6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種嘌呤類物質(zhì)6-氨基嘌呤(Adenine，腺嘌呤）偶聯(lián)物的制備方法與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及的名稱適用于整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)： KLH=鑰孔血藍(lán)蛋白（keyholelimpethemocyanin)，Sigma公司產(chǎn)品PBS=磷酸緩沖液（PhosphateBufferedSaline) (0.01M，pH=7. 40) Glutar=戊二酸（Glutaraldehyde)，sigma公司產(chǎn)品 超濾管：天津鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品 維生素B4,即6-氨基嘌呤(腺嘌呤）的磷酸鹽，是核酸的組成部分，在體內(nèi)參與DNA和RNA的合成，臨床上用于放射治療、苯中毒和抗腫瘤等原因引起的白細(xì)胞減少癥、急性粒細(xì) 胞減少癥。因此，定量檢測(cè)維生素M在生命科學(xué)中具有重要意義。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《衛(wèi)生部藥品 標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品及制劑第一冊(cè)采用《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄WD氮測(cè)定法第一法測(cè) 定維生素B4的含量，操作繁瑣、專屬性差，而且未對(duì)含量均勻度進(jìn)行控制。文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)維 生素M的檢測(cè)方法有毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法、高效液相色譜法等，這些方法存在儀器昂 貴或者靈敏度低、操作繁瑣的缺點(diǎn)，并且需要專門(mén)技術(shù)人員，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)工作。因此，開(kāi)發(fā) 一種便捷、快速且靈敏度高的方法檢測(cè)維生素B4十分重要。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA)提供 了一種非常便捷的掃描方法，該法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、不需要專門(mén)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，這使 得ELISA成為一種理想的可用于常規(guī)掃描的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的核心是高質(zhì)量 的抗體，大多數(shù)嘌呤類物質(zhì)包括6-氨基嘌呤都為小分子有機(jī)化合物，只具有抗原性二不具 有免疫原性，稱之為半抗原。所以，要實(shí)施酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA)達(dá)到快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易的 檢測(cè)目的，必須要把這些化合物轉(zhuǎn)化為能引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(為完全抗 原)。維生素M為6-氨基嘌呤的磷酸鹽，其具有抗原性的主體結(jié)構(gòu)是6-氨基嘌呤。本發(fā) 明涉及的6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物就是用來(lái)引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)6-氨基嘌呤特異性的抗 體的免疫原。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，至今尚未報(bào)道有關(guān)6-氨基嘌呤免疫原合成的文獻(xiàn)專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是：提供一種能引發(fā)動(dòng)物免疫系 統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)6-氨基嘌呤有特異反應(yīng)的抗體的免疫原，即6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物以及制備這 種免疫原的方法。
[0004] 本發(fā)明的一種6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物，由6-氨基嘌呤半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載 體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體為優(yōu)選蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，合成多肽或半合成多肽。
[0005] 上述的6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)為鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)。
[0006] 本發(fā)明所述的6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式（B為：
do 其中m為與一個(gè)血藍(lán)蛋白結(jié)合的6-氨基嘌呤的個(gè)數(shù)，所述n為整數(shù)1-20KLH為血藍(lán)蛋白（keyholelimpethemocyanin)，分子量范圍為 45KDa_130KDa。
