一種同時(shí)檢測(cè)人a型、b型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR方法及試劑盒。本發(fā)明針對(duì)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒代表株的N基因、L基因及L基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了含內(nèi)質(zhì)控的一步法多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便快捷，克服了常規(guī)單重?zé)晒釸T-PCR單孔單檢的繁瑣，簡(jiǎn)化了操作程序，節(jié)省了試驗(yàn)成本，利用其較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性為病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、衛(wèi)生評(píng)價(jià)、臨床診斷等方面提供了有力的技術(shù)支撐。
【專利說(shuō)明】—種同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是用于人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的同時(shí)檢測(cè)與鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002]人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratory syncytial virus, hRSV)是引起嬰幼兒、老年體弱者、免疫力低下者冬春季下呼吸道感染最常見(jiàn)、最重要的病原體之一。RSV屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，基因組為單股負(fù)鏈RNA，由15222個(gè)核苷酸組成，編碼11種蛋白質(zhì)，其中3個(gè)為跨膜包膜糖蛋白F蛋白(fusion proteion)、G蛋白(attachment protein)和SH蛋白(small hydrophobic protein),根據(jù)G蛋白抗原性的不同，將RSV分為A、B兩型,在我國(guó)流行的以A型RSV為主。
[0003]人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)為單負(fù)鏈RNA病毒,屬于副粘病毒科肺病毒亞科，是2001年由荷蘭學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)的一種新的呼吸道病原體，目前全球性分布，hMPV感染的病人表現(xiàn)從上呼吸道感染癥狀到急性支氣管炎和肺炎，癥狀和體征主要包括咳嗽、咽痛、流涕和發(fā)熱等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)氣喘、呼吸困難等。hMPV顆粒呈多形性，基因組長(zhǎng)約13kb, hMPV基因3’~5’的序列為N-P-MF-M2-SH-G-L，其中N基因編碼核衣殼RNA結(jié)合蛋白，相對(duì)比較保守，成為分子生物學(xué)檢測(cè)的靶區(qū)。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道病毒的經(jīng)典方法是病毒的分離培養(yǎng)(WHO推薦)，但是其操作煩瑣，耗費(fèi)時(shí) 間長(zhǎng)；電鏡、免疫組化、ELISA、常規(guī)PCR等具有各自突出的優(yōu)點(diǎn)，但都很難檢測(cè)微量核酸和準(zhǔn)確定量，20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timefluorescent quantitative PCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入突光基團(tuán),利用突光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定性和定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)驗(yàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。因而，在呼吸道病原體檢測(cè)中具有巨大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。相對(duì)普通PCR及單熒光PCR，多重?zé)晒釶CR具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)檢測(cè)效率高，即多重?zé)晒釶CR可以實(shí)現(xiàn)一管多檢，通過(guò)收集的不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分不同的檢測(cè)對(duì)象，從而簡(jiǎn)化操作流程；(2)節(jié)省試劑成本和人員操作時(shí)間，尤其在開(kāi)展大量樣品檢測(cè)時(shí)，可以顯著地降低檢測(cè)成本和操作時(shí)間。(3)本方法中含內(nèi)質(zhì)控基因的監(jiān)控，在各類標(biāo)本中，存在各種影響或抑制PCR反應(yīng)的因素，且在標(biāo)本的采集處理、核酸提取、擴(kuò)增和分析過(guò)程中，也可能因人為操作失誤而導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性檢測(cè)結(jié)果。因此本申請(qǐng)采用內(nèi)質(zhì)控的方法，在標(biāo)本中含有的內(nèi)質(zhì)控基因(LDHA)經(jīng)歷檢測(cè)標(biāo)本核酸提取、加樣、PCR擴(kuò)增及信號(hào)檢測(cè)的全過(guò)程，從而可對(duì)每一份標(biāo)本實(shí)施監(jiān)控。
[0005]本發(fā)明成功建立的可同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR方法，采用LDHA作為內(nèi)質(zhì)控，可以有效監(jiān)控樣本中的PCR抑制因素以及由操作誤差所造成的假陰性結(jié)果。并且該方法除了具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)效率高及穩(wěn)定性的特點(diǎn)之外，其檢測(cè)所需要RNA量較少，且操作簡(jiǎn)便快速，在病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、衛(wèi)生評(píng)價(jià)、臨床診斷等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。并有利于進(jìn)一步深入研究相關(guān)病原體感染的分子機(jī)理和免疫調(diào)節(jié)機(jī)理、開(kāi)展有效的臨床治療等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是由國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)2012ZX10004206-002支持的。我們成功設(shè)計(jì)和合成了針對(duì)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒相應(yīng)N基因、L基因及L基因特異性引物和探針?；诖艘锖吞结?，我們建立了一步法含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。該方法通過(guò)對(duì)多種呼吸道病毒的檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建、與商品化單重?zé)晒釸T-PCR診斷試劑盒比較、重復(fù)性試驗(yàn)等，說(shuō)明該方法具有較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種針對(duì)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒N基因、L基因及L基因的特異性引物和探針序列，如SEQ N0:1至12所示。
[0008]在本發(fā)明的第二方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的試劑盒，該試劑盒中含有第一方面所述引物和探針。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括以下成份:
[0010]a)反應(yīng)緩沖液,所述緩沖液為常規(guī)PCR反應(yīng)緩沖液；
[0011]b)反應(yīng)酶，所述反應(yīng)酶為常規(guī)PCR反應(yīng)酶；
[0012]c) SEQ NO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物；
[0013]d)SEQN0:3、6、9、12 所示的探針
[0014]e)無(wú)RNA酶的水。
[0015]其特征在于如SEQ NO:3所示的人A型呼吸道合胞病毒的N基因探針5’端由FAM標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；如SEQ NO:6所示的人B型呼吸道合胞病毒的L基因探針5’端由JOE標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；如SEQ NO:9所示的人偏肺病毒的L基因探針5’端由ROX標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記;如SEQ NO:12所示的內(nèi)質(zhì)控基因LDHA基因探針5，端由CY5標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記。
[0016]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法為多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑盒的具體應(yīng)用，并使用所述引物和探針作為檢測(cè)序列。
[0017]在本發(fā)明的第三方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的PCR擴(kuò)增方法，該方法使用第二方面所述的試劑盒。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0019]a)四個(gè)熒光通道的設(shè)置；
[0020]b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時(shí)間；
[0021]c)預(yù)熱的溫度與時(shí)間；
[0022]d)熱循環(huán)(預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù))；
[0023]e)以界定的Ct值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
[0024]在本發(fā)明的第四方面，提供第一方面所述引物和探針在制備人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1.人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒一步法含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的特異性鑒定，其中:
[0026]圖1A為同時(shí)加入人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒陽(yáng)性模板的熒光擴(kuò)增圖。圖1B為加入其他7種呼吸道多病原的陽(yáng)性模板的熒光擴(kuò)增圖(以乙型流感病毒為例)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明所述人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，是基于相應(yīng)型別N基因、L基因及L基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針。
[0028]本發(fā)明的技術(shù)途徑是首先利用Applied Biosystems(ABI)公司開(kāi)發(fā)的PrimerExpress 3.0軟件、針對(duì)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒相應(yīng)N基因、L基因及L基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針序列，確定了最佳配制體系及上機(jī)擴(kuò)增程序，并且進(jìn)行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，成功建立了人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測(cè)方法。
[0029]下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Sambrook, et al.New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)及實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(李金明，2007)中所述方法或試劑制造商提供的方法。 [0030]同時(shí)，需要指出的是，本發(fā)明所述的檢測(cè)方法和試劑盒不僅應(yīng)用于對(duì)患者(人、動(dòng)物)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，也包括對(duì)環(huán)境中的水樣品、食物樣品、空氣樣品、微生物樣品、動(dòng)物細(xì)胞樣品等多種樣品的非診斷目的的檢測(cè)。其應(yīng)用也都是本領(lǐng)域技術(shù)的常用技術(shù)手段，并不需要進(jìn)行特別的、富有創(chuàng)造性的改變。
[0031]實(shí)施例1.人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒各亞型N基因、L基因及L基因特異性引物和探針設(shè)計(jì)與合成
[0032]1.1人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒代表株的相應(yīng)靶基因N基因、L基因及L基因的選擇及保守區(qū)的確定
[0033]本研究所用的序列選自NCBI GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中，主要選擇依據(jù)為:(a)年代較近毒株；(b)具有全長(zhǎng)序列及主體序列毒株；(c)同亞型序列比對(duì)后選取具有代表性的毒株。選取的人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒代表株的相應(yīng)N基因、L基因及L基因的信息見(jiàn)表1-1、1-2及1-3。
[0034]本研究分別將所選擇的人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒代表株的相應(yīng)N基因、L基因及L基因輸入到DNAssist軟件中進(jìn)行同源比對(duì)，確定了相應(yīng)N基因、L基因及L基因的序列保守區(qū)，為引物和探針設(shè)計(jì)提供了靶區(qū)。
[0035]表1-1.選取人A型呼吸道合胞病毒(hRSVA)代表毒株的N基因信息
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的方法，其特征在于是含內(nèi)質(zhì)控的一步法多重?zé)晒釸T-PCR，其特異性引物和探針序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于如SEQNO:3所示的人A型呼吸道合胞病毒的N基因探針5’端由FAM標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；如SEQ NO:6所示的人B型呼吸道合胞病毒的L基因探針5’端由JOE標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；如SEQ NO:9所示的人偏肺病毒的L基因探針5’端由ROX標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記；如SEQ NO:12所示的內(nèi)質(zhì)控基因LDHA基因探針5’端由CY5標(biāo)記,3’端由BHQ2標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多重?zé)晒釸T-PCR的反應(yīng)體系: a)反應(yīng)緩沖液； b)反應(yīng)酶； c)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； d)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針 e)無(wú)RNA酶的水補(bǔ)足體系要求的體積。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多重?zé)晒釸T-PCR的反應(yīng)條件如下: a)四個(gè)熒光通道的設(shè)置； b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時(shí)間； c)預(yù)熱的溫度與時(shí)間； d)熱循環(huán)(預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù))； e)以界定的Ct值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
5.如權(quán)利要求1所述方法在檢測(cè)食品及原料、環(huán)境樣本中人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的引物和探針序列在制備人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7.一種同時(shí)檢測(cè)人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有特異性引物和探針，其序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104017901SQ201410083275
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】鄧瑛, 崔淑娟, 石偉先, 王海濱, 張玉松, 李愛(ài)華, 于霞麗 申請(qǐng)人:鄧瑛