一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：(1)雙標(biāo)記酶結(jié)合物；(2)陰陽性對(duì)照物；(3)發(fā)光液；(4)微孔包被板。雙標(biāo)記酶結(jié)合物采用改良高碘酸鈉氧化法。本發(fā)明還公開了這種試劑盒的制備方法和使用方法，本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是相比較單獨(dú)檢測(cè)抗原或抗體的試劑，本發(fā)明試劑盒可以得到3個(gè)檢測(cè)結(jié)果，能夠全部測(cè)出體內(nèi)僅有抗原、僅有抗體、抗原抗體均有的情況，且靈敏度高。
【專利說明】-種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及其制備 方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明提供了一種人類免疫缺陷病毒抗 原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 獲得性免疫缺陷綜合征，又稱艾滋?。ˋcquired Immunodeficiency Syn^ome, AIDS),是由人類免疫缺陷病化IV)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病。HIV為逆轉(zhuǎn)錄RNA 病毒，根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測(cè)定，HIV可分為HIV-I型和HIV-2型，二者之間存 在一定的免疫交叉反應(yīng)，絕大多數(shù)艾滋病由HIV-I型引起。HIV有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因；編碼核也 蛋白的gag基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶與整合酶的POl基因和編碼胞膜蛋白的env基因。在感染 后的10?14d內(nèi)，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞并呈指數(shù)水平上升，隨后下降并保持穩(wěn)定，進(jìn)入HIV無 癥狀期。從HIV感染到能夠檢測(cè)出HIV抗體該一時(shí)期，被稱作"窗口期"，在窗口期，能夠通 過病毒RNA、p24抗原和CD4淋己細(xì)胞水平來確定HIV感染。
[0003] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球估計(jì)有3590至4430萬人與人類免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至 640萬人屬于新發(fā)感染病例，有280至350萬人死于艾滋病，該些數(shù)字并在不斷增長(zhǎng)中。2013 年我國(guó)艾滋病病毒感染者約100萬人，因艾滋病死亡約24萬人，居亞洲第2位。梅毒感染 者近年來持續(xù)上升，為己類傳染病第H位，目前，艾滋病已成為嚴(yán)重威脅世界人民健康的公 共衛(wèi)生問題。
[0004] 艾滋病毒的檢測(cè)十幾年來一直沿用傳統(tǒng)的酶免方法，但隨著民眾法律意識(shí)的強(qiáng) 化、對(duì)健康關(guān)注度的提升W及院方醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)防范意識(shí)的普及等，傳統(tǒng)酶免檢測(cè)的靈敏度和 特異性得到了挑戰(zhàn)。但鑒于方法學(xué)的限制，酶免技術(shù)已經(jīng)很難再有改進(jìn)，本發(fā)明專利即提供 一種抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明試劑盒將HIV抗原與抗p24抗體一起包被固相載 體，可同時(shí)檢測(cè)樣品中的抗體和p24抗原，該一技術(shù)的應(yīng)用使得HIV感染的常規(guī)檢測(cè)窗口 期明顯縮短。篩查人類免疫缺陷病毒化IV)抗體可W使HIV感染者的平均存活時(shí)間增加 1.5年W上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決傳統(tǒng)酶免檢測(cè)的靈敏度不高和特異性差的問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案 是：
[0006] -種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：
[0007] (1)雙標(biāo)記酶結(jié)合物；
[0008] (2)陰陽性對(duì)照物；
