一種檢測(cè)羊四種病原菌的多重pcr檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病原體檢測(cè)技術(shù)，特別是用于檢測(cè)羊體內(nèi)肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的多重PCR檢測(cè)用引物及多重PCR檢測(cè)方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)向規(guī)模化、集約化方向發(fā)展以及各類畜禽疫病發(fā)病種類的不斷增多，羊群疾病發(fā)生的種類在不斷增加，而且發(fā)病率顯著上升，肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、布氏桿菌和葡萄球菌等是導(dǎo)致羊群發(fā)病的主要細(xì)菌性病原菌(賈俊元，2009)，而且細(xì)菌多重感染發(fā)生日益頻繁、越來(lái)越普遍，給規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重地威脅到羊養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。牛鐘相等(1996)報(bào)道了山羊“猝死癥”是由肺炎克雷伯氏菌與凝結(jié)芽孢桿菌的混合感染導(dǎo)致，房海等在2005年報(bào)道了一起肺炎克雷伯氏菌導(dǎo)致小尾寒羊死亡。沙門氏菌和大腸桿菌都是目前世界公認(rèn)的重要致病菌，包玉花等在2003年研究發(fā)現(xiàn)，羊大腸桿菌病一年四季均可發(fā)生，但多發(fā)于冬春舍飼時(shí)期，發(fā)病急、死亡快，可引起嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥，是危害我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的重要傳染病之一；而薛俊龍2011年報(bào)道，羊大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種急性細(xì)菌性傳染病，各種年齡的羊都易感，臨床上以嚴(yán)誼腹瀉和敗血癥為特征，在我國(guó)內(nèi)蒙，青海，寧夏，云南，山西，山東等地，該病均有發(fā)生，加之從業(yè)人員技術(shù)水平卻相對(duì)滯后，使得羊大腸桿菌病成為規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。
[0004]當(dāng)前檢測(cè)致病細(xì)菌方法還是以傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定為主，然后進(jìn)一步用免疫學(xué)方法進(jìn)行血清分型及生化鑒定。傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法每次僅能鑒定一種病原菌，檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，操作繁瑣，因此，臨床上迫切需要一種能夠快速同時(shí)鑒定多種病原菌混合感染的檢測(cè)方法。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種DNA擴(kuò)增技術(shù)，一次可以檢測(cè)多個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種病原菌的同步檢測(cè)。有研究以Salmonella的invA、ompC、IpaB 和 hilA 基因，E.coli 的 HlyA、rfbE 和 phoA 基因，K.pneumoniae 的 mrkA、mrkD 基因?yàn)榘谢?，建立單一或雙重PCR方法檢測(cè)不同的病原菌，對(duì)于肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌4種導(dǎo)致毛皮死亡病原菌的四重PCR檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。本發(fā)明建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌的四重PCR檢測(cè)方法，為快速檢測(cè)導(dǎo)致羊發(fā)病的致病菌，及時(shí)采取有效的防制措施提供依據(jù)。
[0005]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR已成為細(xì)菌檢測(cè)的重要方法之一。多重PCR由Chamberian等于1988年提出以來(lái)，與常規(guī)PCR相比，多重PCR簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，更為快捷和經(jīng)濟(jì)，在細(xì)菌混合感染檢測(cè)上具有較大優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)病原菌的關(guān)鍵是選擇特異的保守基因作為靶基因，設(shè)計(jì)合適的引物，經(jīng)綜合分析，本研究選取肺炎克雷伯菌III型菌毛結(jié)構(gòu)基因(mrkA)、奇異變形桿菌尿素酶合成的正向調(diào)節(jié)因子R基因(ureR)、沙門氏菌侵襲性抗原保守基因(invA)、大腸桿菌堿性磷酸酶基因(PhoA)基因作為檢測(cè)的靶基因。K.pneumoniae mrkA基因是其特有的編碼III型菌毛的基因'Sedmmllei invA基因是編碼侵染上皮細(xì)胞表面蛋白的基因，與該菌致病性密切相關(guān)，是沙門氏菌屬特有的coli phoA基因是其持家基因，存在于所有E.coli中；而/5.aerygiflosa toxR基因是其特有的毒素基因。因此，選取以上基因作為檢測(cè)靶基因能夠保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。多重PCR影響因素較多而且復(fù)雜，本研究選取對(duì)擴(kuò)增效率影響較大的退火溫度、Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq聚合酶濃度和引物濃度5個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得較好的敏感性結(jié)果，可同時(shí)擴(kuò)增4條目的片段，最低檢出限可達(dá)14 cfu/mLo該方法臨床驗(yàn)證結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)快速檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌具有重要價(jià)值，對(duì)預(yù)防由這4種病原菌引起的羊發(fā)病具有重要意義。