本發(fā)明屬于多肽合成技術領域，具體涉及一種通過片段法合成艾塞那肽的方法。

背景技術：

艾塞那肽是一種含有39個氨基酸的活性多肽，氨基酸序列為：H₂N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂，是GLP-1的類似物，能夠刺激胰島β細胞再生，促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，具有控制血糖功效，艾塞那肽注射液通過減少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖濃度，從而改善血糖控制。

艾塞那肽的制備方法目前主要采用傳統(tǒng)經典的固相多肽合成法，此法合成效率低、純化成本高。

因此，開發(fā)一種高效率低成本合成艾塞那肽的方法成為本領域急需解決的技術問題。

張騰在《精細化工》，2014年10月公開艾塞那肽的合成，該合成方法將艾塞那肽分成六個片段進行固相合成法，該方法中使用了傳統(tǒng)的多肽合成碳端酰胺化，并使用價格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Re sin等氨基樹脂的方案，成本較高。片段數(shù)量較多，合成成本較高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術問題是提供一種合成效率高、純化成本低、易流程化、易規(guī)模化的分段法合成艾塞那肽的方法，其克服了傳統(tǒng)經典的固相多肽合成法合成長肽效率低、產品含量低、純化成本高的缺點，也克服了固相液相混合使用時過程較繁雜、純化成本高的缺點。

具體來說，本發(fā)明提供了一種通過片段法合成艾塞那肽的方法，以C-N延伸策略，將艾塞那肽的39個氨基酸分成4段，先分別合成4段全保護片段，再將4段全保護片段依次進行組裝連接，得到艾塞那肽樹脂，然后進行切割，得到艾塞那肽粗品，粗品經純化后得到艾塞那肽產品。

更具體來說，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)的。

一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂的全保護片段與如下三個片段的全保護片段制備得到：Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-COOH，Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-COOH，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-COOH。

其中，所述全保護片段分別為Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin，F(xiàn)moc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。

其中，所述制備方法包括如下步驟：

(1)片段合成

合成Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin和3個全保護片段；

(2)片段組裝連接以及切割得到產品

將步驟(1)制備得到的4個全保護片段按照艾塞那肽的氨基酸序列進行片段組裝連接，得到氮端和側鏈保護的艾塞那肽，然后經過切割液處理，得到艾塞那肽粗品，經純化得到艾塞那肽產品。

其中，所述Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的制備方法包括如下步驟：

(1)制備Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下進行反應得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

(1)氨基酸鏈的延長

將步驟(1)得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脫Fmoc，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下進行反應得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；按照該方法再依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

其中，所述步驟(1)所述1-羥基苯丙三唑、N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比的摩爾比為(2～4):(2～4):(2～4):1；

其中，所述3個全保護片段Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH的制備方法包括如下步驟：

(1)氨基酸的連接：將N端氨基酸形成Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin結構，之后依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸形成氨基酸鏈的2-chlorotrityl chloride Resin結構；所述N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的氨基酸表示為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH；以及

(2)切割處理：將步驟(1)得到的氨基酸鏈的2-chlorotrityl chloride Resin結構進行切割得到所述全保護片段。

其中，所述Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH的制備方法為：將Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接Fmoc-Arg(pbf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-2-chlorotrityl chloride resin對其切割得到所述產品；

其中，所述Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH的制備方法為將Fmoc-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin，其切割得到所述產品；

其中，所述Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH的制備方法為：將Fmoc-Phe-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-chlorotrityl chlorideResin，其切割得到所述產品。

其中，所述Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin的制備方法為：將2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶脹后，與Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺反應得到產品；優(yōu)選2-chlorotrityl chloride resin、Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺比例為1:1:4。

其中，所述依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸(結構為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH)的反應條件為：將Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin脫Fmoc，后加入N,N-二甲基甲酰胺、待連接的Fmoc-氨基酸(保護基)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺反應得到Fmoc-氨基酸(保護基)-2-chlorotrityl chloride Resin。

其中，所述片段合成步驟中切割處理方法是向待切割片段中加入三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:1:7的混合切割液，常溫反應，之后固液分離，將液體調節(jié)pH至中性，經過分離得到產品。

其中，所述待連接的各個Fmoc-氨基酸(保護基)-OH與Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比分別均為(2～4):1，優(yōu)選該比例為2:1；1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比(2～4):(2～4):(2～4):1，優(yōu)選摩爾比為3:3:3:1。

其中，所述脫Fmoc的條件是用體積比為1:4的哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的混合液進行脫Fmoc兩次。

其中，所述片段組裝連接以及切割得到產品的方法包括如下步驟：

(1)初步組裝

將Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液以及Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺反應得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)獲得產品

