鼠Bpifb5基因多克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及一種鼠Bpifb5基因多克隆抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Bpifb5基因是一個新基因，研究表明，其在小鼠精子發(fā)生過程中具有一定的功能 作用，因此，有必要對其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種新的鼠Bpifb5基因多克隆抗體及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明提供一種鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0005] a)用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQIDNO: 1所示的Bpifb5基因和序列如SEQIDNO: 2 所示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒；
[0006] b)將Bpifb5基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0007] c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異 性目的蛋白；
[0008] d)免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。
[0009] 所述步驟a)中，PCR擴(kuò)增時，基因Bpifb5上游引物如SEQIDN0:3所示，基因 Bpifb5下游引物如SEQIDN0:4所示；質(zhì)粒pET32a上游引物如SEQIDN0:5所示，質(zhì)粒 pET32a下游引物如SEQIDN0:6所示。
[0010] 所述步驟C)中，培養(yǎng)時，將含有所述重組質(zhì)粒的菌液加入到高壓滅菌的無抗生素 LB培養(yǎng)基中，并加入氨芐抗生素。
[0011] 所述步驟c)中，通過IPTG誘導(dǎo)。
[0012] 所述步驟c)中，利用裂解液進(jìn)行裂解，所述裂解液包括TrisHCl、NaCl和EDTA。
[0013] 所述步驟c)中，所述純化包括包涵體蛋白處理和梯度透析。
[0014] 一種鼠Bpifb5基因多克隆抗體，所述抗體識別的蛋白序列如SEQIDNO: 7所示。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：通過制備基因Bpifb5的多克隆抗體，該抗體能夠特異性識 別目的蛋白，從而便于研究目的蛋白的表達(dá)和定位等。
【附圖說明】
[0016] 圖1是Bpifb5克隆鑒定圖；
[0017] 圖2是SDS-PAGE表達(dá)分析圖；
[0018] 圖3是表達(dá)蛋白的westernblot鑒定圖；
[0019] 圖4是小鼠睪丸免疫組化圖；
[0020] 圖5是空白對照圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0022] 在一種實施方式中，鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法包括如下步驟：
[0023]a)用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQIDNO: 1所示的Bpifb5基因和序列如SEQIDNO: 2 所示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒；其中，Bpifb5基因序列是現(xiàn)有序列，其登錄信息是：NM_144890,該 基因的蛋白序列如SEQIDN0:8所示，其登錄號是：NP_659139。
[0024]b)將Bpifb5基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；連接時，可以采用T4 連接酶。
[0025]c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異 性目的蛋白。
[0026] d)免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。
[0027] 如圖1至圖5所示，在另一種實施方式中，鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法 包括如下步驟：
[0028] 1、通過不依賴連接酶的克隆方法（LIC)重組質(zhì)粒
[0029]a)設(shè)計質(zhì)粒pET32a以及基因Bpifb5mRNA的引物，引物如表1所示：
[0030] 表1質(zhì)粒pET32a和基因Bpifb5的合成引物
[0031]
[0032]
[0033]b)通過PCR的方法擴(kuò)增目的片段Bpifb5和表達(dá)質(zhì)粒pET32a(采用TAKARA公司的 PrimeSTARGXLDNAPolymerase)，GXL高保真PCR反應(yīng)體系如表 2 所不：
[0034] 表2 :PCR反應(yīng)體系
[0035]
