專利名稱：基于a52l基因和b8r基因雙缺失的復制型痘苗病毒的艾滋病疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗病毒免疫學領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種復制型減毒痘苗病毒載體、基于所述載體的艾滋病疫苗、及所述疫苗的制備方法和用途。
背景技術：
獲得性免疫缺陷綜合征(AcquiredImmunodeficiency Syndrome,AIDS)簡稱艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起的一種傳染性疾 病。自1981年發(fā)現(xiàn)第一例病例以來，艾滋病一直以驚人的速度在全球蔓延，成為世界上危害人類生命和健康最嚴重的病毒性疾病之一。HIV的全球流行導致了極高的致病率和病死率，為防治HIV的感染，傳統(tǒng)的化學藥物治療、免疫治療以及新的方法得以不斷研究、發(fā)展。對多數(shù)HIV感染者進行高活性抗病毒治療(HAART),雖可有效抑制病毒血癥，延緩病程,但不能清除潛伏的病毒(TusseyLG, et al. Antigen burden is amajor determinant of human immunodeficiencyvirus-specific CD8_T cellmaturation state !Potential implications fortherapeutic immunization. J InfectDis 2003 ;187 :364-374.)。保護性疫苗接種是解決防治HIV感染全球性問題的最佳途徑。為此，科學家們開展了減毒活疫苗、滅活疫苗、重組亞單位疫苗、DNA疫苗以及各種活載體疫苗(例如以腺病毒、金絲雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、皰疹性口腔炎病毒、傷寒桿菌、鏈球菌等為載體的疫苗)的研究。雖然減毒活疫苗在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中被證實有效，但在初次免疫成年獼猴中存在一定致死率(Baba Tff, Jeong YS, Penninck D，et al. 1995. Pathogenicity of live, attenuated SIV after mucosal infection ofneonatalmacaques. Science 267 :1820-25)。由于復制型減毒活疫苗的風險性以及有證據(jù)表明其無廣泛保護性，減毒活疫苗的應用尚待進一步研究。研究表明，在猩猩模型中，滅活疫苗不能保護HIV攻擊,不能誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反應。活載體疫苗和DNA疫苗都既可以誘導細胞免疫反應又可以誘導體液免疫反應，表達HIV抗原的活載體疫苗和DNA疫苗的聯(lián)合免疫成為防治HIV感染的新的疫苗研究策略。在活載體疫苗的研究中，以痘苗病毒(例如，痘苗病毒天壇株(vaccinevirusTianTan strain, VTT))為載體的活載體疫苗研究進行得最為深入和廣泛。重組痘苗病毒疫苗具有效果好、對熱穩(wěn)定性好、接種方便、不需佐劑等優(yōu)點，然而重組痘苗病毒疫苗接種人體后產生較重的局部反應，特別是在一定比例的免疫缺陷患者中可引起嚴重的并發(fā)癥。表達某些免疫原的重組痘苗病毒疫苗未能達到理想的免疫效果，如何能在增強重組痘苗病毒疫苗的免疫原性同時進一步提高痘苗病毒載體的安全性，學者們做出了很多深入的研究。隨著新的病毒性疾病不斷出現(xiàn)，以及對宿主抗病毒免疫機理的深入了解，構建表達同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組痘苗病毒載體，以及在重組痘苗病毒載體中尋找更多穩(wěn)定有效的外源基因插入?yún)^(qū)意義重大。

發(fā)明內容