按照步驟(1)的組裝連接方法，向Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-RinkAmide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，之后脫Fmoc得到艾塞那肽樹脂，加入切割液中反應，經分離得到艾塞那肽粗品，經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽產品。

其中，所述片段組裝連接以及切割得到產品步驟中切割液為質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的混合溶液。

其中，所述Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):(1～3):(1～3):1。

其中，所述的初步組裝步驟中1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～6):1；混合液中N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1。

本發(fā)明還提供所述制備方法制備得到的艾塞那肽產品，其純度高于98％。

再具體來說，本發(fā)明提供一種艾塞那肽的固相片段合成方法，包括下述步驟：

1、合成Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MB HA Resin；

(3)合成Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟(2)的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

2、合成Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH

(1)合成Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride resin

將2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶脹后，加入二氯甲烷、Fmoc-Leu-OH、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride resin；

(2)合成Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-2-chlorotrityl chloride resin

按照步驟1中(2)的方法，向Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-2-chlorotrityl chloride resin；

(3)切割處理

向Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-2-chlorotrityl chloride resin中加入切割液，常溫攪拌1～3小時，過濾，向濾液中徐徐加入2％～20％NaHCO₃水溶液至溶液呈中性，析出沉淀，得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH；上述的切割液是三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:1:7的混合液；

3、合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH

按照步驟2中(1)的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上連接Fmoc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin，再按照步驟2中(2)的方法向Fmoc-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin按照步驟2中(3)的方法進行切割處理，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH；

4、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH

按照步驟2中(1)的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上連接Fomc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-2-chlorotrityl chloride resin，再按照步驟2中(2)的方法向Fmoc-Phe-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-chlorotrityl chloride Resin，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-chlorotrityl chloride Resin按照步驟2中(3)的方法進行切割處理，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH；

5、合成艾塞那肽

(1)組裝連接Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

將步驟1得到的Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MB HA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1的混合液以及Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺，在氮氣保護下，常溫攪拌3～4小時，得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)組裝連接艾塞那肽

按照步驟(1)的組裝連接方法，向Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液，室溫攪拌1～3小時，過濾，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽；

上述的步驟1中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為(2～4):1，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:(2～4):(2～4):(2～4)。

上述的步驟2的(1)中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Leu-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4，步驟2的(2)中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH與2-chlorotrityl chloride resin的摩爾比均為2～4:1，2-chlorotrityl chloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:(2～4):(2～4):(2～4)。

上述1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink AmideMBHA Resin的摩爾比為(2～6):1。

其中所述艾塞那肽的四個片段分別為：(1)Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin，(2)Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH，(3)Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，(4)Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。

其中所述的步驟(2)(3)(4)的切割處理方法為：向各片段樹脂肽中加入三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:1:7的混合切割液，常溫攪拌1～3小時，過濾，向濾液中徐徐加入2％～20％NaHCO₃水溶液至溶液呈中性，析出沉淀。

上述步驟5中Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):(1～3):(1～3):1；

上述步驟5中1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～6):1。

本發(fā)明有益效果如下：

1.本發(fā)明通過片段合成法合成艾塞那肽，各片段碳鏈較逐個延伸法短，減少了雜質累積，降低了純化難度。

2.本發(fā)明片段采用固相法合成，合成操作簡單，省去了液相法繁雜的產物處理過程，收率穩(wěn)定，純度較高。

3.本發(fā)明最大限度的減少了片段數(shù)量，使2-chlorotrityl chloride resin的使用量盡可能的減少以降低成本，同時兼顧片段的溶解性。并在此基礎上最大限度的減少合成步驟。

4.本發(fā)明克服了現(xiàn)有固相合成艾塞那肽純化困難、規(guī)?；щy的問題，提高了合成效率，為有效解決艾塞那肽合成規(guī)模化，以及降低純化難度，提高產品純度，提供了一種新方法。

附圖說明

圖1是實施例1合成的艾塞那肽的質譜圖。

圖2是實施例1合成的艾塞那肽的液相色譜圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。

下面對說明書中的簡寫進行說明：

2-chlorotrityl chloride Resin，其名稱為2-氯三苯甲基氯樹脂；

Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其名稱是4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺樹脂

Fmoc：芴甲氧羰基

pbf、tbu、Otbu、Trt、Boc都是保護基，名稱分別是2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；⑹宥』?、叔丁氧基、三苯甲基、叔丁氧羰基。