[0009] (3)發(fā)光液；所述發(fā)光液包括發(fā)光液1和發(fā)光液2,發(fā)光液1為含有0. 7g/L魯米 諾（Luminol)，0. 9g/L肉桂酸，0. 2g/L4-楓苯測(cè)酸，0. 25g/L對(duì)楓苯酷，25ml/L二甲基甲醜 胺（DMF)，5g/L聚己帰醇（PVA)，8g/L聚己帰化咯焼麗（PVP)，3g/L聚己二醇600 (PEG-600)， 4g/L己二胺四己酸（邸TA)，160萬單位/L硫酸慶大霉素，0. 4g/L過氧化脈，pH9. O的 0. Imol/L的Tris緩沖液；發(fā)光液2為含有0. Img/ml嚇巧醋衍生物、3g/L聚己二醇 600(PEG-600)、0. 1% TWEEN-20pH9. 0 的 0. Imol/L 的 Tris 緩沖液；
[0010] (4)微孔包被板。
[0011] 進(jìn)一步，所述雙標(biāo)記酶結(jié)合物的制備方法是；采用改良高楓酸軸氧化法，將辣根過 氧化物酶標(biāo)記到HIV嵌合抗原上，采用邸C法（常用方法，業(yè)內(nèi)人都知道）將堿性磯酸酶標(biāo) 記到另一 P24單抗上，將嵌合抗原-HRP按照0. 1 y g/ml，p24m油-ALP按照0. 2 y g/ml稀釋 到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶結(jié)合物稀釋液中，作為酶工作液，于2?8°C下儲(chǔ) 存。
[0012] 進(jìn)一步，所述微孔板包被制備方法是；將包含有甜36,甜41，甜120的嵌合抗原和 p24單抗用0. 02M磯酸鹽緩沖液稀釋至1?10 y g/mL，同時(shí)加入到96孔白色不透明塑料 微孔板中，37C包被2小時(shí)或2-8C包被16小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS緩沖液洗板， 然后加入含0. 5% BSA的磯酸鹽緩沖液封閉微孔板，37C封閉2小時(shí)或2-8C封閉16小時(shí)； 棄去孔內(nèi)液體，甩干后于37C烘干4小時(shí)；裝入鉛鉛袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于 2 ?8〇C。
[001引進(jìn)一步，所述陰陽性對(duì)照物分比為：陰性混合人血清作為陰性對(duì)照，在陰性血清中 加入HIV-I抗體作為陽性對(duì)照1，在陰性血清中加入HIV-2抗體作為陽性對(duì)照2,在陰性血 清中加入p24抗原作為陽性對(duì)照3。
[0014] 本發(fā)明還公開了該種試劑盒的使用方法：
[0015] (1)將50 y 1陰性對(duì)照和H個(gè)陽性對(duì)照及待檢樣品分別加入微孔板不同微孔中， 37 C賠育30分鐘；
[0016] (2)用含有tween20的Tris鹽緩沖液清洗微孔板5次，拍干；
[0017] (3)每孔加入50 y 1雙標(biāo)記酶結(jié)合物，37C賠育30分鐘；
[0018] (4)同第（2)步完成清洗后，每孔各加入IOOy 1發(fā)光液1，賠育5分鐘用光子計(jì)數(shù) 器讀數(shù)，所測(cè)發(fā)光值W陰性對(duì)照的2. 1倍作為cutoff判定值進(jìn)行S/C0計(jì)算；
[0019] (5)完成讀數(shù)后同第（2)步完成清洗后，每孔加入100 Ul發(fā)光液2,賠育10分鐘 用光子計(jì)數(shù)器讀數(shù)，所測(cè)發(fā)光值W陰性對(duì)照的2. 1倍作為cutoff判定值進(jìn)行S/C0計(jì)算；
[0020] 做第（4)步所測(cè)S/C0值大于等于1的樣本判定為抗體陽性；
[002。 （7)第妨步所測(cè)S/C0值大于等于1的樣本判定為抗原陽性；
[0022] (8)第（6)步和第（7)步所測(cè)S/C0的和為抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果。
[0023] 本發(fā)明的HIV化學(xué)發(fā)光免疫定量測(cè)定試劑盒，采用雙標(biāo)記，雙底物的化學(xué)發(fā)光免 疫分析檢測(cè)方法，突破了傳統(tǒng)單標(biāo)記、單底物的檢測(cè)技術(shù)，具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] (1)相比較單獨(dú)檢測(cè)抗原或抗體的試劑，本發(fā)明試劑盒可W得到3個(gè)檢測(cè)結(jié)果，能 夠全部測(cè)出體內(nèi)僅有抗原、僅有抗體、抗原抗體均有的情況，且靈敏度高，在體內(nèi)抗原或抗 體量很少時(shí)也能測(cè)出，彌補(bǔ)了單獨(dú)檢測(cè)抗原或抗體的不足；相比較抗原抗體聯(lián)檢、單獨(dú)標(biāo)記 的試劑，本發(fā)明試劑盒增強(qiáng)了靈敏度，能更加有效的區(qū)分"窗口期"、"無癥狀期"、"艾滋病發(fā) 病期"等階段，為臨床診斷治療提供了更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，能更好的對(duì)患者進(jìn)行治療；
[00巧](2)反應(yīng)快速，可W在30min內(nèi)出結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，無污染；