[0036]PCR反應(yīng)條件是：1. 98°C5min;2、98°CIOsec;3、6(TC15sec;4、68°C17min;5、2 ~ 4 循環(huán) 30 次；6、6(TCIOmin;7、12°C0/N(overnight，過夜）。
[0037]PCR反應(yīng)體系中，dNTPMixture為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每種的濃 度均為2. 5mM。
[0038]c)通過膠純化試劑盒純化所得Bpifb5片段和pET32a表達(dá)載體。
[0039]d)T4DNA連接酶（TAKARAT4DNAPolymerase2040A)處理pET32a表達(dá)載體和Bpifb5 片段。
[0040]dl)每20ul反應(yīng)液加入0? 037pmol的pET32a表達(dá)載體；
[0041]d2)每20ul反應(yīng)液加入0. 12-0. 48pmol的膠回收純化產(chǎn)物；
[0042]d3)用T4連接酶處理pET32a表達(dá)載體與Bpifb5片段，其反應(yīng)體系如表3所示；
[0043] 表3T4連接酶處理時的反應(yīng)體系
[0044]
[0045]
[0046]d4)在 22°C條件下孵育 30min;
[0047]d5) 75°C孵育20min以滅活T4連接酶。
[0048] e)表達(dá)載體與目的片段連接
[0049] el)將樣品（表達(dá)載體和目的片段的混合液）離心處理；
[0050]e2)根據(jù)表達(dá)載體與目的片段的所得的濃度將兩者以1:1的拷貝數(shù)混合于一管；
[0051]e3)22°C孵育 5min;
[0052]e4)力卩 2. 5EDTA(25mM)(SIGMAEDS-100G)并混勻；
[0053]e5)22°C孵育 5min;
[0054]e6)將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌。
[0055] 2、表達(dá)融合蛋白pET32a_Bpifb5
[0056]a)挑選轉(zhuǎn)化后的單克隆于5MLLB培養(yǎng)基中，37°C，280rpm培養(yǎng)箱搖菌16h。
[0057]b)用500ML錐形瓶裝入100mL的無抗生素LB培養(yǎng)基，高壓滅菌。
[0058]c)將含有重組質(zhì)粒的Iml菌液加入到高壓滅菌的無抗生素LB培養(yǎng)基中，加入 IOOul濃度lOOug/ml的氨芐抗生素。
[0059] d) 37°C，280rpm搖菌兩小時45分鐘后，檢測其OD595~0? 6。
[0060]e)冰上冷卻15分鐘。
[0061] f)加入IPTG(原濃度 24mg/ml，終濃度 1/100)。（TAKARA9030)
[0062] g)37°C，280rpm搖菌三小時。
[0063]h) 12000rpm，4°C，離心 30min。收集沉菌，稱凈重。
[0064]i)每Ig加入 2 ~5mlbufferW(K)OMmTrisHClph8.0,IOOmMNaCl，ImMEDTA)，吹 打混勻，于功率17%~20%超聲破碎，至懸液澄清為宜。
[0065] j)12000rpm，4°C，離心lOmin。收集上清液以及沉淀。
[0066] 3、包涵體蛋白處理：
[0067]a)配置8M的尿素（融于1XPBS)冰上預(yù)冷。
[0068]b)將超聲破碎后的沉菌融于8M尿素中，吹打混勻，4°C垂直旋轉(zhuǎn)8h~0/N。
[0069] c) 4°C，12000rcf離心15min，收集上清，上清即為可溶蛋白。
[0070]d)用兩倍體積的8M尿素加IOmM咪唑溶解可溶蛋白，加入預(yù)先準(zhǔn)備的帶特定標(biāo)簽 的beadz〇
[0071] 6)4。〇搖晃1~211。
[0072]f)1000 Orcf離心lOmin。
[0073]g)用預(yù)裝柱收集beadz。
[0074] h)用8M尿素配制300mM咪唑，將吸附在beadz的目的蛋白洗脫下來。
[0075] 4、梯度透析：
[0076]a)用IXPBS分別配制 7]?、61、51、4]\121、01尿素，預(yù)冷。
[0077] b)組裝半透膜透析袋，將目的蛋白密封在透析袋中，分別從高濃度的尿素到底濃 度的尿素進(jìn)行透析，每一個濃度透析4~6h。
[0078]c)回收蛋白溶液，用超濾管進(jìn)行超濾濃縮。
[0079]d)最后將濃縮蛋白-80 C保持，以備后續(xù)實驗使用。
[0080] 上述梯度透析和包涵體蛋白處理都用于純化蛋白。
[0081] 5、獲取特異性目的蛋白，皮下注射入兔子體內(nèi)。
[0082]a)配制1 ? 5mmSDS-PAGE蛋白膠若干塊。
[0083]b)將蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE跑膠分析。
[0084]c)配制 2MKC1500ml，冰上孵育。
[0085]d)將蛋白膠完全浸泡入預(yù)先準(zhǔn)備好的冰鎮(zhèn)KCL溶液，搖床搖晃5min后，既能看到 在目的條帶大小附近有特異的白色條帶出現(xiàn)。確定為目的條帶后將其切割，收集于4ml的 離心管中。
[0086]e)用400~500ulIXPBS溶解，攪拌器或勻漿器將切割下來的蛋白膠研磨成漿。
[0087]f)收集漿液。
