一種用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體基因芯片以及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因芯片領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體基因 芯片以及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蚊媒病在預(yù)防醫(yī)學(xué)中占有重要地位，因由蚊類(lèi)傳播而傳播力強(qiáng)、發(fā)病率高、危害范 圍大，對(duì)人類(lèi)的健康以及生命安全具有較大的威脅。在我國(guó)流行或曾經(jīng)流行的蚊媒病有瘧 疾、淋巴絲蟲(chóng)病、乙型腦炎、登革熱等。檢測(cè)蚊媒攜帶病原體是極早期發(fā)現(xiàn)流行、預(yù)防蚊媒病 的有效措施之一。
[0003] 簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是發(fā)現(xiàn)蚊傳病原體的重要技術(shù)保障，掌握其流行規(guī)律和趨勢(shì) 為評(píng)價(jià)防治效果和制訂防治對(duì)策提供科學(xué)依據(jù)，還可用于蚊傳疾病的臨床檢測(cè)。早期診斷 蚊媒病的方法多采用顯微鏡鏡檢，該方法簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉，結(jié)果也相對(duì)準(zhǔn)確。但由于蚊蟲(chóng)攜 帶病原體的感染率通常為千分之幾，顯微鏡檢耗費(fèi)時(shí)間，不適宜大量的樣品檢測(cè)；同時(shí)需要 有經(jīng)驗(yàn)和專(zhuān)業(yè)背景的技術(shù)人員操作，不適用于檢測(cè)蚊傳病原體密度極低的樣品。顯微鏡檢 對(duì)于蚊媒病毒的檢測(cè)也不適用。而后發(fā)展了免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫吸附層 析等，相對(duì)于顯微鏡鏡檢的方法，免疫學(xué)方法的敏感度以及通量均有所提高，大大提高了檢 測(cè)效率；隨后發(fā)展了更敏感的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)方法，PCR的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但是通 過(guò)凝膠電泳對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)有可能因?yàn)榉翘禺悢U(kuò)增導(dǎo)致假陽(yáng)性判斷，或者有可能引物 擴(kuò)增條帶信號(hào)很微弱在凝膠電泳上不可見(jiàn)，造成假陰性判斷，而對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序則比 較繁瑣并且費(fèi)時(shí)。
[0004] 蚊蟲(chóng)往往同時(shí)攜帶多種病原體，上述方法只能進(jìn)行單一病原體的檢測(cè)，且通量不 高。雖然有多重PCR技術(shù)，但隨著引物對(duì)的增加，影響反應(yīng)結(jié)果。因此，采用上述方法無(wú)法 同時(shí)進(jìn)行大批量復(fù)合致病原的檢測(cè)。
[0005] 生物芯片技術(shù)是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展并成熟的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要 是通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固相芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì) 細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他多種生物成分的準(zhǔn)確、快速、大量信息的檢測(cè)。生物芯片的主 要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動(dòng)化，主要包括三類(lèi)：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片以及芯片實(shí)驗(yàn)室。 現(xiàn)有技術(shù)中，已有采用基因芯片進(jìn)行某一屬的多種病毒的檢測(cè)，如專(zhuān)利號(hào)為CN 101781687A 的專(zhuān)利中，公開(kāi)了一種檢測(cè)黃病毒屬多種病毒的基因芯片，但對(duì)于可同時(shí)檢測(cè)分類(lèi)地位相 差較遠(yuǎn)的多個(gè)屬（病毒、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)等）病原體的基因芯片，尚未有人進(jìn)行過(guò)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是為解決上述問(wèn)題而進(jìn)行的，通過(guò)提供一種可同時(shí)檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種 病原體的基因芯片，提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。
[0007] 本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的可感染人體的多種病原體的基因芯片， 具有這樣的特征，包括：基片；以及固定于基片上的探針，其中，探針包括黃病毒屬探針、絲 蟲(chóng)屬（淋巴絲蟲(chóng)）探針以及瘧原蟲(chóng)屬探針，黃病毒屬探針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1~7所示，絲蟲(chóng)屬探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No. 8~10所示，瘧原蟲(chóng)屬 探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No. 11~17所示。
[0009] 本發(fā)明提供的用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的基因芯片，還可以具有這樣的 特征：黃病毒屬包括登革熱病毒1~4型、日本腦炎病毒以及西尼羅病毒；絲蟲(chóng)屬包括兩種 淋巴絲蟲(chóng)：馬來(lái)絲蟲(chóng)以及班氏絲蟲(chóng)；瘧原蟲(chóng)屬包括惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、 諾氏瘧原蟲(chóng)以及卵形瘧原蟲(chóng)。
[0010] 本發(fā)明提供的用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的基因芯片，還可以具有這樣的 特征：基片采用醛基進(jìn)行修飾，和基片連接的探針的5 '端采用氨基進(jìn)行修飾。
[0011] 本發(fā)明提供的用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的基因芯片，還可以具有這樣的 特征：在探針5 '端修飾的氨基基團(tuán)與探針的雜交部位之間設(shè)置間隔臂，用于減少病原體 核苷酸序列和探針之間的雜交空間位阻，間隔臂的結(jié)構(gòu)為16聚脫氧胸苷酸。
[0012] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的基因芯片檢 測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0013] 步驟一，將感染病原體的樣品進(jìn)行核酸提取處理，得到待測(cè)樣品，并對(duì)待測(cè)樣品進(jìn) 行PCR反應(yīng)處理，得到待測(cè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0014] 步驟二，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記；
[0015] 步驟三，將步驟二中的擴(kuò)增產(chǎn)物在預(yù)定溫度下和基因芯片進(jìn)行雜交，得到雜交產(chǎn) 物；
[0016] 步驟四，將步驟三中的雜交產(chǎn)物進(jìn)行掃描處理，得到檢測(cè)結(jié)果。
[0017] 本發(fā)明提供的基因芯片檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的方法，其特征在于：待測(cè) 樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)處理時(shí)，黃病毒屬病毒的上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物 序列如SEQ ID NO. 19所示；絲蟲(chóng)屬的上游引物序列如SEQ ID NO. 20所示，下游引物序列如 SEQ ID NO. 21所示；皰原蟲(chóng)屬的上游引物序列如SEQ ID NO. 22所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 23 所示。
[0018] 本發(fā)明提供的基因芯片檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的方法，其特征在于：PCR 反應(yīng)的條件為：50°C預(yù)變性5min，94°C變性5min ;94°C變性25s ;54°C退火25s ;72°C延伸 30s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
[0019] 本發(fā)明提供的基因芯片檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的方法，其特征在于：擴(kuò)增 產(chǎn)物采用Biotin進(jìn)行標(biāo)記。
[0020] 本發(fā)明提供的基因芯片檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的方法，其特征在于：雜交 的溫度為41 °C。
[0021] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的多種病原體的基因芯片制 備的試劑盒，其特征在于：試劑盒包括基因芯片、PCR反應(yīng)試劑以及顯色反應(yīng)試劑。
[0022] 發(fā)明作用與效果
[0023] 本發(fā)明提供了一種可同時(shí)檢測(cè)蚊蟲(chóng)所攜帶的可感染人體的多種病原體的基因芯 片及其檢測(cè)方法，包括基片以及固定于基片上的黃病毒屬探針、絲蟲(chóng)屬探針以及瘧原蟲(chóng)屬 探針，使得該基因芯片可同時(shí)檢測(cè)蚊蟲(chóng)攜帶的多種分類(lèi)地位相差較遠(yuǎn)的病原體，同時(shí)本發(fā) 明中的檢測(cè)方法操作步驟簡(jiǎn)單、特