【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1
[0027] -種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：
[0028] (1)雙標(biāo)記酶結(jié)合物；
[0029] (2)陰陽性對(duì)照物；
[0030] (3)發(fā)光液；所述發(fā)光液包括發(fā)光液1和發(fā)光液2,發(fā)光液1為含有0. 7g/L魯米 諾，0. 9g/L肉桂酸，0. 2g/L4-楓苯測(cè)酸，0. 25g/L對(duì)楓苯酷，25ml/L二甲基甲醜胺，5g/L聚 己帰醇，8g/L聚己帰化咯焼麗，3g/L聚己二醇600,4g/L己二胺四己酸，160萬單位/L硫酸 慶大霉素，0. 4g/L過氧化脈，pH9. 0的0. Imol/L的Tris緩沖液；發(fā)光液2為含有0. Img/ml 嚇巧醋衍生物、3g/L聚己二醇600、0. 1% TWEEN-20pH9. 0的0. Imol/L的Tris緩沖液；
[0031] (4)微孔包被板。
[00礎(chǔ) 實(shí)施例2
[0033] 實(shí)施例1所述試劑盒的制備方法
[0034] 1、微孔板包被；將包含有甜36,甜41，甜120的嵌合抗原和p24單抗用0. 02M磯酸 鹽緩沖液稀釋至1?lOug/mU同時(shí)加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37C包被2小 時(shí)或2-8C包被16小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用抑7. 4PBS緩沖液洗板，然后加入含0. 5% BSA的 磯酸鹽緩沖液封閉微孔板，37C封閉2小時(shí)或2-8C封閉16小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后于 37C烘干4小時(shí)；裝入鉛鉛袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于2?8C ;
[00巧]2、雙標(biāo)記酶結(jié)合物制備：采用改良高楓酸軸氧化法，將辣根過氧化物酶標(biāo)記到 HIV嵌合抗原上，采用邸C法將堿性磯酸酶標(biāo)記到另一 P24單抗上，將嵌合抗原-HRP按照 0. 1 y g/ml，p24m油-ALP按照0. 2 y g/ml稀釋到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶結(jié)合 物稀釋液中，作為酶工作液，于2?8C下儲(chǔ)存；
[003引 3、陰陽性對(duì)照物；采用陰性混合人血清作為陰性對(duì)照，在陰性血清中加入HIV-I 抗體作為陽性對(duì)照1，在陰性血清中加入HIV-2抗體作為陽性對(duì)照2,在陰性血清中加入p24 抗原作為陽性對(duì)照3 ;
[0037] 4、發(fā)光底物液1，發(fā)光底物液2 ;發(fā)光液1為含有0. 7g/L魯米諾（Luminol)，0.9g/ L肉桂酸，0. 2g/L4-楓苯測(cè)酸，0. 25g/L對(duì)楓苯酷，25ml/L二甲基甲醜胺（DMF)，5g/L聚己 帰醇（PVA)，8g/L聚己帰化咯焼麗（PVP)，3g/L聚己二醇600 (PEG-600)，4g/L己二胺四 己酸（邸TA)，160萬單位/L硫酸慶大霉素，0. 4g/L過氧化脈，pH9. 0的0. Imol/L的Tris 緩沖液；發(fā)光液2為含有0. Img/ml嚇巧醋衍生物、3g/L聚己二醇600(陽G-600)、0. 1% TWEEN-20pH9. 0 的 0. Imol/L 的 Tris 緩沖液。
[00測(cè) 實(shí)施例3
[0039] 實(shí)施例1所述試劑盒的使用方法
[0040] (1)將50 U 1陰性對(duì)照和H個(gè)陽性對(duì)照及待檢樣品分別加入微孔板不同微孔中， 37 C賠育30分鐘；
[00川 （2)用含有tween20的Tris鹽緩沖液清洗微孔板5次，拍干；
[0042] (3)每孔加入50 U 1雙標(biāo)記酶結(jié)合物，37C賠育30分鐘；
[0043] (4)同第（2)步完成清洗后，每孔各加入IOOy 1發(fā)光液1，賠育5分鐘用光子計(jì)數(shù) 器讀數(shù)，所測(cè)發(fā)光值W陰性對(duì)照的2. 1倍作為cutoff判定值進(jìn)行S/C0計(jì)算；
[0044] (5)完成讀書后同第（2)步完成清洗后，每孔加入100 Ul發(fā)光液2,賠育10分鐘 用光子計(jì)數(shù)器讀數(shù)，所測(cè)發(fā)光值W陰性對(duì)照的2. 1倍作為cutoff判定值進(jìn)行S/C0計(jì)算；
[0045] (6)第（4)步所測(cè)S/C0值大于等于1的樣本判定為抗體陽性；
[004引 （7)第妨步所測(cè)S/C0值大于等于1的樣本判定為抗原陽性；
[0047] (8)第（6)步和第（7)步所測(cè)S/C0的和為抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果。