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)羊細(xì)菌病多重感染時(shí)，檢測(cè)周期長(zhǎng)和敏感性低的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)羊四種病原菌的多重PCR檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。可以同時(shí)檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌，主要通過(guò)研究上述四種病原菌的特性，分別設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣緩沖液后，再置于含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果即可判定上述四種病原菌是否存在，整個(gè)檢測(cè)方法敏感性高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、迅速。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)羊四種病原菌的多重PCR檢測(cè)用引物，所述引物為:
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:2所示，
奇異變形桿菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:3所示，
奇異變形桿菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:4所示，
大腸桿菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:5所示，
大腸桿菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:6所示，
沙門氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:7所示，
沙門氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:8所示。
[0009]為了更好的實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明還提供一種多重PCR檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法是用于非診療目的，包括采用如下引物:
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:2所示，
奇異變形桿菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:3所示，
奇異變形桿菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:4所示，
大腸桿菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:5所示，
大腸桿菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:6所示，
沙門氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:7所示，
沙門氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:8所示；
分別以肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的全基因組DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并將獲得的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物加入上樣緩沖液后，再置于含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳檢測(cè)，驗(yàn)證弓I物的特異性。
[0010]所述引物為利用以肺炎克雷伯氏菌III型菌毛結(jié)構(gòu)基因、奇異變形桿菌尿素酶合成的正向調(diào)節(jié)因子R基因、沙門氏菌侵襲性抗原保守基因、大腸桿菌堿性磷酸酶基因設(shè)計(jì)的4對(duì)特異性引物。
[0011]所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為每50yL反應(yīng)體系中:5.0 μ L含Mg2+的10XPCR buffer [750mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.8)，200mmol/L (ΝΗ4) 2S04，0.1 % Tween 20，25mmol/L MgCl2]、2.5 mmol/L 的 dNTP 5.0 μ L、5U/μ L 的 Taq 聚合酶 0.5 μ L、肺炎克雷伯氏菌的DNA模板I μ L、奇異變形桿菌的DNA模板I μ L、大腸桿菌的DNA模板I μ L、沙門氏菌的DNA模板I μ L、引物分別為濃度均為25 pmol/yL的肺炎克雷伯氏菌上游引物和肺炎克雷伯氏菌下游引物各1.2 μ L、濃度均為25 pmol/yL的沙門氏菌上游引物和沙門氏菌下游引物各0.9 μ L、濃度均為25 pmol/ μ L的大腸桿菌上游引物和大腸桿菌下游引物各0.8yL、濃度均為25 pmol/yL的奇異變形桿菌上游引物和奇異變形桿菌下游引物各
1.1 μ Lo
[0012]所述肺炎克雷伯氏菌為肺炎克雷伯菌ATCC 700603，沙門氏菌為ATCC14028傷寒沙門氏菌，大腸桿菌為ATCC8739大腸埃希氏菌，奇異變形桿菌為ATCC12453奇異變形桿菌。
[0013]所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:上樣緩沖液濃度為IX，dNTPs濃度為0.25mmol/L，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，退火溫度55 °C，延伸時(shí)間45s，循環(huán)次數(shù)30次。
[0014]所述上樣緩沖液為:含0.25界1:%的溴酸藍(lán)，0.25界1:%的二甲苯青、40wt%的鹿糖，余量為水。
[0015]所述上樣緩沖液與PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物體積比為1: 5。
[0016]所述含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中