人類免疫缺陷病毒hiv-1的定量檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及診斷技術領域，特別是涉及一種人類免疫缺陷病毒Hiv-I的定量檢測 試劑盒。
【背景技術】
[0002] HIV感染可以通過檢測病毒的抗體、抗原、核酸來確定。目前，常用的檢測方法是血 清學HIV抗體檢測，它是診斷艾滋病病毒感染和艾滋病的主要指標和標準檢測項目。
[0003] HIV病毒核酸檢測原理是利用核酸檢測的方法，直接檢測HIV病毒的核酸RNA。 核酸檢測具有快速、高效、敏感和特異等優(yōu)點，在感染過程中，患者體內(nèi)首先出現(xiàn)的是病毒 RNA，這時可以采用核酸檢測的方法檢測出來，之后出現(xiàn)的是IgM抗體，采用雙抗原夾心法 檢測出來，然后出現(xiàn)的是IgG抗體，使用間接法檢測出來，因此，HIV病毒核酸檢測技術的應 用使HIV病毒的檢測"窗口期"由原來的22天縮短到11天。
[0004] 傳統(tǒng)的HIV病毒的定量檢測試劑盒通常需要從樣本中提取純化的核酸分子 (HIV-RNA)，而從樣本中提取核酸的步驟操作復雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，有必要提供一種不需要從樣本中提取核酸就可以完成檢測的人類免疫缺 陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒。
[0006] -種人類免疫缺陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒，包括：
[0007] 樣本處理劑，包括異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌酸鈉、P_巰基乙醇和蛋白酶 K;
[0008] 用于靶核苷酸擴增的上游引物HIV-F;
[0009] 用于靶核苷酸擴增的下游引物HIV-R;
[0010] 用于革E核苷酸檢測的Taqman探針HIV-P，所述Taqman探針Hiv-P的兩端分別結(jié)合 有熒光基團和熒光猝滅劑；以及
[0011] RNA-步法反應緩沖液。
[0012] 在一個實施例中，所述樣本處理劑用于與檢測樣本混合均勻后在55°C~70°C加 熱IOmin~15min〇
[0013] 在一個實施例中，所述樣本處理劑中，所述異硫氰酸胍的濃度為0. 2mol/L~ 2mol/L，所述梓檬酸鈉的濃度為10mmol/L~30mmol/L，所述十二烷基肌酸鈉的質(zhì)量百分含 量為0.2%~1%，所述(6-巰基乙醇的濃度為0.05mol/L~0?lmol/L，所述蛋白酶K的濃 度為lmg/mL~5mg/mL〇
[0014] 在一個實施例中，所述上游引物HIV-F的序列為SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 2所 示的序列，所述下游引物HIV-R的序列為SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5或SEQ IDNo. 6所示的序列。
[0015] 在一個實施例中，所述Taqman探針HIV-P的序列為SEQIDNo. 7或SEQIDNo. 8 所示的序列。
[0016] 在一個實施例中，所述Taqman探針HIV-P的5'端結(jié)合有FAM，所述Taqman探針 HIV-P的3'端結(jié)合有BHQl。
[0017] 在一個實施例中，還包括HIV-I內(nèi)標的RNA轉(zhuǎn)錄物和內(nèi)標探針HIV-IC，所述HIV-I 內(nèi)標的RNA轉(zhuǎn)錄物為HIV-I內(nèi)標轉(zhuǎn)錄得到，所述HIV-I內(nèi)標為克爭性內(nèi)標，所述內(nèi)標探針 HIV-IC的兩端分別結(jié)合有熒光基團和熒光猝滅劑。
[0018] 在一個實施例中，所述HIV-I內(nèi)標的序列為SEQIDNo.9所示的序列。
[0019] 在一個實施例中，所述內(nèi)標探針HIV-IC的堿基序列序列為SEQIDNo. 10所示的 序列，所述內(nèi)標探針HIV-IC的5'端結(jié)合有HEX，所述內(nèi)標探針HIV-IC的3'端結(jié)合有BHQl。
[0020] 在一個實施例中，還包括HIV-I定量參考品、HIV-I陽性對照和HIV-I陰性對照。
[0021] 這種人類免疫缺陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒在進行檢測時，直接將檢測樣本 與樣本處理劑混合處理后即可用于后續(xù)檢測。相對于傳統(tǒng)的HIV病毒的定量檢測試劑盒， 這種人類免疫缺陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒省略了從樣本中提取純化的核酸分子的 步驟，從而操作上更為省時、簡單。
【附圖說明】
[0022] 圖Ia為實施例1優(yōu)化反應體系和反應條件前的熒光檢測結(jié)果圖；
[0023] 圖Ib為實施例1優(yōu)化反應體系和反應條件后的熒光檢測結(jié)果圖；
[0024] 圖2a為實施例2中的對定量標準品進行梯度稀釋后檢測線性范圍的熒光檢測結(jié) 果圖；