[0007] 上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征： (1) 外觀：白色粉末固體 (2) 紫外吸收光譜：26Inm 上述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物，其中優(yōu)選n為整數(shù)1-20,KLH分子量范圍為45KDa-130KDa。
[0008] 上述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法是：將6-氨基嘌呤與產(chǎn)生免疫原性的載體 物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物 活性不變。
[0009] 上述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法具體步驟如下： (1)溶液A的制備：將6-氨基嘌呤溶于二甲基甲酰胺（DMF)溶液中制成溶液A;溶液B的制備：將KLH溶于蒸餾水中制成溶液B，其中6-氨基嘌呤與KLH的摩爾比為200:1~400:1。
[0010] (2)溶液A在攪拌條件下加入到B溶液中，得到混合液C。
[0011] (3)取41. 9微升的戊二醛加入C溶液中，在攪拌條件下室溫反應(yīng)4小時(shí)，得到反應(yīng) 液D0
[0012] (4 )將溶液D用30KDa的超濾管超濾，超濾條件為3300轉(zhuǎn)，40分鐘，濃縮至1毫升 左右，再加入2毫升磷酸緩沖溶液，繼續(xù)超濾80分鐘，得到最終濃縮液F。
[0013] (5)將F溶液凍干，得到6-氨基嘌呤偶聯(lián)物。
[0014] 在上述制備方法中，其中所述的6-氨基嘌呤與KLH的摩爾比為200:1~400:1 在上述制備方法中，其中所述的磷酸緩沖液pH為7. 40,濃度為0. 01M。
[0015] 在上述制備方法中，其中所述的戊二醛的濃度為體積百分比為25%的水溶液。
[0016] 利用本發(fā)明的技術(shù)方案，可以成功的把6-氨基嘌呤半抗原與載體蛋白特別是鑰 孔血藍(lán)蛋白（KLH)成功偶聯(lián)起來(lái)，從而合成了能夠在動(dòng)物體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完 全免疫原。利用此免疫原免疫兔、鼠、雞的等動(dòng)物可以產(chǎn)生對(duì)6-氨基嘌呤有特異反應(yīng)的抗 體，這為該偶聯(lián)物用于制備6-氨基嘌呤的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑提供了廣闊的應(yīng)用空間。把該 抗體堵在微孔盤(pán)內(nèi)，就可以用來(lái)檢測(cè)實(shí)際體系內(nèi)的維生素M的含量。該方法具有簡(jiǎn)易、快 速、特異、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，不僅能節(jié)省大量時(shí)間，還可以用于現(xiàn)場(chǎng)操作， 從而彌補(bǔ)了儀器法費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，需要大型儀器設(shè)備支持，需要專門(mén)技術(shù)人員操作，難以現(xiàn)場(chǎng)操 作的不足。所以，半抗原6-氨基嘌呤與載體蛋白特別是鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)偶聯(lián)物的合成 為這種快速檢驗(yàn)法奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1: (1)稱取20mg的KLH于IOmL圓底燒瓶中，加入2ml蒸餾水，配成KLH的溶液，即溶液 A0
[0018] (2)稱取5mg維生素M于IOmL離心管中，加入ImL二甲基甲酰胺（DMF)，然后再 加入100yLlmol/L的NaOH溶液，使其溶解，得到溶液B。
[0019] (3)將溶液B在攪拌條件下逐滴加入到溶液A中，得到混合液C。取41. 9yL的戊 二醛（25%，v/v水溶液）加入C溶液中，在攪拌條件下室溫反應(yīng)4小時(shí)，得到反應(yīng)液D。
[0020] (4)將反應(yīng)液D加入到截留分子量為30KDa的超濾管中，利用離心超濾的方法將未 反應(yīng)的小分子物質(zhì)除去，離心條件為3300轉(zhuǎn)，40分鐘，將反應(yīng)液濃縮至ImL左右時(shí)，再加入 2mLPBS緩沖液（pH=7. 40)，繼續(xù)在同樣的條件下超濾80min，得到濃縮液。
[0021] (5)凍干濃縮液得到6-氨基嘌呤(維生素B4)的偶聯(lián)物。通過(guò)紫外吸收光譜確定 該偶聯(lián)物在26Inm處有特征吸收峰。
[0022] 實(shí)施例2: (1)稱取30mg的KLH于IOmL圓底燒瓶中，加入2ml蒸餾水，配成KLH的溶液，即溶液 A0
[0023] (2)稱取5mg維生素M于IOmL離心管中，加入ImL二甲基甲酰胺（DMF)，然后再 加入100yLlmol/L的NaOH溶液，使其溶解，得到溶液B。
[0024] (3)將溶液B在攪拌條件下逐滴加入到溶液A中，得到混合液C。取41. 9yL的戊 二醛（25%，v/v水溶液）加入C溶液中，在攪拌條件下室溫反應(yīng)4小時(shí)，得到反應(yīng)液D。
[0025] (4)將反應(yīng)液D加入到截留分子量為30KDa的超濾管中，利用離心超濾的方法將未 反應(yīng)的小分子物質(zhì)除去，離心條件為3300轉(zhuǎn)，40分鐘，將反應(yīng)液濃縮至ImL左右時(shí)，再加入 2mLPBS緩沖液（pH=7. 40)，繼續(xù)在同樣的條件下超濾80min，得到濃縮液。
[0026] (5)凍干濃縮液得到6-氨基嘌呤(維生素B4)的偶聯(lián)物。通過(guò)紫外吸收光譜確定 該偶聯(lián)物在26Inm處有特征吸收峰。
[0027] 實(shí)施例3: (1)稱取40mg的KLH于IOmL圓底燒瓶中，加入2ml蒸餾水，配成KLH的溶液，即溶液 A0
[0028] (2)稱取5mg維生素M于IOmL離心管中，加入ImL二甲基甲酰胺（DMF)，然后再 加入100yLlmol/L的NaOH溶液，使其溶解，得到溶液B。
