人胰高血糖素類(lèi)似肽2（glp-2c）聚乙二醇化同源二聚體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚體的制備及用 途，屬于生物技術(shù)及藥物領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]GLP-2(ghcagon_likep印tide2,GLP-2)是美國(guó)Lilly實(shí)驗(yàn)室在克隆胰高血糖素 原基因（proglucagon，PG)時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的。1996年，Drucker等發(fā)現(xiàn)胰高血糖素原衍生 肽（proglucagon,derivedpeptides,P⑶P)中促進(jìn)腸粘膜生長(zhǎng)的有效成分是GLP-2,其作 用強(qiáng)于其他已發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子且其促生長(zhǎng)作用具有器官特異性（僅限于胃腸道）。
[0004] 人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (Glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是人體腸道L型細(xì)胞 分泌的一種腸道激素，在體內(nèi)具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和小腸絨毛增生的作用。其含有33 個(gè)氨基酸，分子量為3900道爾頓。GLP-2在血液中存在的主要形式是GLP-2 (1-33)，也有 部分經(jīng)二酰肽肽酶IV(DPPIV)水解氨基末端前2個(gè)氨基酸殘基后形成的GLP-2 (3-33)，水 解后失去生物活性。
[0005] 天然的人GLP-2 (1-33)的氨基酸序列如下（SEQN0 :2): His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp 天然的人GLP-2易被二酰肽肽酶IV(DPPIV)水解，在人體內(nèi)的半衰期只有7分鐘。為 達(dá)到延長(zhǎng)其半衰期的目的，如GLP-2類(lèi)似物的上市藥品Teduglutide將其氨基酸序列第2 位的丙氨酸替換成甘氨酸（Gut2005;54:1224 - 1231)，可延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期至2小時(shí)。也 有文獻(xiàn)報(bào)道將改構(gòu)后的GLP-2類(lèi)似物與其他蛋白相融合，達(dá)到進(jìn)一步延長(zhǎng)半衰期，減少給 藥次數(shù)的目的（GLP2-2G-XTEN:APharmaceuticalProteinwithImprovedSerumHalf-Life andEfficacyinaRatCrohn'sDiseaseModel，SusanE.Alters)。該類(lèi)改構(gòu)蛋白或融合白 主要通過(guò)基因工程重組技術(shù)表達(dá)和制備而實(shí)現(xiàn)。
[0006] 在另外的公開(kāi)文獻(xiàn)和專(zhuān)利中報(bào)道GLP-2的PEG修飾的蛋白偶聯(lián)物，主要偶聯(lián)位點(diǎn) 位于Lys上的氨基或C末端的C00H上（US6284727,US9/561，226)，同樣實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)體內(nèi)半衰 期的目的。
[0007]GLP-2或GLP-2類(lèi)似物具有多重生物作用，主要包括：（1)刺激腸粘膜隱窩細(xì)胞的 增殖和抑制其凋亡，從而促進(jìn)腸粘膜的生長(zhǎng)及損傷后的再生修復(fù)；（2)GLP-2還可以抑制胃 酸的分泌和胃的運(yùn)動(dòng)；（3)增加腸道的血液供應(yīng)；（4)提高腸道的屏障功能；（5)促進(jìn)腸道 對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等。因此，Teduglutide(商品名：Gattex)已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為治療 短腸綜合癥和過(guò)敏性腸炎的多肽藥物，相關(guān)的研究已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明提供了一種衍生于GLP-2的人胰高血糖素類(lèi)似肽聚乙二醇化同源二聚體， 該同源二聚體通過(guò)位于C末端為半胱氨酸的巰基與雙活化無(wú)甲氧基或羥基的聚乙二醇分 子兩端活化基團(tuán)共價(jià)而成。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇同源二聚體形式的人胰高血糖 素（GLP-2)類(lèi)似肽具有可顯著延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期的作用，可作為一種新型治療短腸綜合征 或過(guò)敏性腸炎的長(zhǎng)效藥物或藥物組合物。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚 體，以及實(shí)現(xiàn)該聚乙二醇化同源二聚體的制備方法。
[0011] 本發(fā)明中人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)的氨基酸序列具有以下特征，由34個(gè) 氨基酸組成。
[0012] 序列SEQNO:1 (GLP-2(l-33)的衍生物）： His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Cys與天然GLP-2(SEQN0 :2)相比較， 本發(fā)明提供的人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)序列SEQNO:1的特征是第2位的丙氨 酸由甘氨酸代替。
[0013] 本發(fā)明提供的人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)序列SEQNO:1的另一特征是C末 端增加了一個(gè)半胱氨酸。