在一個方面，本發(fā)明提供一種復制型痘苗病毒，其中所述痘苗病毒基因組的A52L基因和B8R基因同時缺失，且在TK區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，復制型痘苗病毒是痘苗病毒天壇株。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸來源于HIV-IB’/C重組亞型97CN54株。在一些具體的實施方式中，所述HIV抗原選自env、gag和pol中的一或多種。在一個具體的實施方式中，將env、gag和pol同時插入本發(fā)明的復制型痘苗病毒。本發(fā)明的另一個方面提供本發(fā)明的復制型痘苗病毒在制備用于預防或者治療個體的HIV病毒感染的疫苗組合物中的用途。
本發(fā)明的另一個方面提供一種艾滋病疫苗，其包含本發(fā)明的表達HIV抗原的復制
型痘苗病毒。本發(fā)明還提供了應用本發(fā)明的疫苗的免疫接種方案。保藏信息復制型痘苗病毒(Vaccinia virus) VTT A B8R于2011年3月30日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號 CGMCC 4714。復制型痘苗病毒(Vacciniavirus) VTT A A52L/B8R-GPE 于 2011 年 3 月 30 日，保藏于 CGMCC，保藏號 CGMCC 4713。含有轉移質粒pSKA52LLacZ的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)于2011年3月30日，保藏于CGMCC，保藏號CGMCC 4722。含有轉移質粒pSKA52L-GNA的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)于2011年3月30日，保藏于CGMCC，保藏號CGMCC 4723。


圖I :顯示轉移質粒pSKA52LlacZ構建圖。圖2 :顯示轉移質粒pskA52LR_GNA構建圖。圖3 :顯示PCR擴增檢測A52L基因缺失的重組病毒VTT A A52LLacZ的結果。泳道M為DNA分子量標記DL15000 (Takara公司);泳道2為A52L缺失突變區(qū)擴增片段。圖4 :顯示重組病毒VIT A B8R/A52L的PCR篩選鑒定結果。泳道1_4顯示GFP基因已經刪除的純化重組病毒；泳道5，23顯示未發(fā)生重組的母本病毒VTT A B8R ;泳道6_22顯示含GFP基因的未純化重組病毒；泳道24為DNA分子量標記DL2000 (Takara公司)。圖5 :顯示質粒pSC65gagpol_1455M的酶切鑒定結果。泳道I :DNA分子量標記DL15000 (Takara 公司);泳道 2 XmaI/PacI 雙酶切質粒 pSC65gagpol_1455M ;泳道 3 =PacI單酶切質粒 pSC65gagpol_1455M ;泳道 4 ;質粒 Psc65gagpol_1455M。圖6 :顯示重組痘苗病毒VTT A A52L/B8R-GPE的PCR鑒定結果。泳道1_3為重組病毒VIT A A52L/B8R-GPE DNA ;泳道4為重組病毒VIT A B8R/A52L DNA ;泳道5為DNA分子量標記 DL15000 (Takara 公司)。圖7 :顯示重組痘苗病毒VITAA52L/B8R-GPE的western blot鑒定結果。泳道I和4為預染蛋白質分子量標記(Precision Plus Protein Dual Color Standards,Bio-Rad)。泳道 2-3 為 VIT A A52L/B8R-GPE 的 gpl455M 抗原檢測結果，泳道 5_6 為 VIT A A52L/B8R-GPE的gag/pol抗原檢測結果。圖 8 :顯示病毒 VTT、VTT A B8R、VTT A A52LlacZ 和 VIT A B8R/A52L 分別在 CEF、Vero、Hela細胞中生長曲線測定結果。圖9A-9B :顯示重組病毒的家兔皮內毒力實驗結果。病毒VTT、VTT A A52LLacZ和VTT A A52L/B8R-GPE 分別以 I X IO7,1 X IO6,1 X 105、I X 104pfu/100 u L 注射于剃光背毛的新西蘭白兔背部皮內。