本發(fā)明所述“全保護片段”是指對氨基酸中影響合成的基團進行保護后得到具有保護基的片段。

本發(fā)明提供一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂的全保護片段與如下三個片段的全保護片段制備得到：Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-COOH，Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-COOH，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-COOH。這是發(fā)明人對該序列分析并結合各個氨基酸的性質，同時考慮到合成的成本，在各個因素之間進行選擇和實驗獲得的結果，及對39個氨基酸的位置進行拆分為如上所述的四個片段。上述選擇是發(fā)明人創(chuàng)造性勞動的結果，有效降低成本；

其中所述全保護片段分別為Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin，F(xiàn)moc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。上述三個序列中各個氨基酸選擇的保護基可以是任意保護基，只要能夠達到所希望的可以保護的技術效果即可，但發(fā)明人經過優(yōu)選上述取代基效果最好。選擇Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH作為三個全保護片段的碳端及Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH作為全保護片段的氮端是兼顧氨基酸作為碳端和氮端的反應活性以利于片段的組裝反應，同時兼顧斷點的選擇以平衡全保護片段的長度、溶解性、數(shù)量，這樣可以有效減少合成步驟、提高效率、降低成本；Boc-His(Trt)-OH在氮末端的使用可以減少組裝完成后的處理步驟。

所述制備方法包括如下步驟：

(1)片段合成

合成Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin和3個全保護片段；

在一種具體實施方式中，F(xiàn)moc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的制備方法如下：

(1)制備Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下進行反應得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；該步驟中使用的原料是Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其是由MBHA Resin連接Fmoc保護修飾的Rink Amide Linker構成。本發(fā)明使用的是取代度為0.34mmol/g，但其他取代度的也可以達到相同或類似的技術效果，也在本發(fā)明的保護范圍內。本發(fā)明使用的取代度0.34mmol/g是從合成片段的產率、純度、樹脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

(2)氨基酸鏈的延長

將步驟(1)得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脫Fmoc次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下進行反應得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；按照該方法再依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

優(yōu)選所述其中步驟(1)所述1-羥基苯丙三唑、N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比的摩爾比為(2～4):(2～4):(2～4):1；在制備過程中各個物質之間的比例可以進行適當調節(jié)，獲得的產品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個物質之間的比例進行適當調整也在本發(fā)明的保護范圍內。

(2)片段組裝連接以及切割得到產品

將步驟(1)制備得到的4個全保護片段按照艾塞那肽的氨基酸序列進行片段組裝連接，得到氮端和側鏈保護的艾塞那肽，然后經過切割液處理，得到艾塞那肽粗品，經純化得到艾塞那肽產品。

其中所述3個全保護片段Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH全保護片段的制備方法包括如下步驟：

(1)氨基酸的連接：將N端氨基酸形成Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin結構，之后依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸形成氨基酸鏈的2-chlorotrityl chloride Resin結構；所述N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的氨基酸表示為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH；以及

(2)切割處理：將步驟(1)得到的氨基酸鏈的2-chlorotrityl chloride Resin結構進行切割得到所述全保護片段。

該步驟是氨基酸鏈增長的步驟，本發(fā)明中的Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin結構是Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride Resin、Fmoc-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride Resin和Fmoc-Phe-2-chlorotritylchloride Resin，所述依次連接的N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸，即表示為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH結構的可以是Fmoc-Arg(pbf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。

所述Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin的制備方法為：將2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶脹后，與Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺反應得到產品。

上述制備Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin的方法中使用的原料是2-chlorotrityl chloride Resin，其價格相對低廉，從而在原料上降低了成本。所述2-chlorotrityl chloride Resin，其名稱為2-氯三苯甲基氯樹脂，本發(fā)明使用的是取代度為1.74mmol/g，但其他取代度的2-chlorotrityl chlor ide Resin也可以達到相同或類似的技術效果，也在本發(fā)明的保護范圍內。2-chlorotrityl chloride Resin的取代度可以是現(xiàn)有商品化的所有取代度，本發(fā)明使用的取代度1.74mmol/g是從合成片段的產率、純度、樹脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

所述依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸(結構為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH)的反應條件為：將Fmoc-氨基酸-2-chlorot rityl chloride Resin脫Fmoc，后加入N,N-二甲基甲酰胺、待連接的Fmoc-氨基酸(側鏈保護基)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟，硼酸、N,N′-二異丙基乙胺反應得到Fmoc-氨基酸(保護基)-2-chlorotrityl chloride Resin；

其中所述待連接的各個Fmoc-氨基酸(保護基)-OH與Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比分別均為(2～4):1，優(yōu)選該比例為2:1；1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比(2～4):(2～4):(2～4):1，優(yōu)選摩爾比為3:3:3:1。