[0014] 本發(fā)明提供的人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)序列SEQNO:1的另一特征是C末 端增加的半胱氨酸可以是酰胺化形式。
[0015] 本發(fā)明中人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)除SEQNO:1的序列外，還包括由此經(jīng) 一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加而成的衍生物，與SEQNO:2序列具有50%的同源性并 保留了促進(jìn)小腸增長(zhǎng)、增重和小腸絨毛增深作用的類(lèi)似物。
[0016] 本發(fā)明的另一目的提供制備人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二 聚體的制備方法和實(shí)施過(guò)程。通過(guò)本發(fā)明中的GLP-2的C末端的半胱氨酸游離巰基在一定 反應(yīng)條件下與雙活化的聚乙二醇兩端的活性基團(tuán)化學(xué)偶聯(lián)。聚乙二醇化同源二聚體，具以 下特征： (GLP-2C) -PEG- (GLP-2C)。
[0017] 雙活化不含單甲氧基或羥基的聚乙二醇分子（PEG)包括：雙活化的馬來(lái)酸琥珀酰 亞胺PEG，表述為MAL-PEG-MAL;或包括雙活化的巰基PEG，表述為SH-PEG-SH;或雙活化的 乙烯砜PEG，表述為VS-PEG-VS;或雙活化的鄰二硫吡啶PEG，表述為0PSS-PEG-0PSS。
[0018] 用于本發(fā)明中人胰高血糖素類(lèi)似肽2(GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚體中的聚乙二 醇分子量范圍從5000至40, 000道爾頓。通過(guò)分子量大于5000的PEG分子作為二聚體偶 聯(lián)物可實(shí)現(xiàn)將人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)同源二聚體在體內(nèi)半衰期的顯著延長(zhǎng)。優(yōu) 選的PEG分子量大小在20KD-40KD之間。
[0019] 本發(fā)明的另一目的是提供了用于制備人胰高血糖素類(lèi)似肽2(GLP_2C)(SEQN0:1) 的化學(xué)固相合成或重組DNA技術(shù)的方法。重組DNA技術(shù)指應(yīng)用表達(dá)載體插入編碼人胰高血 糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)的cDNA基因片段后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。再經(jīng)發(fā)酵或培養(yǎng)，純化制備相 對(duì)應(yīng)重組多肽的技術(shù)過(guò)程。
[0020] 本發(fā)明的另一目的，提供了分離和純化人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇 化同源二聚體的方法，包括離子交換色譜、親和色譜、疏水層析、反相層析色譜、分子排阻色 譜和超濾等技術(shù)手段。
[0021] 本發(fā)明的另一目的，提供了人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚 體的促進(jìn)小腸增重和小腸絨毛增深的作用，可作為治療短腸綜合征或過(guò)敏性腸炎的長(zhǎng)效藥 物或藥物組合物。
[0022] 作為一種藥物組合物，它包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效 劑量的本發(fā)明所述的聚乙二醇化同源二聚體多肽。
[0023] 本發(fā)明中所用"同源二聚體"，是指通過(guò)共價(jià)結(jié)合鍵將氨基酸序列和組成完全相同 的人胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)通過(guò)C末端與一個(gè)分子的PEG兩端共價(jià)結(jié)合而形成的 二聚體。
[0024] 本發(fā)明中所用"聚乙二醇偶聯(lián)"，是指通過(guò)不同分子量的聚乙二醇在兩端分別與人 胰高血糖素類(lèi)似肽2 (GLP-2C)共價(jià)結(jié)合而成的聚乙二醇化偶聯(lián)物。
[0025] 本發(fā)明中所用"宿主細(xì)胞"，是指大腸桿菌。
[0026] 本發(fā)明中所用"表達(dá)載體"，是指含有表達(dá)啟動(dòng)子包括T7、Tac、Trp、Iac的大腸桿 菌表達(dá)載體。
[0027] 至此已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了項(xiàng)下的描述，通過(guò)參考下列實(shí)例，能夠?qū)Ρ景l(fā)明有更清晰 的理解。
[0028] 說(shuō)明書(shū)【附圖說(shuō)明】： 附圖I:GLP-2C、PEG40K-GLP-2C和（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)的RP-HPLC譜 圖。圖A為GLP-2C的RP-HPLC譜圖，圖B為PEG40K-GLP-2C的RP-HPLC譜圖，圖C為 (GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)的RP-HPLC譜圖。
[0029]附圖 2 :GLP-2，GLP-2C，PEG40K- (GLP-2C)和（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)體外細(xì) 胞活性測(cè)定結(jié)果 附圖3 :GLP-2C和（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)在大鼠體內(nèi)的促進(jìn)小腸增生的作用。 圖A為促進(jìn)小腸增重的數(shù)據(jù)，圖B為促進(jìn)小腸長(zhǎng)長(zhǎng)的數(shù)據(jù)。
[0030] 下述實(shí)例僅為說(shuō)明目的而并不旨在對(duì)本發(fā)明的限制。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)例1、GLP-2C的化學(xué)固相合成 GLP-2C的氨基酸序列（SEQNO: 1)如下： His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu