血小板衍生生長因子b突變體、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及血小板衍生生長因子B衍生物，具體地，本發(fā)明涉及血小板衍生生長 因子B突變體，編碼該突變體的核酸分子，含有該核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉 及所述突變體的制備方法和純化方法，以及所述突變體用于制備促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖、促進(jìn) 傷口愈合、皮膚再生、骨骼與牙齒缺損再生、關(guān)節(jié)修復(fù)的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板衍生生長因子（Platelet-derivedgrowthfactor，F(xiàn)1DGF)是一種能多種細(xì) 胞產(chǎn)生的、能夠刺激間質(zhì)來源細(xì)胞增殖的多肽，上世紀(jì)70年代首先由Ross等從血小板中發(fā) 現(xiàn)，因而得名（1)。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)4種PDGF單體PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D。 這些單體彼此通過鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵，形成5種同源或異源二聚體：H)GF-AA、TOGF-BB、 H)GF-AB、roGF-CC和H)GF-DD(2, 3)。普遍認(rèn)為I3DGF基因和蛋白屬于一類在結(jié)構(gòu)與功能上相 關(guān)的生長因子家族，這個(gè)家族還包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGFs)以及胎盤生長因子（PIGF) (4)。I3DGF通過激活其受體I3DGF-R發(fā)揮生理功能。I3DGF-R包括I3DGFR-a和TOGFR-P兩 種，屬于酪氨酸激酶受體。配體與受體結(jié)合引發(fā)受體單體的二聚化，促使胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸 殘基自體磷酸化而激活。兩種受體可以激活多條信號通路關(guān)鍵分子，如Ras-MAPK、PI3K和 PLC-Y(5)，進(jìn)而激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，刺激細(xì)胞生長、抑制凋亡，促進(jìn)分化，引起定向移動 和遷移等，發(fā)揮多種多樣的生物學(xué)功能。
[0003] roGF-b基因定位于第22號染色體，含有7個(gè)外顯子基因，編碼241個(gè)氨基酸組 成的前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解加工形成的最終成熟產(chǎn)物是109個(gè)氨基酸組成的，分子量為 12. 3kD的多肽。在生物體內(nèi)，TOGF-B蛋白的活性形式是由兩條單體通過二硫鍵形成同源 TOGF-BB或異源二聚體TOGF-AB(6)。每條TOGF-B蛋白單體含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸 殘基，其中6個(gè)半胱氨酸兩兩形成鏈內(nèi)二硫鍵（CysI-VI，III-VLV-VDI)，另外兩個(gè)則與 對應(yīng)單體之間交叉形成鏈間二硫鍵（CysII-IV)(7)共同形成TOGF蛋白家族特征性的生 長因子結(jié)構(gòu)域一半胱氨酸結(jié)。這些鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵構(gòu)成了TOGF-BB二聚體蛋白復(fù)雜的空 間結(jié)構(gòu)（圖1B)。
[0004] 另外，PDGF蛋白在表達(dá)合成時(shí)還存在不同剪切形式，使得加工成熟后的TOGF蛋白 呈現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)形式。從人血小板提取物中分離純化的H)GF-BB，通過N端氨基酸序列分析表 明存在至少三種不同的剪切形式，20%Serl，45%Thr6及35%Thr33,這些切割的異質(zhì)性， 致使在純化I3DGF-BB時(shí)各種切割形式的蛋白比例不可控（8)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量研究，發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)蛋白酶降解和/或糖基化修飾是造 成多種TOGF-B存在的主要原因，進(jìn)而通過位點(diǎn)突變獲得了TOGF-B突變體，其蛋白均一性大 大提高，并且仍保留TOGF-B蛋白的活性。
[0006] 本發(fā)明第一方面涉及血小板衍生生長因子B突變體，其在野生型血小板衍生生長 因子B的第101位和第109位氨基酸位點(diǎn)處具有突變（此處對氨基酸位點(diǎn)位置的描述均以 含109個(gè)氨基酸殘基的成熟TOGF-B為基礎(chǔ)，以下同），并且具有血小板衍生生長因子B的活 性。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體，其在第6位氨基酸 位點(diǎn)處具有突變，并且具有血小板衍生生長因子B的活性。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體，其在第32位和/或 第33位氨基酸位點(diǎn)處具有突變，并且具有血小板衍生生長因子B的活性。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體，與野生型血小板衍 生生長因子B相比，其N端缺失5個(gè)氨基酸，并且具有血小板衍生生長因子B的活性。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述突變體在第6位、第101位和第109位氨基酸位 點(diǎn)處突變?yōu)楸彼帷?br>[0011] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述突變體在第101位和第109位氨基酸位點(diǎn)處 突變?yōu)楸彼帷?br>[0012] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體，其在第32位和/或 第33位氨基酸位點(diǎn)處突變?yōu)楦彼帷⒗i氨酸或異亮氨酸。
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其在第32位氨基酸位點(diǎn)處突變?yōu)楦彼?、纈氨酸或 異亮氨酸，優(yōu)選為脯氨酸。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體，其中所述的血小 板衍生生長因子B為哺乳動物來衍生的血小板衍生生長因子B，所述哺乳動物例如為人、小 鼠。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述血小板衍生生長因子B突變體為，其N端缺失5 個(gè)氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突變?yōu)楸彼?，其?2位氨基酸突變?yōu)楦?氨酸。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述血小板衍生生長因子B突變體為，其N端缺失5 個(gè)氨基酸，其第101位和第109位氨基酸突變?yōu)楸彼?，其?2位氨基酸突變?yōu)楦彼帷?br>[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述血小板衍生生長因子B突變體為，其N端缺失5 個(gè)氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突變?yōu)楸彼?，其?2位氨基酸突變?yōu)槔i 氨酸。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述血小板衍生生長因子B突變體為，其N端缺失5 個(gè)氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突變?yōu)楸彼?，其?2位氨基酸突變?yōu)楫?亮氨酸。
