-5 :0. 5-2. 0 ;所述有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、DMF、NMP和DMSO中一種 或兩種及以上組合； 將一定量所得產(chǎn)物與三乙胺溶于有機溶劑中，將一定量甲基丙烯酰氯滴加到溶液中， 點板跟蹤反應(yīng)進程，最后采用柱層析的方式純化產(chǎn)物；所述第一步產(chǎn)物、三乙胺和甲基丙烯 酰氯的摩爾比為1 :〇. 1-5 :0. 5-2. 0 ;所述有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、DMF、NMP 和DMSO中一種或兩種及以上組合； 將一定量所得產(chǎn)物溶于二氯甲烷中，然后加入三氟乙酸，點板跟蹤反應(yīng)進程，最后采用 柱層析的方式純化產(chǎn)物； (2) 制備 Ph-Br 將一定量Ph-OH和三乙胺溶于有機溶劑中，之后轉(zhuǎn)移至冰水浴中，然后將一定量2-溴 異丁酰溴滴加到溶液中，點板跟蹤反應(yīng)進程，最后采用柱層析的方式純化產(chǎn)物；所述的 Ph-ΟΗ、三乙胺和2-溴異丁酰溴的摩爾比為1 :0· 5-10 :0· 5-10 ; (3) 制備 P(OEGMA-co-BSMA): 將一定量Ph-Br、0EGMA、BSMA、溶劑和銅鹽配體加入玻璃管中，真空凍融三次后加入 銅鹽，再真空凍融兩次，然后封管；在20-80°C條件下反應(yīng)0. 5-20小時；所述溶劑為DMF、 DMS0、NMP、異丙醇、甲醇、乙醇和四氫呋喃中的一種或兩種及以上組合；所述銅鹽配體包括 聯(lián)吡啶、PMDETA和Me6TREN等；所述？11-8廣(^嫩、6嫩、銅鹽和銅鹽配體摩爾比為1:10-200 : 0. 5-20 :0. 1-10 :0. 1-10 ;反應(yīng)產(chǎn)物可以進行純化：過硅膠柱除去銅鹽，濃縮，加冰乙醚/正 己烷沉淀出產(chǎn)物，過濾，真空干燥； (4)制備 P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin): 將一定量P(OEGMA-co-BSMA)、NHS-OH、bufalin、DCC和DMAP溶于有機溶劑中室溫攪 拌1-72小時，然后加入一定量RGD-NH^t續(xù)反應(yīng)1-24小時，所述P (OEGMA-co-BSMA)中 的 BSMA 和 NHS-OH、bufalin、DCC、DMAP 和 RGD-NH2的摩爾比為 1 :0· 01-0. 1 :0· 1-0. 99 : 1-10 :0. 01-0. 5,反應(yīng)產(chǎn)物可以進行純化：加冰乙醚/正己烷沉淀出產(chǎn)物，過濾，真空干燥得 P(Y)RrTMA-n〇-RrTD-n〇-hi]fa1 in)麼合物"
P(DEGMA^o-bufalin-co-RGD)
[0013] 本發(fā)明中，采用機械攪拌、超聲、高壓均質(zhì)機作用方法制備所述的 P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin)納米粒，其粒徑為10~2000 nm、表面光滑、均勻度好、顆粒 規(guī)則無粘連、再分散性好、載藥率和包封率高； 所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)納米?？捎糜谥苽潇o脈或肌肉注射或口服給藥 的緩釋納米粒，作為腫瘤靶向給藥；制備的納米?？梢苑稚⒃诠腆w、半固體或溶液中，優(yōu)選 的是制成注射給藥的藥物制劑形式，尤其是供靜脈注射用。 本發(fā)明的實施例中，可分別采用復(fù)乳法、薄膜乳化法、、乳化蒸發(fā)法、界面沉淀法或自組 裝法制備得納米粒溶液。
[0014] 更進一步的，本發(fā)明提供了所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)納米給藥系 統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所用的材料是P (OEGMA-c^RGD-c^bufalin)，其摩爾濃度為 0.001-30 g/L ； 其中，所述藥物是bufalin，其摩爾濃度為0. 001-10000 μΜ ; 所采用的超聲強度，其范圍為10-1000 W ; 所用的透析袋截留分子量，其范圍為100-10000 Da; 所述的水分散介質(zhì)為右旋糖昔40-70、pluronic F68或聚乙烯醇PVA等各種適合于制 備納米粒的表面活性劑，分散介質(zhì)濃度為0.01-10% (w/v); 所述的有機溶劑包括乙酸乙醋、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇和二甲亞砜等各種適 合于制備納米粒的有機溶劑。
[0015] 本發(fā)明所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)納米給藥系統(tǒng)可制備成凍干劑保存 和應(yīng)用，其中采用的凍干支架劑包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、煎糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇 和聚乙二醇等，支架劑含量為0. 01-20% (w/v)。
[0016] 本發(fā)明制得的P(OEGM-CrRGD-Ctbufalin)納米給藥系統(tǒng)具有良好的靶向能力 和治療效果，能將藥物準確遞送至靶點并取得良好治療效果；所制備的納米藥物直徑可保 持在10-500 nm之間；實驗證實，所述的納米粒上的cRGD祀向基團可以與祀點特異性結(jié)合， 具有受體介導的靶向給藥系統(tǒng)形成的主動靶向效應(yīng)，使蟾毒靈抗腫瘤藥物較準確送到腫瘤 細胞中，實現(xiàn)惡性腫瘤的靶向治療。
[0017] 本發(fā)明制備方法簡便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，尤其適應(yīng)于制備具有長循環(huán)、可生物降 解、緩釋、被動靶向、主動靶向、運送活性物質(zhì)、抗腫瘤的藥物，更優(yōu)選制備抗腸癌的藥物。本 發(fā)明方法制得的抗腫瘤的藥物適用于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、口服或經(jīng) 皮給藥等方式。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1，制備纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽（CRGD)修飾的 聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Co-蟾毒靈）納米粒（P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin))， (1) BSMA的制備：將巰基乙醇（5. 0 g)、三乙胺和丙烯酸叔丁酯按摩爾比1 :1 :1溶于 二氯甲烷中，室溫攪拌過夜。采用柱層析的方式純化產(chǎn)物，淋洗劑為二氯甲烷。將所得產(chǎn)物 (5.0 g)