人TERT基因rs2853669位點多態(tài)性檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及測定單核苷酸多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] SNP(單核苷酸多態(tài)性）是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式?；蚨鄳B(tài)性是個體與生倶來的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應(yīng)用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測在遺傳學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進化等遺傳學(xué)現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史， 闡明物種進化關(guān)系。應(yīng)用于考古學(xué)中以確定古人類遺傳變異特征以及不同種群的親緣關(guān) 系。2.研究多態(tài)與種群未緣關(guān)系等遺傳學(xué)研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關(guān)，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以用于疾病預(yù)防措施。通過研究人體 對毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對某種毒物發(fā)生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸， 保護該易感人群。例如，對準(zhǔn)備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態(tài)檢測，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應(yīng)的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學(xué)中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過多態(tài)檢測可以判斷患病個體對某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效 果的反應(yīng)程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 端粒相關(guān)基因在保護端粒結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮著重要的作用。 TERT(Telomerasereversetranscriptase，TERT)是逆轉(zhuǎn)錄酶家族成員之一，有 7 個保守 序列結(jié)構(gòu)為逆轉(zhuǎn)錄酶功能域，是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶。TERT的表達域與端粒酶活性呈平行 關(guān)系，TERT基因轉(zhuǎn)錄水平被認為是調(diào)節(jié)端粒酶活性的主要限速步驟，而端粒酶活性可以作 為腫瘤診斷指標(biāo)之一。TERT基因rs2853669位點多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因C和T， 形成三種TERT基因的基因型：CC型（人體基因組rs2853669多態(tài)位點的兩個等位基因堿 基均為C)，CT型（人體基因組rs2853669多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為C和T)和 TT型（人體基因組rsl0250202多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為T)。
[0005] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)（PCR-RFLP)技術(shù)是一種快速、簡便、準(zhǔn) 確、低成本測定SNP(單核苷酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來對模板進行 擴增反應(yīng)，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物，通過對擴增產(chǎn)物的酶切和檢測酶切產(chǎn)物的片 段長度，最終測定出SNPJERT基因rs2853669多態(tài)位點無內(nèi)切酶可以識別，不能采取PCR- RFLP技術(shù)進行檢測，需要開發(fā)新的檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測定人TERT基因 rs2853669位點多態(tài)性的可靠手段。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測定人TERT基因rs2853669位點多態(tài)性的方 法，包括：
[0008] 提供待測人基因組DNA;
[0009] 提供擴增人TERT基因rs2853669位點附近序列的上游引物和下游引物，其中上游 引物具有錯配喊基G;
[0010] 以所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應(yīng)以 獲得含GGTYC片段或GACCGCGGTY片段的擴增產(chǎn)物，其中Y為人TERT基因rs2853669位點 上的待定堿基C或T;
[0011] 提供限制性內(nèi)切酶；
[0012] 利用限制性內(nèi)切酶對所得擴增產(chǎn)物進行酶切（反應(yīng)）以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以 及
[0013] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人TERT基因rs2853669位點上的待定堿基Y是C還是 T，
[0014] 其中，限制性內(nèi)切酶為能夠切開GGTTC片段與GGTCC片段之一的限制性內(nèi)切酶， 或能夠切開GACCGCGGTT片段與GACCGCGGTC片段之一的限制性內(nèi)切酶。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物的錯配堿基G與Y之間相隔一 個堿基T。令人驚訝的是，如此設(shè)置錯配堿基將使酶切反應(yīng)進行得極其順利，不會出現(xiàn)酶切 不充分等現(xiàn)象。并且，如此設(shè)置下游引物錯配堿基使PCR反應(yīng)進行順利，提高了PCR的靈敏 度和特異度，這可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。
[0016] 在本發(fā)明的具體實施例中，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與Y相鄰。例 如，上游引物末端可以是......GGT等結(jié)構(gòu)。
[0017] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，限制性內(nèi)切酶可以采用僅能開切開GGTCC片段的 Avail或其同裂酶。這類Avail酶價格低廉，能大大降低測定成本。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴增產(chǎn)物（較短 片段通常不能有效觀測到）。通過觀測（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人TERT 基因rs2853669位點上的待定堿基是C還是T。例如，在采用Avail酶的情況下，根據(jù)總片 段和切斷后較長片段這兩個片段的觀察結(jié)果來進行判斷：如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具 有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物，則待定堿基為T;如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較 長片段（小于總片段長度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為C;如果觀察到上述二者，則待定堿 基既包括C又包括T。
[0019] 在本發(fā)明的一個實施例中，判斷（或觀測）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照圖對比來進行的。這種情況下，優(yōu)選參照圖是擴增產(chǎn)物在 凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖 像位置，其中第一參照圖像位置針對的是未切斷的總片段長度的擴增產(chǎn)物，而第二參照圖 像位置則針對的是切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照圖是由合成 的112bp和70bp兩個堿基片段同時經(jīng)凝膠電泳相同時間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復(fù)合參照圖相比，由于采用了僅具有兩個特定參照圖像位置的參照圖，本發(fā)明的 這種方法能夠直觀快速地觀測或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時最大限度地避免了 誤判。酶切反應(yīng)后，優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進行電泳，增加圖像亮度，提高判 斷準(zhǔn)確性。
[0020] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過設(shè)計上游引物和下游引物的長度而使得擴增產(chǎn)物 的總片段長度在1〇〇至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，優(yōu)選長度40~ 60bp(在該優(yōu)選區(qū)間擴增反應(yīng)尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段長度 的百分比超過20%。本發(fā)明的這種設(shè)計可以使得具有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物與切斷 后具有較長片段的擴增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過長，則電 泳位移將不明顯；過短則圖像會變得模糊一片，無法準(zhǔn)確區(qū)分。上游引物的片段長度范圍保 證了PCR擴增反應(yīng)能夠順利進行，避免了錯配堿基時會出現(xiàn)的擴增不足現(xiàn)象。
[0021] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴增反應(yīng)的特異性），使得設(shè)計的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的這種設(shè)計可以使得PCR擴增產(chǎn)物條帶清楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難以區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時間15~30s(該時間可提高擴增反應(yīng)的效率和擴增產(chǎn)物的特異性），使得設(shè)計 的PCR反應(yīng)時間較短，擴增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的這種設(shè)計可以使PCR擴增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