連續(xù)14天觀察記錄皮膚注射部位紅腫情況，并用卡尺測其浸潤直徑和壞死直徑。A顯示1-14天各稀釋度皮損直徑總和；B顯示第7天各稀釋度皮損直徑總和。圖10 :顯示重組病毒的小鼠滴鼻毒力實驗。圖IlA-圖IlC :分別顯示Elispot檢測DNA初次免疫/重組痘苗加強免疫策略小鼠抗-HIV env T細胞產生IFN- y、IL-2和IL-4的結果。 圖12 :顯示Elispot檢測連續(xù)兩針重組痘苗免疫策略小鼠抗-HIV env T細胞產生IFN-Y的結果。圖13A-圖13B :分別顯示檢測連續(xù)兩針重組痘苗免疫策略長時相小鼠細胞及體液免疫水平。A顯示Elispot檢測小鼠抗-HIV env T細胞產生IFN-y的結果；B顯示ELISA法檢測Env特異性IgG抗體水平的結果。
具體實施例方式人免疫缺陷病毒(Hmuan Immunodeficiency Virus,HIV)是一種逆轉錄病毒，其進入人體血液后主要攻擊和破壞激活免疫反應的CD4+T淋巴細胞，使其失去原有的正常免疫功能。HIV感染在人類引起獲得性免疫缺陷綜合征(簡稱艾滋病)。保護性疫苗接種是解決防治HIV感染全球性問題的最佳途徑。本發(fā)明的針對艾滋病的疫苗是基于復制型痘苗病毒而構建的，其不同于目前常規(guī)使用的如 MVA (modified vaccinia Ankara)株、NYVAC (New YorkVaccinia virus)株和ALVAC(canarypox virus)株等非復制型痘苗病毒載體。因此,在一個方面,本發(fā)明提供一種復制型痘苗病毒，其中所述痘苗病毒基因組的A52L基因和B8R基因同時缺失，且在TK區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸。術語“復制型痘苗病毒”是指可以在人體內復制的痘苗病毒載體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述復制型痘苗病毒是痘苗病毒天壇株(vaccine virus TianTan strain, VTT)。痘苗病毒天壇株由中國科學家自上世紀二十年代分離后，曾作為天花疫苗在中國廣泛接種，并最終在中國消滅了天花。天壇株載體可高效表達外源蛋白，免疫原性好，可在體內誘導較強的體液免疫和細胞免疫，而且免疫反應的持續(xù)時間也長于非復制型載體。在本發(fā)明的復制型痘苗病毒中，痘苗病毒基因組的A52L基因和B8R基因同時缺失?！癇8R基因”廣泛存在于痘苗病毒中，其編碼可溶性IFN-Y受體的同源蛋白，可競爭性結合IFN-Y受體基因，中和IFN-Y在抗病毒及免疫調節(jié)方面的生物學活性(Paulo H. Verardi, Leslie A.Jones, Fatema H. Aziz, Shabbir Ahmad, and TilahunD.Yilma*. Vaccinia Virus Vectors with an Inactivated GammaInterferon ReceptorHomolog Gene(B8R)Are Attenuated In Vivo without aConcomitant Reduction inImmunogenicity. Journal of Virology, January 2001, Vol. 75, No. I, p. 11-18)?！癆52L基因”存在于包括天壇株等已驗明了的16株痘苗病毒中的保守基因，其表達產物可以與一組趨化因子相互作用，阻止趨化因子形成濃度梯度，病毒藉此對抗機體的免疫反應。A52L基因在歐美主流痘苗毒株命名為A41 (Richard H. Clark, JuliaC.Kenyon, Nathan ff. Bartlett, David C.Tscharke and Geoffrey L. Smith. Deletion ofgene A41L enhances vaccinia virusimmunogenicity and vaccine efficacy. Journalof General Virology(2006),87,29-38D0I 10. 