專利名稱：基于n1l和b8r基因缺失的痘苗病毒載體的艾滋病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種復(fù)制型痘 苗病毒載體、基于所述載體的重組艾滋病疫苗、及所述疫苗的制備方法和 用途。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) 簡稱艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)
感染引起的一種傳染性疾病。自1981年發(fā)現(xiàn)第一例病例以來，艾滋病一直 以驚人的速度在全球蔓延，成為世界上危害人類生命和健康最嚴(yán)重的病毒 性疾病之一。
HIV的全球流行導(dǎo)致了極高的致病率和病死率，為防治HIV的感染， 傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療、免疫治療以及新的方法得以不斷研究、發(fā)展。對多 數(shù)HIV感染者進(jìn)行高活性抗病毒治療(HAART)，雖可有效抑制病毒血癥， 延緩病程，但不能清除潛伏的病毒。保護(hù)性的疫苗接種是解決防治HIV感 染全球性問題的最佳途徑。為此，科學(xué)家們幵展了減毒活疫苗、滅活疫苗、 重組亞單位疫苗、DNA疫苗以及各種活載體疫苗(例如以腺病毒、金絲雀 痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、皰疹性口腔炎病毒、傷寒桿菌、 鏈球菌等為載體的疫苗)的研究。雖然減毒活疫苗在猴免疫缺陷病毒(SIV) 感染模型中被證實(shí)有效，但在初次免疫成年獼猴中存在一定致死率。被HIV 感染的猩猩仍可被第二種不相關(guān)的HIV感染。由于減毒活疫苗的風(fēng)險性以 及有證據(jù)表明其無廣泛保護(hù)性，減毒活疫苗的應(yīng)用尚待進(jìn)一步研究。研究 表明，在猩猩模型中，滅活疫苗不能保護(hù)HIV攻擊，不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte, CTL)反應(yīng)。病毒活載體疫苗和DNA疫 苗都既可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，又可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，表達(dá)HIV抗原 的活載體疫苗和HIV DNA疫苗的聯(lián)合免疫成為防治HIV感染的新的疫苗 研究策略。
3在活載體疫苗的研究中，以痘苗病毒(例如，痘苗病毒天壇株(vaccinia virus TianTan strain，VTT))為載體的活載體疫苗研究進(jìn)行得最為深入和廣 泛。重組痘苗病毒疫苗具有效果好、對熱穩(wěn)定性好、接種方便、不需佐劑 等優(yōu)點(diǎn)，然而重組痘苗病毒疫苗接種人體后產(chǎn)生較重的局部反應(yīng)，特別是 在一定比例的免疫缺陷患者中可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。表達(dá)某些免疫原的重 組痘苗病毒疫苗未能達(dá)到理想的免疫效果，如何能在增強(qiáng)重組痘苗病毒疫 苗的免疫原性同時進(jìn)一步提高痘苗病毒載體的安全性，學(xué)者們作出了很多 深入的研究。隨著新的病毒性疾病不斷出現(xiàn)，以及對宿主抗病毒免疫機(jī)理 的深入了解，構(gòu)建表達(dá)同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組 痘苗病毒載體，以及在重組痘苗病毒載體中尋找更多穩(wěn)定有效的外源基因 插入?yún)^(qū)意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了針對HIV感染的新的疫苗，其中該疫苗采用復(fù)制型痘苗 病毒為載體構(gòu)建。本發(fā)明還提供了應(yīng)用本發(fā)明的疫苗的免疫接種方案。
本發(fā)明提供了一種表達(dá)HIV抗原的減毒艾滋病疫苗，其包含復(fù)制型痘 苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的TK區(qū)插入了至少一種編碼 HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因組的NIL基因和B8R基因同時 缺失。
本發(fā)明的艾滋病疫苗中，所述復(fù)制型痘苗病毒例如是痘苗病毒天壇株。 優(yōu)選地，在本發(fā)明的艾滋病疫苗中，所述至少一種編碼HIV抗原的多 核苷酸來源于中國HIV主要流行毒株B7C型CN54株?？捎糜跇?gòu)建本發(fā) 明的艾滋病疫苗的HIV抗原選自gag、 pol和env中的一或多種。在一個優(yōu) 選的實(shí)施方式中，可以將gag、 pol和env同時插入本發(fā)明的艾滋病疫苗。 本發(fā)明的艾滋病疫苗還可包含藥用可接受的佐劑、載體和/或賦形劑。 本發(fā)明還提供了一種艾滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個成份和 指示免疫程序的說明書，其中 一個成份為本發(fā)明的上述艾滋病疫苗。
本發(fā)明還提供了艾滋病疫苗病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ，其于2008 年4月2日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北 京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號CGMCC2431。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKNlLLacZ，包含其的大腸桿菌(&c^^/w'a co//)于2008年4月2日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號CGMCC2432。
此外，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKNlL，其構(gòu)建圖譜如圖17中所示。


圖1A-圖1D:顯示VTTDNA、 N1LL片段、N1LR片段、N1LLR片段、 pE/L+p7.5+下游LacZ片段PCR擴(kuò)增結(jié)果。泳道1、 8、 ll為DNA分子量 標(biāo)記DL15000 (Takara公司)；泳道2、 5為DNA分子量標(biāo)記DL2000 (Takara 公司)；泳道3、 4為VTTDNA;泳道6為N1LL片段；泳道7為N1LR片 段；泳道9為N1LLR片段；泳道10為pE/L+p7.5+LacZ片段。
