P19/Ebi3復合物及其多克隆抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡診治中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及P19/Ebi3復合物及其多克隆抗 體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷、治療中的用途。
【背景技術】
[0002] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SystemicLupusErythematosus,SLE)是一種嚴重威脅人類健 康與生命的自身免疫性疾病，有較高的致死率和致殘率。其病因與發(fā)病機制尚不明了，普遍 認為是環(huán)境因素作用于一定遺傳背景的機體（包括組織相容性、細胞因子、細胞因子受體 等表達的不同型別）而形成的結果。其免疫病理特征是體內(nèi)產(chǎn)生多種高低度、致病性自身 抗體，同時淋巴細胞凋亡。釋放出大量細胞核內(nèi)容物及核糖小體而成為自身抗原；抗原抗體 結合形成免疫復合物，免疫復合物的沉積可導致靶細胞損傷和炎癥，導致各個組織和器官 發(fā)生病變。在該病理過程中，B細胞處于高度活化狀態(tài)，且該過程與T細胞密切相關，有T細 胞依賴性。
[0003] 復雜的細胞因子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)T細胞和B細胞的生長、分化和功能，這些細胞因子可 以分為兩大類：Thl型（主要誘導細胞免疫）和Th2型（主要促進抗體產(chǎn)生）。白細胞介 素12(IL-12)在細胞因子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)中起著重要的作用，它主要由單核巨噬細胞分泌產(chǎn)生。 IL-12家族由一個a-鏈（P19,P28或P35)和一個P-鏈（P40或Ebi3)異二聚體亞基組 成（圖1)，其與一些自身免疫疾病，尤其是Thl細胞介導的自身免疫病的發(fā)病有關。
[0004] 目前對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、組織病理 學和影像學檢查。由于SLE臨床表現(xiàn)病癥因人而異，有時會出現(xiàn)誤診。而治療系統(tǒng)性紅斑 狼瘡的常規(guī)方法是使用抗瘧疾藥、抗炎藥和免疫抑制藥，當癥狀難以控制時，對非留體抗炎 劑補充以皮質(zhì)激素；雖然在控制病情、阻止疾病發(fā)展中有顯著作用，但多有明顯不良反應， 且對部分患者療效不佳。B細胞和T細胞在SLE的發(fā)病機制中起著重要的作用，針對免疫細 胞的生物學療法將成為治療SLE的焦點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診 治的復合物P19/Ebi3及其多克隆抗體。相比傳統(tǒng)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷和治療方法，使 用多克隆抗體與導致自體抗體過度產(chǎn)生的病理性免疫響應相互作用或將其糾正的特異性 治療將更有優(yōu)勢，如具有較高的特異性與準確性，較低的副作用，從而實現(xiàn)治愈系統(tǒng)性紅斑 狼瘡和/或在長期基礎上改善患者的生活品質(zhì)的病因性治療。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種分離的P19/Ebi3復合物。
[0008] 進一步，上面所提到的復合物是由P19和Ebi3兩個亞基組成的。
[0009] 進一步，上面所提到的P19亞基包括如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的蛋白，或 其保守性變異蛋白。
[0010] 進一步，上面所提到的Ebi3亞基包括如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白， 或其保守性變異蛋白。
[0011] 進一步，上面所述的亞基是由多核苷酸編碼的，所述的P19亞基的核苷酸序列如 SEQIDNO: 3所示；所述的Ebi3亞基的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0012] 本發(fā)明提供了一種重組載體，它含有上面所述的多核苷酸序列。
[0013] 進一步，所述的重組載體中還含有與所述的多核苷酸序列操作性相連的表達調(diào)控 序列。
[0014] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0015] 病毒載體可以是任何適當?shù)妮d體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
[0016] 真核表達載體可以是任何適當?shù)谋磉_載體，包括但不限于pCMV-Myc表達載體、 pcDNA3. 0表達載體、pcDNA3. 1表達載體、pEGFP表達載體、pEFBos表達載體、pTet表達載 體、PTRE表達載體、pReceiver-Lvl8表達載體、pZE-LV122X表達載體或者在公知表達載體 的基礎上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
[0017] 優(yōu)選地，所述表達載體為真核表達載體。優(yōu)選地，所述真核表達載體為 pReceiver_Lvl8 和pEZ_LV122X表達載體。
[0018] 本發(fā)明提供了一種宿主細胞，它含有所述的重組載體，或其基因組中整合有所述 的多核苷酸。
[0019] 優(yōu)選地，所述宿主細胞為CHO細胞。
[0020] 本發(fā)明提供了一種P19/Ebi3復合物的制備方法，它包括下列步驟：
[0021] (a)培養(yǎng)所述的宿主細胞；
[0022] (b)從培養(yǎng)物中分離出所述的復合物。
[0023] 本發(fā)明提供了一種抗體，所述抗體特異性識別和/或結合所述的復合物。
[0024] 優(yōu)選地，所述的抗體為多克隆抗體。
[0025] 本發(fā)明提供了一種制備抗體的方法，所述方法包括：以所述的復合物免疫動物，從 免疫后的動物體內(nèi)分離出所述復合物的特異性抗體。