1099 ；Bahar MW, Kenyon JC, Putz MM,Abrescia NGA, PeaseJE, et al. (2008)Structure and function of A41, a vacciniavirus chemokinebinding protein. PLoS Pathog 4(1) e5. doi 10. 1371/journal,ppat. 0040005)，在天壇株命名為TA52L。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，同時缺失B8R和A52L基因的痘苗病毒天壇株在激發(fā)顯著的免疫應答的同時其毒力卻顯著降低。這一發(fā)現(xiàn)使得可以構建具有更高安全性的艾滋病疫苗。術語“TK區(qū)”指痘苗病毒基因組的胸苷激酶的編碼基因區(qū)段，痘苗病毒正常功能的表達并不需要這個區(qū)段，當其被外源DNA取代之后不會影響病毒基因組的復制能力。在本發(fā)明的艾滋病疫苗中，作為載體的復制型痘苗病毒的基因組的TK區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸。可以選擇合適的HIV抗原基因用于構建本發(fā)明的疫苗，例如，可以根據(jù)流行病學 研究結果，選擇當?shù)氐闹饕餍兄甑目乖蛴糜谝呙鐦嫿?。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，插入本發(fā)明的復制型痘苗病毒TK區(qū)的所述至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸來源于HIV-1B，/C 重組亞型 97CN54 株(Su L,Graf M, Zhang Y，von Briesen H，Xing H，KostlerJ, Melzl H, Wolf H,Shao Y, Wagner R. . Characterization of a virtually full-lengthhumanimmunodeficiency virus type I genome of a prevalent intersubtype (C/B')recombinant strain in China. J Virol. 2000Dec ；74(23) :11367-76. )。HIV_1B，/C 重組亞型97CN54株是中國的HIV主要流行毒株，該毒株例如可獲自中國疾病預防控制中心艾滋病預防控制中心。在本發(fā)明的疫苗的一個實施方式中，在復制型痘苗病毒的胸苷激酶(TK)區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸，優(yōu)選地，所插入的多核苷酸是編碼HIV-I抗原env、gag和pol的多核苷酸?？刹捎枚喾N合適的手段構建本發(fā)明的復制型痘苗病毒。例如，在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，采用本發(fā)明的通用轉移載體pSKA52LLacZ，將外源基因(LacZ)重組到痘苗病毒基因組DNA的A52L區(qū)中，并同時刪除A52L基因。本發(fā)明的痘苗病毒通用轉移載體pSKA52LLacZ是含有LacZ基因篩選標記的轉移質粒。該轉移質粒載體含有以下元件①兩個篩選標記Amp抗性基因、LacZ基因。由p7. 5啟動子啟動的LacZ基因用于重組痘苗病毒的藍白斑篩選。②同源臂A52LL和A52LR序列A52LL和A52LR是痘苗病毒A52L基因的部分片段，是痘苗病毒和轉移質粒發(fā)生分子間同源重組的同源序列。③痘苗病毒的早晚期啟動子pE/L。④多克隆位點,位于啟動子pE/L的下游。 在一個具體的實施方式中，本發(fā)明人構建了減毒載體VTT A B8R/A52L (為B8R及A52L基因雙缺失、不帶LacZ選擇標記的痘苗天壇株)。在此基礎上，進一步于TK區(qū)插入HIVB，/C型CN54株HIV-lenv、gag和pol基因，獲得了復制型痘苗病毒VTT A A52L/B8R-GPE。本發(fā)明的另一個方面提供本發(fā)明的復制型痘苗病毒在制備用于預防或者治療個體的HIV病毒感染的疫苗組合物中的用途。本發(fā)明的另一個方面提供一種表達HIV抗原的艾滋病疫苗，其包含本發(fā)明的復