優(yōu)選地，所述脫Fmoc的條件是用體積比為1:4的哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的混合液進行脫Fmoc。該步驟中各個物質的投料量均是以制備Fmoc-氨基酸-2-chlorotrityl chloride Resin結構過程中加入的2-chlorotrityl chloride resin作為參比，通過這種控制有助于對投料量有效控制，從而達成保持產品品質，同時控制成本。

(2)切割處理：將步驟(1)得到的氨基酸鏈的2-chlorotrityl chloride Resin結構進行切割得到所述全保護片段。

具體來說三個片段的合成方法分別如下：

所述片段組裝連接以及切割得到產品的方法包括如下步驟：

(1)初步組裝

將Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液以及Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺反應得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)獲得產品

按照步驟(1)的組裝連接方法，向Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-RinkAmide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，之后脫Fmoc得到艾塞那肽樹脂，加入切割液中反應，經分離得到艾塞那肽粗品，經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽產品。

優(yōu)選所述Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):(1～3):(1～3):1；該比例保證了合成的成本最低化，同時純度和工藝達到要求。

在一種具體實施方式中，所述的初步組裝步驟中1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～6):1；混合液中N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1。

在制備過程中各個物質之間的比例可以進行適當調節(jié)，獲得的產品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個物質之間的比例以及反應條件的參數(shù)的數(shù)值進行適當調整也在本發(fā)明的保護范圍內。在制備步驟中控制各個物質之間的配料比在上述范圍內，這是發(fā)明人對各個步驟的制備方法配料比經過多個因素的考慮得到的結果，在上述保護范圍內進行上下10％的浮動依然可以達到所述的技術效果。

另外，本發(fā)明還提供所述制備方法制備得到的艾塞那肽產品，其純度高于98％。

實施例

下面對實施例中使用的各個物質的來源進行說明，如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領域常規(guī)使用儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

本發(fā)明的Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的取代度為0.34mmol/g，2-chlorotrityl chloride resin的取代度為1.74mmol/g，均由天津南開和成科技有限公司生產。

固相多肽合成反應器為通用的多肽合成反應器，購自成都斯諾進出口貿易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

分析型高效液相色譜儀為日立全自動L2000。

制備型高效液相色譜儀為創(chuàng)新恒通LC3000，C18分析色譜柱為大連物理化學研究所4.6mm×250mm，C18制備色譜柱為成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸購自上海吉爾生化有限公司。

LTQ-XL電噴霧電離質譜儀為美國Thermo Finnigan公司。

哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、三異丙基硅烷、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺、N,N-二異丙基碳二亞胺等其它試劑均為國產AR或CP。

實施例1

1、合成Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將50g Fmoc-Rink Amide MBHA Resin加入反應器中，加入500mLN,N-二甲基甲酰胺浸泡樹脂30分鐘，使樹脂充分溶脹，抽濾除去N,N-二甲基甲酰胺，向反應器中加入500mL哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液，反應5分鐘，抽濾除去混合液，再加入500mL哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液，反應20分鐘，抽濾，用異丙醇洗滌樹脂2次、N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，每次500mL，完成Fmoc-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc-兩次，向反應合成器中加入500mL N,N-二甲基甲酰胺、13.04g Fmoc-Ser(tBu)-OH、4.59g 1-羥基苯丙三唑、12.9g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、5.9mL N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1.5小時，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，抽濾，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

按照步驟(1)的方法將得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入500mL N,N-二甲基甲酰胺、11.47g Fmoc-Pro-OH、4.59g 1-羥基苯丙三唑、12.90g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、5.9mL N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1.5小時，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(3)合成Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟(2)的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次連接11.47g Fmoc-Pro-OH、11.47gFmoc-Pro-OH、10.58gFmoc-Ala-OH、10.11gFmoc-Gly-OH、13.04gFmoc-Ser(tBu)-OH、13.04gFmoc-Ser(tBu)-OH、11.47gFmoc-Pro-OH、10.11gFmoc-Gly-OH、10.11gFmoc-Gly-OH、20.29gFmoc-Asn(Trt)-OH、15.93gFmoc-Lys(Boc)-OH、12.02gFmoc-Leu-OH、14.50gFmoc-Trp-OH、14.47gFmoc-Glu(Otbu)-OH、12.02gFmoc-Ile-OH、13.17gFmoc-Phe-OH，其它試劑的用量與步驟(2)相同，得到45.23g Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

上述的Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為2:1，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:2:2:2。