[0029] (3)將溶液B在攪拌條件下逐滴加入到溶液A中，得到混合液C。取41. 9yL的戊 二醛（25%，v/v水溶液）加入C溶液中，在攪拌條件下室溫反應(yīng)4小時(shí)，得到反應(yīng)液D。
[0030] (4)將反應(yīng)液D加入到截留分子量為30KDa的超濾管中，利用離心超濾的方法將未 反應(yīng)的小分子物質(zhì)除去，離心條件為3300轉(zhuǎn)，40分鐘，將反應(yīng)液濃縮至ImL左右時(shí)，再加入 2mLPBS緩沖液（pH=7. 40)，繼續(xù)在同樣的條件下超濾80min，得到濃縮液。
[0031] (5)凍干濃縮液得到6-氨基嘌呤(維生素B4)的偶聯(lián)物。通過(guò)紫外吸收光譜確定 該偶聯(lián)物在26Inm處有特征吸收峰。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種6-氨基嘌呤的偶聯(lián)物，由6-氨基嘌呤半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)偶聯(lián) 構(gòu)成，所述載體為優(yōu)選蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，合成多肽或半合成多肽。2. 如權(quán)利要求1所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物，其中所述的產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)是鑰 孔血藍(lán)蛋白。3. 如權(quán)利要求2所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如（齡：其中m為與一個(gè)血藍(lán)蛋白結(jié)合的6-氨基嘌呤的個(gè)數(shù)，所述n為整數(shù)1-20 KLH為血藍(lán)蛋白（keyholelimpethemocyanin)，分子量范圍為 45KDa_130KDa。4. 上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征： (1 )外觀：白色粉末固體 (2 )紫外吸收光譜：261nm〇5. 如權(quán)利要求3所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物，其中n為整數(shù)1-20,KLH分子量范圍為 45KDa-130KDa〇6. 如權(quán)利1~4任一項(xiàng)所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法，其特征是將6-氨基嘌呤 與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物， 并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。7. 如權(quán)利5所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法，該方法步驟如下： 溶液A的制備：將6-氨基嘌呤溶于二甲基甲酰胺（DMF)溶液中制成溶液A;溶液B的 制備：將KLH溶于蒸餾水中制成溶液B，其中6-氨基嘌呤與KLH的摩爾比為200:1~400:1; 溶液A在攪拌條件下加入到B溶液中，得到溶液C; 取一定量的戊二醛加入C溶液中，在攪拌條件下室溫反應(yīng)4小時(shí)，得到溶液D; 將溶液D用30KDa的超濾管超濾，超濾條件為3300轉(zhuǎn)，40分鐘，濃縮至1毫升左右，再 加入2毫升磷酸緩沖溶液，繼續(xù)超濾80分鐘，得到最終濃縮液F; 將F溶液凍干，得到6-氨基嘌呤偶聯(lián)物。8. 如權(quán)利6所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法中，其中所述的6-氨基嘌呤與KLH 的摩爾比為200:1~400:1。9. 如權(quán)利6所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法中，其中所述的磷酸緩沖液pH為 7.40，濃度為0.01]?。10. 如權(quán)利6所述的6-氨基嘌呤偶聯(lián)物的制備方法中，其中所述的戊二醛的濃度為體 積百分比為25%的水溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種通式（？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？）的6-氨基嘌呤（Adenine，又稱腺嘌呤，其磷酸鹽為維生素B4）的偶聯(lián)物，由6-氨基嘌呤半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)鑰孔血藍(lán)蛋白構(gòu)成，其中n為與一個(gè)鑰孔血藍(lán)蛋白結(jié)合的6-氨基嘌呤的個(gè)數(shù)，n為整數(shù)1-20，KLH為鑰孔血藍(lán)蛋白，分子量范圍為45KDa-130KDa。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的偶聯(lián)物的合成制備方法，將6-氨基嘌呤與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便、快速、特異、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為用所述偶聯(lián)物制備維生素B4或6-氨基嘌呤其他衍生物的酶聯(lián)免疫試劑提供了廣闊的應(yīng)用空間。（Ⅰ）。
【IPC分類】C07K14/795, C07K1/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105085670
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510522477
【發(fā)明人】郗日沫, 王玉芬, 孟萌, 尹永梅, 李小剛, 張麗沙, 宋兆瑞, 董亞慶, 許坤, 龍浩
【申請(qǐng)人】天津三箭生物技術(shù)有限公司, 南開(kāi)大學(xué), 李小剛
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日