制型痘苗病毒。本發(fā)明還提供應用本發(fā)明的疫苗的免疫接種方案。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的免疫接種方案采用“兩針免疫策略”。術語“兩針免疫策略”意指區(qū)別于不同疫苗形式的兩次或多次免疫，是指前后兩次(初始和加強)免疫均用同種疫苗形式，例如采用根據(jù)本發(fā)明構建的痘苗病毒。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用以根據(jù)本發(fā)明構建的痘苗病毒為載體的艾滋病疫苗順序免疫小鼠兩次、兩次之間間隔4周的“兩針免疫策略”，可以激發(fā)顯著的免疫應答。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的免疫接種方案采用“Prime-boost策略”，即先用HIV DNA疫苗初始免疫(劉穎等，表達HIV多價抗原的重組痘苗病毒的構建及免疫效果的研究，病毒學報2003，Vol 19(3) :205-209)，再用本發(fā)明的復制型痘苗病毒進行加強免疫的免疫方案，能夠成功誘導機體產生高水平的體液和細胞免疫反應。本發(fā)明的復制型痘苗病毒載體涉及到的遺傳修飾不改變其復制性，而且能夠顯著降低載體的毒力，提高安全性，可以用于構建表達同一病原多個抗原(例如，HIV的多種不同抗原)的多價疫苗。本發(fā)明的基于復制型痘苗病毒的艾滋病疫苗能誘導高水平的抗HIV體液和細胞免疫應答，并有效提高復制型痘苗病毒艾滋病疫苗的安全性。本發(fā)明的復制型痘苗病毒載體還可以用于構建表達多個病原的多種抗原(例如，不同種病原或腫瘤等抗原)的重組疫苗。以下結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的闡述。實施例I :轉移質粒I、轉移質粒 pSKA52LLacZ轉移質粒pSKA52LLacZ由本發(fā)明人構建并保藏(保藏號CGMCC4722)。該質粒用于刪除痘苗病毒天壇株基因組DNA中的A52L基因，并同時在此區(qū)域插入LacZ基因。質粒上包含痘苗病毒天壇株A52L基因的左右同源臂A52LL和A52LR，在左右同源臂中間插有痘苗病毒啟動子控制下的LacZ基因。質粒構建圖見圖I。2、轉移質粒 pSKA52L-GNA轉移質粒pSKA52L-GNA由本發(fā)明人構建并保藏(保藏號CGMCC4723)。該質粒用于刪除痘苗病毒天壇株基因組DNA中的A52L基因，質粒上包含痘苗病毒天壇株A52L基因的左右同源臂A52LL和A52LR，在左右同源臂中間插有痘苗病毒啟動子控制下的GFP基因、neo基因以及200bp左右的A52L基因的直接重復序列。質粒構建圖見圖2。實施例2 :基于A52L基因修飾的復制型痘苗病毒載體的構建UA52L單基因缺失復制型痘苗病毒載體VTT A A52LlacZ的構建以痘苗病毒天壇株VTT(購自北京天壇生物制品股份有限公司)感染80-90%成片的雞胚原代成纖維細胞(M0I = 0. 01 0. I)，37°C吸附I小時后，棄去上清，并用無血清Eagle’ s培養(yǎng)基漂洗細胞2次。根據(jù)Invitrogen公司轉染試劑盒(Lipofectin ReagentCat. 18292-011)說明書，用轉移質粒pSKA52LLacZ轉染上述經病毒感染的CEF細胞。培養(yǎng)48小時后，收獲細胞及上清，凍融三次后保存于-20°C。取IOiU轉染液接種80%成片的CEF細胞，48小時后用營養(yǎng)瓊脂(含10mg/mL X_gal、l %中性紅、I %低熔點瓊脂糖的Eagle’ s)鋪斑，隨機挑取孤立藍斑病毒，連續(xù)單斑純化5代。提取重組病毒DNA采用PCR方法鑒定，使用以下引物正向引物5'-CAATCTAgAggAggAAggACgTAATgCATg-3' (SEQ ID NO. 1)反向引物5'-TACggTACCTCATCCATTAgAgAgTTAg-3' (SEQ ID NO. 2)結果顯示，重組痘苗病毒擴增出4560bp的A52L區(qū)特異性片段，證實重組痘苗病毒的A52L區(qū)插入了 LacZ基因并同時成功缺失了 A52L基因。