[0019] 本發(fā)明還包括上述各種技術(shù)方案的組合。
[0020] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述突變體的氨基酸序列為SEQIDNO:3或SEQID NO:5所示的序列。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體，其氨基酸序列經(jīng)過 取代、缺失或添加一個(gè)幾個(gè)氨基酸，并且具有血小板衍生生長因子B的活性。
[0022] 本發(fā)明第二方面涉及血小板衍生生長因子同源或異源二聚體，其由兩個(gè)本發(fā)明第 一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體通過鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵結(jié)合而成，或者由一 個(gè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體與一個(gè)血小板衍生生長因子A通 過鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵結(jié)合而成。
[0023] 在本發(fā)明中，所述血小板衍生生長因子同源或異源二聚體的形成方式與野生型血 小板衍生生長因子相同。
[0024] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，兩個(gè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突 變體通過鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵結(jié)合，形成I3DGF-BB突變體。
[0025] 本發(fā)明第三方面涉及核酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長 因子B突變體。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)的核酸分子，其核苷酸序列選自SEQIDNO:4、SEQID NO:6~SEQIDNO:9 的序列。
[0027] 本發(fā)明第四方面涉及載體，其含有本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)的核酸分子。
[0028] 在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的不同來選擇表達(dá)載 體，例如可以選擇適合酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的載體。
[0029] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述載體為pMEX9K。
[0030] 本發(fā)明第五方面涉及宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第四方面任一項(xiàng)的載體。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其為真核細(xì)胞，例如為酵母細(xì)胞、哺乳動 物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，所述酵母細(xì)胞例如為畢赤酵母細(xì)胞 (Pichiapastoris，也叫巴斯德畢赤酵母細(xì)胞）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、 克魯維酵母（Kluyveromyceslactis)、漢遜酵母（Hansenula)、念珠酵母（Candida)或球擬 酵母（Torulopsis)。
[0033] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述畢赤酵母細(xì)胞為GS115細(xì)胞。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，所述哺乳細(xì)胞例如為CHO細(xì)胞、BHK細(xì) 胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
[0035] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體的制備方 法，其包括取本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、表達(dá)（例如誘導(dǎo)表達(dá)）以及任選 的純化的步驟。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)的制備方法，其包括以下步驟：
[0037] 1)取本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞接種至培養(yǎng)基中，經(jīng)過逐級放大培養(yǎng)；
[0038]2)收集宿主細(xì)胞，將重組細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，添加甲醇開始誘導(dǎo)表達(dá)；
[0039] 3)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后收集培養(yǎng)上清，經(jīng)純化獲得血小板衍生生長因子B蛋白。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)的制備方法，其特征在于以下幾項(xiàng)中的一項(xiàng)或數(shù)項(xiàng)：
[0041] (1)步驟1)中的宿主細(xì)胞為單克隆細(xì)胞株；
[0042](2)步驟1)中所述的逐級放大培養(yǎng)是指兩級放大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30°C，每級 均培養(yǎng)至OD6。。為1-12、例如2-6;
[0043] (3)步驟2)中誘導(dǎo)表達(dá)的溫度約為28°C;
[0044](4)步驟2)中甲醇的終濃度為0? 3-1. 0 % (v/v)，例如0? 4-0. 8 % (v/v)，例如 0. 5% (v/v)；
[0045] (5)步驟2)中誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為48-96h，例如為72h;
[0046] (6)步驟3)中的純化步驟依次包括疏水層析、離子交換層析、凝膠層析。
[0047] 本發(fā)明第六方面涉及血小板衍生生長因子B或其突變體的純化方法，其包括取含 有血小板衍生生長因子B或其突變體的培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液依次進(jìn)行疏水層析、離子交 換層析和凝膠層析的步驟。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明第六方面任一項(xiàng)的純化方法，其中所述血小板衍生生長因子B突變體 為本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的血小板衍生生長因子B突變體。
[0049] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于疏水層析的層析柱介質(zhì)為Phenyl Sepharose6Fast Flow。
[0050] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于離子交換層析的層析介質(zhì)