[004引 實(shí)施例4
[004引 1.國(guó)豕參考品
[0050] 1. 1.使用國(guó)家參考品對(duì)試劑盒進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如下。
[0051] 表1 HIV抗體國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1) 雙標(biāo)記酶結(jié)合物； (2) 陰陽性對(duì)照物； (3) 發(fā)光液；所述發(fā)光液包括發(fā)光液1和發(fā)光液2,發(fā)光液1為含有0. 7g/L魯米諾， 0. 9g/L肉桂酸，0. 2g/L4-碘苯硼酸，0. 25g/L對(duì)碘苯酚，25ml/L二甲基甲酰胺，5g/L聚乙烯 醇，8g/L聚乙烯吡咯烷酮，3g/L聚乙二醇600,4g/L乙二胺四乙酸，160萬單位/L硫酸慶大 霉素，0. 4g/L過氧化脲，pH9. 0的0. lmol/L的Tris緩沖液；發(fā)光液2為含有0. lmg/ml吖啶 酯衍生物、3g/L 聚乙二醇 600、0. 1% TWEEN-20pH9. 0 的 0. lmol/L 的 Tris 緩沖液； (4) 微孔包被板。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，所述雙標(biāo)記酶結(jié)合物的制備方法是：采用改良高碘酸鈉氧化法，將辣根過氧化物酶標(biāo)記 到HIV嵌合抗原上，采用EDC法將堿性磷酸酶標(biāo)記到另一 P24單抗上，將嵌合抗原-HRP按 照0. 1 μ g/ml，p24mab-ALP按照0. 2 μ g/ml稀釋到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶結(jié) 合物稀釋液中，作為酶工作液，于2?8°C下儲(chǔ)存。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒,其特征 在于，所述微孔板包被制備方法是：將包含有g(shù)p36, gp41，gpl20的嵌合抗原和p24單抗用 0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋至1?10 μ g/mL，同時(shí)加入到96孔白色不透明塑料微孔板中， 37°C包被2小時(shí)或2-8°C包被16小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS緩沖液洗板，然后加入 含0. 5% BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)或2-8°C封閉16小時(shí)；棄去孔內(nèi) 液體，甩干后于37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于2?8°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，所述陰陽性對(duì)照物分別為：陰性混合人血清作為陰性對(duì)照，在陰性血清中加入HIV-1抗 體作為陽性對(duì)照1，在陰性血清中加入HIV-2抗體作為陽性對(duì)照2,在陰性血清中加入p24 抗原作為陽性對(duì)照3。
5. 權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述本發(fā)明試劑盒的使用方法： (1) 將50μ 1陰性對(duì)照和三個(gè)陽性對(duì)照及待檢樣品分別加入微孔板不同微孔中，37°C 孵育30分鐘； (2) 用含有tween20的Tris鹽緩沖液清洗微孔板5次，拍干； (3) 每孔加入50 μ 1雙標(biāo)記酶結(jié)合物，37°C孵育30分鐘； (4) 同第⑵步完成清洗后，每孔各加入ΙΟΟμΙ發(fā)光液1，孵育5分鐘用光子計(jì)數(shù)器讀 數(shù)，所測(cè)發(fā)光值以陰性對(duì)照的2. 1倍作為cutoff判定值進(jìn)行S/C0計(jì)算； (5) 完成讀數(shù)后同第（2)步完成清洗后，每孔加入100μ 1發(fā)光液2,孵育10分鐘用光 子計(jì)數(shù)器讀數(shù)，所測(cè)發(fā)光值以陰性對(duì)照的2. 1倍作為cutoff判定值進(jìn)行S/C0計(jì)算； (6) 第（4)步所測(cè)S/C0值大于等于1的樣本判定為抗體陽性； (7) 第（5)步所測(cè)S/C0值大于等于1的樣本判定為抗原陽性； (8) 第（6)步和第（7)步所測(cè)S/C0的和為抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK104237510SQ201410466445
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】劉萍, 欒大偉, 張振斌, 侯玉文, 楊桂霞, 李克錦 申請(qǐng)人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司