[0025] 圖2b為實施例2中的對定量標準品進行梯度稀釋后平行檢測10管HIV-I載量為 100IU/mL模板的熒光檢測結(jié)果圖；
[0026] 圖2c為實施例2中的對定量標準品進行梯度稀釋后平行檢測10管HIV-I載量為 50IU/mL模板的熒光檢測結(jié)果圖；
[0027] 圖2d為實施例2中的對定量標準品進行梯度稀釋后平行檢測10管HIV-I載量為 25IU/mL模板的熒光檢測結(jié)果圖；
[0028]圖3為實施例3中的對定量標準品進行梯度稀釋后的進行精密度檢測的熒光檢測 結(jié)果圖；
[0029] 圖4a為實施例4中采用10份"HIV-1RNA國家標準品"中的陽性參考品的熒光檢 測結(jié)果圖；
[0030] 圖4b為實施例4中采用正常人血清和其他血源性病原微生物的熒光檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對人類免疫缺陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒 做進一步的解釋說明。
[0032] -實施方式的人類免疫缺陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒，包括：樣本處理劑、用 于靶核苷酸擴增的上游引物HIV-F、用于靶核苷酸擴增的下游引物HIV-R、用于靶核苷酸檢 測的Taqman探針HIV-P以及RNA-步法反應緩沖液。
[0033] 樣本處理劑包括異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌酸鈉、P-巰基乙醇和蛋白酶 K0
[0034] 樣本處理劑用于與檢測樣本混合均勾后在55°C~70°C加熱IOmin~15min;其 中，樣本處理劑與檢測樣本的體積比可以為2~1 :1。
[0035] 具體的，樣本處理劑中，異硫氰酸胍的濃度為0. 2mol/L~2mol/L，檸檬酸鈉的濃 度為lOmmol/L~30mmol/L，十二烷基肌酸鈉的質(zhì)量百分含量為0. 2%~1 %，-巰基乙醇 的濃度為〇? 〇5mol/L~0?lmol/L，蛋白酶K的濃度為lmg/mL~5mg/mL。
[0036] 本實施方式中，上游引物HIV-F、下游引物HIV-R和Taqman探針HIV-P是選取HIV 基因gag區(qū)的一段保守序列進行設計，由于HIV-I病毒亞型較多，基因序列變異復雜，上游 引物HIV-F和下游引物HIV-R均為簡并引物。
[0037] 通常情況下可以將上游引物HIV-F、下游引物HIV-R和Taqman探針HIV-P直接溶 解在RNA-步法反應緩沖液中，上游引物HIV-F和下游引物HIV-R在RNA-步法反應緩沖 液中的終濃度均為〇? 2ymol/L~0? 4ymol/L，Taqman探針HIV-P在RNA-步法反應緩沖 液中的終濃度為〇? 05umol/L~0? 2umol/L。
[0038] 具體的，上游引物HIV-F的序列為SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 2所示的序列，下游 引物HIV-R的序列為SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5 或SEQIDNo. 6 所示的序 列。
[0039]Taqman探針HIV-P的兩端分別結(jié)合有熒光基團和熒光猝滅劑。
[0040] 具體的，Taqman探針HIV-P的5'端結(jié)合有FAM(羥基焚光素，Carboxyfluorescei n)，Taqman探針HIV-P的3 '端結(jié)合有BHQl(BLACKHOLEQUENCHER?系列非熒光染料）。 Taqman探針HIV-P的序列為SEQIDNo. 7或SEQIDNo. 8所示的序列。
[0041]RNA-步法反應緩沖液包括Tris-HCl、硫酸銨、氯化鉀、硫酸鎂和Tween20。具體 的，RNA-步法反應緩沖液中，Tris-HCl的終濃度為lOmmol/L~65mmol/L，硫酸銨的終濃 度為10mmol/L~20mmol/L，氯化鉀的終濃度為40mmol/L~80mmol/L，硫酸鎂的終濃度為 2mmol/L~5mmol/L，Tween20與RNA-步法反應緩沖液的體積比為0. 01~2 :100。
[0042] 本實施方式中，人類免疫缺陷病毒HIV-I的定量檢測試劑盒還包括反應酶系，反 應酶系包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNasin。
[0043] 具體地，反應酶系中，TaqDNA聚合酶的終濃度為0? 5U/yL~5U/yL，四種核苷酸 單體（dNTPs)的終濃度均為0? 2mmol/L，BSA的終濃度為0? 2mg/mL~0? 5mg/mL，逆轉(zhuǎn)錄酶 的終濃度為2U/yL~20U/yL，RNasin的終濃度為0? 2U/yL~IU/yL。其中，TaqDNA聚 合酶為改良的可抗抑制劑的TaqDNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶為改良的可以提高逆轉(zhuǎn)錄效率和特 異性的逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0044] 在其他的實施方式