重組痘苗病毒命名為VITAA52LLacZ。PCR鑒定結果如圖3所示。2、A52L/B8R基因雙缺失復制型痘苗病毒載體的構建2.1、轉移質粒 pSKA52L-GNA 轉染以B8R基因缺失的天壇株痘苗病毒VTTAB8R(保藏號CGMCC 4714)感染80-90 %成片的雞胚原代成纖維細胞(CEF) (MOI = 0. Ol 0. I)，37°C吸附I小時后，棄去培養(yǎng)上清，并用無血清Eagle’s培養(yǎng)基漂洗細胞2次。根據(jù)Invitrogen公司轉染試劑盒(LipofectinReagent 2000Cat. 18292-011)說明書，用轉移質粒pSKA52L_GNA轉染上述經病毒感染的CEF細胞。37°C CO2孵箱培養(yǎng)24h，收獲細胞及上清，凍融三次后保存于_20°C。2. 2、重組病毒VIT AB8R/A52L的篩選與鑒定
2.2. I、成片的CEF細胞先用含0.5mg/ml G418 (購自GIBCO公司)的Eagle’ s培養(yǎng)基預培養(yǎng)24h，收獲的轉染病毒液10倍系列稀釋接種到預處理的CEF細胞，l-2h后傾去培養(yǎng)液，加入含I %低熔點瓊脂糖(購自Promega公司)，0. 5mg/ml G418 (購自GIBCO公司)的Eagle’ s，37°C培養(yǎng)48h，熒光顯微鏡下觀察，挑取GPF陽性噬斑。噬斑反復凍融3次，再取IOOul 10倍系列稀釋，接種到G418預處理的CEF細胞。重復上述過程，單斑連續(xù)純化2-3 代。2. 2. 2、將GPF陽性噬斑凍融三次后，取IOOul 10倍系列稀釋，接種未經G418處理的CEF細胞，l-2h后傾去培養(yǎng)液，加入含I %低熔點瓊脂糖(購自Promega公司)的Eagle’ s，37°C培養(yǎng)48h，熒光顯微鏡觀察，挑取GPF陰性噬斑。噬斑凍融三次后，取100 U I接入24孔板，培養(yǎng)48h后，提取DNA，PCR鑒定，使用以下引物正向引物5'-CAATCTAGAGGAGGAAGGACGTAATGCATG-3' (SEQ ID NO. 3)反向引物5'-TACGGTACCTCATCCATTAGAGAGTTAG-3' (SEQ ID NO. 4)PCR結果正確的噬斑進入下一輪純化。重復上述過程，直至噬斑完全純化。PCR鑒定結果見圖4。實施例3 :基于A52L基因修飾的復制型痘苗病毒載體艾滋病疫苗的構建I、轉移質粒 pSC65gagpol_1455M 的構建以含有痘苗病毒TK基因左右同源臂的PSC65質粒(CGMCC :1097)為基礎，在其左右臂間嵌入HIV-1B’ /C重組株CN54的gagpol基因和經過密碼子優(yōu)化的env基因1455M。gagpol 基因直接從 pVTT-gagpolenv 質粒(CN101020052，中國專利申請 200610007567. 7)上以Pmel/Smal (購自NEB公司)雙酶切下來，經粘末端補平后，用T4DNA連接酶連入以HindiII (購自NEB公司)單酶切后并補平的pSC65質粒中，構建成重組質粒pSC65gagpol。
以質粒pDRVISV1455M(CGMCC No. 2514)為模版，PCR擴增經過密碼子優(yōu)化的1455M基因，其中使用以下引物正向引物5'-ATCCCCCGGGAGAGATATCGACACCATGGACAGGG-3' (SEQ ID NO. 5)反向引物5' -CCTACCTTAATTAATCAGCTGTCCAGGGCCAGCAGGTCC-3' (SEQ IDN0. 6)分別以Xmal/PacI (購自NEB公司)雙酶切1455M基因以及重組質粒pSC65gagpol，酶切后將兩者以T4DNA連接酶(購自NEB公司)連接，構建成轉移質粒pSC65gagpol-1455M。用限制性內切酶XmaI (購自NEB公司)單酶切和Xmal/PacI (購自NEB公司)雙酶切鑒定。酶切結果見圖5。2、重組痘苗病毒艾滋病疫苗VTT A A52L/B8R-GPE的構建以重組痘苗病毒VTT AB8R/A52L感染80-90 %成片的雞胚成纖維細胞(CEF) (M0I =0.01 0. 