圖2A和圖2B:顯示質(zhì)粒pSKNlL、 pSKNlLLacZ酶切分析結(jié)果。泳 道1 、4為DNA分子量標(biāo)記DL15000 (Takara公司)；泳道2為pSKNlL/Bg/II; 泳道3為pSKNlL/尺; "I ; 泳道5為pSKNlLLacZ ; 泳道6為 pSKNlLLacZ/K;wI;泳道7為pSKNlLLacZASa/1。
圖3A-圖3C:顯示PCR擴(kuò)增檢測N1L、 B8R基因同時缺失的重組病 毒VTKgpeAB8RANlLLacZ的結(jié)果。泳道1、 6為DNA分子量標(biāo)記DL2000 (Takara公司)；泳道4為DNA分子量標(biāo)記DL15000 (Takara公司)；泳道2 為VTKgpe擴(kuò)增產(chǎn)物(引物SEQ ID NO.: 7和8);泳道3為 VTKgpeAB8RANlLLacZ擴(kuò)增產(chǎn)物(引物SEQ ID NO.: 7禾卩8);泳道5為 VTKgpe八B8RANlLLacZ擴(kuò)增產(chǎn)物(引物SEQ ID NO.: 1禾n 4);泳道7為 VTKgpe擴(kuò)增產(chǎn)物(引物SEQ ID NO.: 1和4)。
圖4:顯示PCR擴(kuò)增檢測重組病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ中的fflV-1 外源基因的結(jié)果。泳道1為DNA分子量標(biāo)記DL15000 (Takara公司)；泳道 5為DNA分子量標(biāo)記DL2000 (Takara公司)；泳道2為 VTKgpeAB8RANlLLacZ擴(kuò)增產(chǎn)物(引物SEQ ID NO.: 9和10);泳道4 為VTT擴(kuò)增產(chǎn)物(引物SEQ ID NO.: 9和10)。
圖5:顯示W(wǎng)estern blot檢測重組病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ中的外 源基因穩(wěn)定表達(dá)結(jié)果。泳道1為CEF細(xì)胞；泳道2為預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo) 記(BENCHMARK Prestained protein Ladder);泳道3為VTT感染的CEF 細(xì)胞；泳道4為VTKgpe感染的CEF細(xì)胞；泳道5為VTKgpeAB8RANlLLacZ 感染的CEF細(xì)胞。圖6A-圖6D:顯示重組病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ分別在CEF、 TIC143、 Vero、 BHK細(xì)胞中生長曲線測定結(jié)果。
圖7:顯示重組病毒在小鼠足墊局部增殖檢測結(jié)果。 圖8:顯示重組病毒的家兔皮內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖9:顯示重組病毒的乳鼠腦內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖10:顯示免疫小鼠脾細(xì)胞胞內(nèi)IFN-Y染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。 圖11:顯示免疫小鼠脾細(xì)胞胞內(nèi)IL-2染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
圖12:顯示Elispot檢測小鼠抗-mVenvT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y的結(jié)果。 圖13:顯示Elispot檢測小鼠抗-HIV gag T細(xì)胞產(chǎn)生IFN々的結(jié)果。
圖14:顯示Elispot檢測小鼠抗-HIVpolT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y的結(jié)果。 圖15:顯示各免疫組gag特異性IgG抗體滴度結(jié)果。 圖16:顯示各免疫組gpl20特異性IgG抗體滴度結(jié)果。 圖17:顯示轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKNlL、 pSKNlLLacZ構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種表達(dá)HIV抗原的減毒艾滋病疫苗，其包含復(fù)制型痘 苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的TK區(qū)插入了至少一種編碼 HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因組的NIL基因和B8R基因同時 缺失。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的艾滋病疫苗中作為載體的是痘 苗病毒天壇株。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于構(gòu)建本發(fā)明的艾滋病疫苗的編碼HIV 抗原的多核苷酸來源于中國HIV主要流行毒株B7C型CN54株。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，可用于構(gòu)建本發(fā)明的艾滋病疫苗的HIV 抗原選自gag、 pol和env中的一或多種。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，可 以將gag、 pol和eiw同時插入本發(fā)明的艾滋病疫苗。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的艾滋病疫苗還可包含藥用可接受 的佐劑、載體和/或賦形劑。合適的佐劑、載體和賦形劑是本領(lǐng)域中所己知 的。
本發(fā)明還提供了一種艾滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個成份和 指示免疫程序的說明書，其中一個成份為本發(fā)明的艾滋病疫苗。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在母本毒株VTKgpeAB8R (中國專利申請
發(fā)明者穎 劉, 劉明杰, 邵一鳴, 薇 黃 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心