[0088]g)用三通管注射器將漿液與佐劑以1:1的比例混勻。以見乳白色混勻液為宜。
[0089]h)充分混勻后，收集混合液，注射入兔子體內(nèi)。每次2ml，每周一次，持續(xù)1. 5個月。
[0090]i)兩個月后，抽取兔子耳靜脈血。室溫過夜。提取血清即為該目的蛋白的多克隆 抗體。該兔子為新西蘭大白兔。
[0091]j)用western blot進(jìn)行抗體鑒定。
[0092] 如圖1所示，1~6為重組質(zhì)粒pET32a_Bpifb5轉(zhuǎn)化后選擇的六個單克隆的PCR鑒 定，表明所選的單克隆PCR鑒定結(jié)果全部正確。
[0093] 如圖2所示，F(xiàn)2、F3均為Bpifb5表達(dá)蛋白SDS-PAGE蛋白膠鑒定結(jié)果，在53KD左 右有特異的目的條帶，證明蛋白被成功的表達(dá)純化。
[0094] 如圖3所示，其是以純化蛋白為樣本，免疫血清為抗體的westernblot結(jié)果。實驗 證明，該血清作為抗體能夠特異性的識別目的蛋白。表明該抗體特異性好。
[0095] 如圖4所示，其為應(yīng)用本實施方式抗體在小鼠睪丸組織中進(jìn)行免疫組化的結(jié)果， 該抗體在小鼠睪丸生精小管中有表達(dá)，區(qū)域A為特異結(jié)合范圍。圖5是空白對照圖。
[0096] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā) 明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
【主權(quán)項】
1. 一種鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQ ID NO: 1所示的Bpifb5基因和序列如SEQ ID NO: 2所示 的pET32a表達(dá)質(zhì)粒； b) 將Bpifb5基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒； c) 將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)菌中，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異 性目的蛋白； d) 免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。2. 如權(quán)利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 a)中，PCR擴(kuò)增時，基因Bpifb5上游引物如SEQ ID NO: 3所示，基因Bpifb5下游引物如SEQ ID N0:4所示；質(zhì)粒pET32a上游引物如SEQ ID N0:5所示，質(zhì)粒pET32a下游引物如SEQ ID N0:6所示。3. 如權(quán)利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，培養(yǎng)時，將含有所述重組質(zhì)粒的菌液加入到高壓滅菌的無抗生素LB培養(yǎng)基中，并加 入氨芐抗生素。4. 如權(quán)利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，通過IPTG誘導(dǎo)。5. 如權(quán)利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，利用裂解液進(jìn)行裂解，所述裂解液包括Tris HCl、NaCl和EDTA。6. 如權(quán)利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，所述純化包括包涵體蛋白處理和梯度透析。7. -種鼠Bpifb5基因多克隆抗體，其特征在于，所述抗體識別的蛋白序列如SEQ ID NO:7所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鼠Bpifb5基因多克隆抗體及其制備方法，包括步驟：a)用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQ？ID？NO:1所示的Bpifb5基因和序列如SEQ？ID？NO:2所示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒；b)將Bpifb5基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異性目的蛋白；d)免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。通過制備基因Bpifb5的多克隆抗體，該抗體能夠特異性識別目的蛋白，從而便于研究目的蛋白的表達(dá)和定位等。
【IPC分類】C07K16/18, C12N15/70, C07K16/06
【公開號】CN105085674
【申請?zhí)枴緾N201410203420
【發(fā)明人】黃衛(wèi)人, 吳漢偉, 牟麗莎, 刁瑞英, 桂耀庭, 蔡志明
【申請人】深圳市第二人民醫(yī)院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月14日