1)，37°C吸附I小時后，棄去上清，并用無血清Eagle’S培養(yǎng)基漂洗細胞2次。根據(jù) Invitrogen 公司轉染試劑盒(Lipofectin Reagent2000Cat. 18292-011)說明書，用轉移質粒pSC65gagpol-1455M轉染上述經病毒感染的CEF細胞。培養(yǎng)48小時后，收獲細胞及上清，凍融三次后保存于_20°C。取10 ill轉染液接種80%成片的CEF細胞，48小時后用營養(yǎng)瓊脂(含lOmg/mL X-gal、l%中性紅、1%低熔點瓊脂糖的Eagle’s)鋪斑，隨機挑取孤立藍斑病毒，連續(xù)單斑純化5代。提取重組病毒DNA采用PCR方法鑒定，其中使用以下引物正向引物5'-TAACGTGATGGATATATTAAAGTCG-3' (SEQ ID NO. 7)反向引物5'-AACGACACAACATCCATTTTTAAG-3' (SEQ ID NO. 8)結果顯示，重組痘苗病毒擴增出9931bp左右的TK區(qū)特異性片段，證實重組痘苗病毒的TK區(qū)插入了 LacZ基因和HIV目的基因并同時成功缺失了 TK基因。重組痘苗病毒命名為VTTAA52L/B8R-GPE。PCR鑒定結果如圖6所示。Western Blot結果如圖7所示，gagpol和1455M基因均有表達，Gag蛋白分子量約為55KDa，此外還有一條約41KDa的降解條帶，gpl455M蛋白的大小為140KDa。實驗用一抗分別為以HIV的env和gag蛋白免疫的Balb/c小鼠的免疫血清，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，購自中山生物技術公司。采用同樣方法構建重組病毒VTTA B8R_gpe。簡言之，用VTT A B8R (保藏號CGMCC4714)感染80-90%成片的原代雞胚成纖維細胞(CEF) (M0I = 0. 01 0. I)，轉移質粒pSC65gagpol-1455M轉染上述經病毒感染的CEF細胞。培養(yǎng)48小時后，收獲細胞及上清，凍融三次后保存于-20°C。用上述方法連續(xù)單斑純化5代獲得重組病毒VTTAB8R-gpe。重組病毒PCR和Western Blot鑒定方法同上，鑒定結果顯示，VTT A B8R-gpe的TK區(qū)插入了LacZ基因和HIV目的基因并同時成功缺失了 TK基因(結果未顯示)。實施例4 A52L基因缺失復制型痘苗病毒載體在不同細胞中的增殖將VIT、VIT A A52LLacZ,VTT A B8R 和 VIT A B8R/A52L 以 m. o. i = 0. 02 的病毒量分別感染大方瓶培養(yǎng)80-90%成片的單層細胞(CEF、Veix)和Hela)，吸附Ih后，漂洗2次。于37°C，在5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于2h、12h、24h、36h、48h和72h后收獲細胞，凍融3次，同時在各細胞中測定病毒滴度并繪制生長曲線(圖8A-8C)。結果顯示A52L、B8R基因單獨或聯(lián)合缺失突變對復制型痘苗病毒載體在體外細胞中的增殖沒有顯著影響。實施例5 A52L/B8R基因缺失對復制性痘苗病毒載體及艾滋病疫苗安全性的影響I、兔皮膚毒力實驗
病毒VTT、VTT A A52LLacZ 和 VTT A A52L/B8R-GPE 分別以 I X IO7、I X IO6、I X 105、lX104pfU/100i!L注射于剃光背毛的新西蘭白兔(購自北京開源兔業(yè)養(yǎng)殖場)(2kg)背部皮內。連續(xù)14天觀察記錄皮膚注射部位紅腫情況，并用卡尺測其浸潤直徑和壞死直徑。本研究觀察到第3-4天開始出現(xiàn)壞死，第7天壞死直徑到最大值，VTT在IO4Pfu即出現(xiàn)壞死，而VTT AA52L/B8R-GPE到IO7才出現(xiàn)壞死。VTT AA52LlacZ在觀察期的前半段與VTT沒有出現(xiàn)差異，在后期斑徑較VTT有較快時間的縮小，重組毒于觀察期末痘斑均痊愈(結果見圖9A)。選取107pfu/100 ii L第7天的壞死直徑統(tǒng)計，結果顯示A52L、B8R基因聯(lián)合刪除產生顯著的皮膚減毒效應(P < 0. 