2、合成Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH

(1)合成Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride resin

將50g 2-chlorotrityl chloride resin加入反應器中，加入500mL二氯甲烷浸泡樹脂30分鐘，使樹脂充分溶脹，抽濾除去二氯甲烷，向反應器中加入500mL二氯甲烷、30.75g Fmoc-Leu-OH、60.2mL N,N′-二異丙基乙胺，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Leu-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4，在氮氣保護下，常溫攪拌1.5小時，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，得到Fmoc-Gly-2-chlorotrityl chloride resin。

(2)合成Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH

按照步驟1中(2)的方法，向Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chloride resin上依次連接112.89gFmoc-Arg(pbf)-OH、59.06gFmoc-Val-OH、54.17gFmoc-Ala-OH、74.04gFmoc-Glu(Otbu)-OH、74.04gFmoc-Glu(Otbu)-OH、74.04gFmoc-Glu(Otbu)-OH、64.64gFmoc-Met-OH，其它試劑的用量為：1-羥基苯丙三唑23.51g、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸66.0g、N,N′-二異丙基乙胺30.1mL，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-2-chlorotrityl chloride resin。

上述的Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH與2-chlorotrityl chloride resin的摩爾比均為2:1，2-chlorotrityl chloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:2:2:2。

(3)切割處理

向Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-2-chlorotrityl chloride resin中加入500mL切割液，所用的切割液是三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:1:7的混合液，常溫攪拌1.5小時，過濾，向濾液中徐徐加入20％NaHCO₃水溶液至溶液呈中性，析出沉淀，收集沉淀，常溫真空干燥1小時，得到142.31g Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH。

3、合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH

按照步驟2中(1)的方法，向50g 2-chlorotrityl chloride resin上連接53.13g Fmoc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin，再按照步驟2中(2)的方法依次向Fmoc-Leu-2-chlorotrityl chlorideresin上連接40.76gFomc-Lys(Boc)-OH、66.71gFmoc-Ser(tBu)-OH、61.49gFmoc-Leu-OH、71.60gFmoc-Asp(Otbu)-OH、66.71gFmoc-Ser(tBu)-OH、69.17gFmoc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-chlorotrityl chloride resin按照步驟2中(3)的方法進行切割處理，得到135.42gFmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH。

4、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH

按照步驟2中(1)的方法，向50g 2-chlorotrityl chloride resin上連接33.70g Fomc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-2-chlorotrityl chloride resin，再按照步驟2中(2)的方法依次向Fmoc-Phe-2-chlorotrityl chloride resin上連接69.17g Fomc-Thr(tBu)-OH、51.73g Fmoc-Gly-OH、7404g Fmoc-Glu(Otbu)-OH、51.73g Fmoc-Gly-OH、107.83g Fomc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-chlorotrityl chloride Resin，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-chlorotrityl chloride Resin按照步驟2中(3)的方法進行切割處理，得到95.01g Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。

5、組裝連接合成艾塞那肽

(1)組裝連接Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟1中(1)的方法，將45.23g Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入600mL N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液以及27.53gFmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-COOH、23.51g1-羥基苯丙三唑、5.3mlN,N-二異丙基碳二亞胺，在氮氣保護下，常溫攪拌3小時，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次600mL，得到Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)組裝連接艾塞那肽

按照步驟(1)的組裝連接方法，向Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Fmoc-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接26.63gFmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、20.49gFmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液600ml脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液，室溫攪拌2小時，過濾，用冷無水乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽22.92g，收率32.2％；

上述的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為1:1，1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比2:2:1。

采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，結果見圖1，由圖可見，所合成的產物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致，說明合成產物為艾塞那肽。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，液相色譜圖見圖2，由圖2可見，艾塞那肽的純度大于98％。

實施例2

本實施的步驟1中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為3:1，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:3:3:3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

本實施例的步驟2中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH與2-chlorotrityl chloride resin的摩爾比均為3:1，2-chlorotritylchloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:3:3:3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

本實施例的步驟3～4中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比與本實施例的步驟2相同，其合成方法與實施例1相同。本實施的步驟5中Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為2:1，1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比4:4:1，得到24.91g艾塞那肽，收率35％。

采用實施例1相同的條件對產品采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，所合成的產物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，純度大于98％。

實施例3

本實施的步驟1中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為4:1，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:4:4:4，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

本實施例的步驟2中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Met-OH與2-chlorotrityl chloride resin的摩爾比均為4:1，2-chlorotritylchloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:4:4:4，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

本實施例的步驟3～4中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比與本實施例的步驟2相同，其合成方法與實施例1相同。本實施的步驟5中Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(Otbu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Glu(Otbu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(Otbu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比均為3:1，1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比6:6:1，得到21.78g艾塞那肽，收率30.6％。

采用實施例1相同的條件對產品采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，所合成的產物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，純度大于98％。