[0026] 優(yōu)選地，所述抗體為多克隆抗體，用以下所述方法制備：
[0027] 用所述的復合物與完全弗氏佐劑混合（按照體積比1:2~2:1混合，優(yōu)選地按照 體積比1:1混合）后免疫小鼠，2周后用所述的復合物與不完全弗氏佐劑混合（按照體積比 1:2~2:1混合，優(yōu)選地按照體積比1:1混合）后強化免疫小鼠，按照相同的方式再次強化 免疫2-3次，1-2周后從血清中分離出多克隆抗體。
[0028] 本發(fā)明提供了P19/Ebi3復合物在制備抑制B細胞向漿細胞分化藥物中的應用。
[0029] 進一步，所述漿細胞為B細胞分化的（GL7+)漿細胞。
[0030] 進一步，P19/Ebi3復合物的特異性抗體、基于P19/Ebi3復合物的腫瘤疫苗、用于 抑制P19/Ebi3復合物活性的蛋白質(zhì)，抑制P19/Ebi3復合物活性的化合物。
[0031] 本發(fā)明提供了一種P19/Ebi3復合物在制備診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡產(chǎn)品中的應用。
[0032] 進一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：通過免疫檢測、免疫共沉淀、ELISA或芯片 來檢測P19/Ebi3復合物的水平以診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品。
[0033] 進一步，所述用免疫檢測來診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品包括：與P19/Ebi3復合物 特異性結合的抗體；所述用免疫共沉淀來診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品包括：與P19/Ebi3復 合物中兩個亞基同時特異性結合的抗體；所述用ELISA來診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品包 括：ELISA試劑盒；ELISA試劑盒包括與P19/Ebi3復合物特異性結合的抗體；所述用芯片來 診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品包括：蛋白芯片；其中蛋白芯片包括與P19/Ebi3復合物特異性 結合的抗體。
[0034] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括試劑盒和芯片。
[0035] 本發(fā)明提供了P19/Ebi3復合物抑制劑在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的應 用。
[0036] 進一步，本發(fā)明所述抑制劑包括：P19/Ebi3復合物的特異性抗體、基于P19/Ebi3 復合物的腫瘤疫苗、用于抑制P19/Ebi3復合物活性的蛋白質(zhì)，抑制P19/Ebi3復合物活性的 化合物。
[0037] 進一步，所述P19/Ebi3復合物的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 P19/Ebi3復合物的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，嵌合 抗體、scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與P19/Ebi3復合物的結合能力 即可。
[0038] 優(yōu)選地，所述P19/Ebi3復合物的特異性抗體為多克隆抗體。
[0039] 進一步，所述的藥物包括所述的抗體或其活性片段。
[0040] 進一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學上可接受的載體，這類載體包括（但并不限 于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠 和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑季銨化 合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和 鎂、聚乙二醇等。
[0041] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可 以大大提尚治療的成功率。
[0042] "P19/Ebi3復合物"包括P19/Ebi3復合物以及P19/Ebi3復合物的任何功能等同 物。所述功能等同物包括P19/Ebi3復合物保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍 生物，等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與P19/Ebi3的DNA 雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0043] 優(yōu)選地，P19/Ebi3復合物是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0044] (1)由序列表中SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0045] (2)將SEQIDNO: 1和/或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基 酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與SEQIDNO: 1和/或SEQIDNO: 2所示的氨基酸 序列具有相同功能的由SEQIDNO: 1和/或SEQIDN0:2所示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。 取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳 地1-10個。
[0046] (3)與SEQIDNO: 1和/或SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性 (又稱