05)(結果見圖9B)。2、重組病毒的小鼠滴鼻毒力實驗3周齡BALB/c(H_2d)雌性小鼠(體重19_25克，購自中國藥品生物制品檢定所)共分5組，每組5只，從鼻腔途徑接種稀釋的5X 104pfu/20 ii L的VTT、VTT A A52LLacZ和 VTT A A52L/B8R-GPE,設PBS鼻腔接種一組小鼠作為對照組。每天固定時間連續(xù)觀察稱測體重15天，并以測量的小鼠平均體重與小鼠起始體重的變化百分比為縱坐標，以觀察時間點為橫坐標作圖。結果發(fā)現(xiàn)，VTT組在接種第8天，體重較初始體重下降顯著，而其它重組病毒接種組體重隨著輕微下降，第10天體重開始穩(wěn)步回增。提示所改建毒株在小鼠的滴鼻模型中表現(xiàn)減毒效應。(結果見圖10)3、重組病毒的裸鼠體內毒力實驗使用7-8周齡BALB/c-nu裸鼠(體重16_18克購自北京華阜康生物科技股份有限公司)，設生理鹽水(NS)對照組I組、未經改造的痘苗病毒天壇株(VTT)及系列改造痘苗毒株VTT A B8R-gpe、VTT A A52L/B8R-GPE各3組，每組4只裸鼠，NS組腹腔注射生理鹽水，VTT各組分別腹腔注射接種相應毒液I X 102pfu、I X 103pfu和I X 104pfu, VTT A B8R-gpe和VTTAA52L/B8R-GPE各組分別腹腔注射接種相應毒液I X 106pfu、I X 107pfu和IX 108pfu。每日觀察裸鼠生存情況，連續(xù)觀察6周，記錄裸鼠死亡數(shù)。腹腔接種IXlO3Pfu VTT第8天出現(xiàn)裸鼠死亡，接種IXlO4Pfu VTT，死亡率為100%，而接種IXlO5Pfu VTT A B8R/A52L僅有25%小鼠死亡，結果提示A52L和B8R基因聯(lián)合刪除在裸鼠有明顯的減毒效應。VTT A B8R-gpe 和 VIT A A52L/B8R-GPE 是分別在重組病毒 VIT A B8R 和 VIT A B8R/A52L 的TK區(qū)插入HIV基因構建而成，由于失活了 TK基因，重組病毒的毒力進一步降低。腹腔接種IXlO8Pfu和IXlO7Pfu VTT A B8R-gpe死亡率分別為25 %和75%，接種IXlO8 I X 106pfu VTTAA52L/B8R-GPE)，各組在觀察期內無死亡。結果顯示，A52L和B8R基因雙缺失的VTT A A52L/B8R-GPE較單缺失B8R基因的VTT AB8R-gpe毒力有進一步降低。(結果見表I)表I
權利要求
1.一種復制型痘苗病毒，其中所述痘苗病毒基因組的A52L基因和B8R基因同時缺失，且在TK區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸。
2.權利要求I的復制型痘苗病毒，其中所述復制型痘苗病毒是痘苗病毒天壇株。
3.權利要求I或2的復制型痘苗病毒，其中所述至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸來源于HIV-1B’ /C重組亞型97CN54株。
4.權利要求1-3中任一項的復制型痘苗病毒,其中所述HIV抗原選自env、gag和pol中的一或多種。
5.權利要求1-4中任一項的復制型痘苗病毒在制備用于預防或者治療個體的HIV病毒感染的疫苗組合物中的用途。
6.一種艾滋病疫苗，其包含權利要求1-4中任一項的復制型痘苗病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于A52L基因和B8R基因雙缺失的復制型痘苗病毒的艾滋病疫苗，其包含表達人免疫缺陷病毒(HIV)抗原的復制型痘苗病毒，本發(fā)明還涉及所述復制型痘苗病毒的構建方法以及使用包含所述復制型痘苗病毒的艾滋病疫苗的免疫接種方案。
文檔編號A61K39/21GK102747103SQ20111010116
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權日2011年4月20日
發(fā)明者劉明杰, 劉穎, 邵一鳴 申請人:中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心