切產(chǎn)物。
[0118] 上述酶切產(chǎn)物經(jīng)1倍濃縮后，在2. 5%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳35min，于紫 外燈下拍照鑒定。
[0119]結(jié)果：
[0120] 擴(kuò)增后序列（其位于SEQIDNO: 1堿基序列中257-450處，共194bp)，所獲得的擴(kuò) 增產(chǎn)物序列如下（SEQIDN0:14):
[0121]
[0122] 產(chǎn)物序列中下劃線部分為上游、下游引物所對應(yīng)的序列，Y代表C/T多態(tài)即SNP位 點(diǎn)rs2853669。
[0123] 酶切后的產(chǎn)物序列分別如下：
[0124] 該多態(tài)位點(diǎn)含有C等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段154bp序列（SEQ IDNO:15):
[0125]
[0126] 該多態(tài)位點(diǎn)含有C等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段40bp序列（SEQID NO：16)：
[0127]gggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccg40
[0128] 酶切產(chǎn)物電泳后于紫外燈下拍照鑒定，結(jié)果示于圖1中。其中，rs2853669位點(diǎn)擴(kuò) 增后出現(xiàn)194bp片斷。經(jīng)PshAI酶切后出現(xiàn)194bp、154bp、40bp三種片斷（其中40bp在電 泳圖中不易分辨）。
[0129] 酶切后基因型判斷：CC型為154bp-個片段，CT型有194bp和154bp兩種片段， IT型為194bp-個片段。
[0130] 多態(tài)結(jié)果：共檢測11例人員，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2853669位點(diǎn)出現(xiàn)CC型4例、CT型 3例和IT型4例。
[0131] 實(shí)施例4人肺組織標(biāo)本測定TERT基因rs2853669多態(tài)性
[0132] 采用酚-氯仿抽提法進(jìn)行肺組織炔基因組DNA抽提。
[0133] PCR反應(yīng)所采用的上游引物是SEQNO:1，下游引物是SEQNO: 14。
[0134]上游引物：5'CGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGQT3'（SEQID NO:17)；
[0135]下游引物：5'GGAAAGGAAGGGGAGGGGCTGGGA3'（SEQIDN0:18)
[0136] PCR擴(kuò)增除退火溫度是68°C外，其余反應(yīng)條件同實(shí)施例I;
[0137] 酶切鑒定同實(shí)施例3.
[0138]結(jié)果：
[0139]擴(kuò)增后序列（其位于SEQIDNO: 1堿基序列中256-455處，共200bp)，所獲得的擴(kuò) 增產(chǎn)物序列如下（SEQIDN0:19):
[0140]
[0141] 擴(kuò)增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為上游、下游引物所對應(yīng)的序列，Y代表C/T多態(tài)即 SNP位點(diǎn)rs2853669。
[0142] 酶切后的產(chǎn)物序列分別如下：
[0143] 該多態(tài)位點(diǎn)含有C等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段159bp序列（SEQ IDNO:20):
[0144]
[0145] 該多態(tài)位點(diǎn)含有C等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段41bp序列（SEQID NO：21)：
[0146]cgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccg 41
[0147] 酶切產(chǎn)物電泳后于紫外燈下拍照鑒定，結(jié)果示于圖1中。其中，rs2853669位點(diǎn)擴(kuò) 增后出現(xiàn)200bp片斷。經(jīng)PshAI酶切后出現(xiàn)200bp、159bp、4Ibp(其中4Ibp在電泳圖中不 易分辨）。
[0148] 酶切后基因型判斷：CC型為159bp-個片段，CT型有200bp和159bp兩種片段， IT型為200bp-個片段。
[0149] 多態(tài)結(jié)果：共檢測12例人員，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2853669位點(diǎn)出現(xiàn)CC型2例、CT型 6例和IT型4例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定人TERT基因rs2853669位點(diǎn)多態(tài)性的方法，包括： 提供待測人基因組DNA ; 提供擴(kuò)增人TERT基因rs2853669位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物 具有錯配喊基G ; 以所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以獲得 含GGTYC片段或GACCGCGGTY片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中Y為人TERT基因rs2853669位點(diǎn)上的 待定堿基C或T ; 提供限制性內(nèi)切酶； 利用限制性內(nèi)切酶對所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物； 以及根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人TERT基因rs2853669位點(diǎn)上的待定堿基Y是C還是 T， 其中，限制性內(nèi)切酶為能夠切開GGTTC片段與GGTCC片段之一的限制性內(nèi)切酶，或能 夠切開GACCGCGGTT片段與GACCGCGGTC片段之一的限制性內(nèi)切酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯配堿基G與Y之 間相隔一個堿基T。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與Y相鄰。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中限制性內(nèi)切酶為能切開GGTCC片段的Avail、 Sau96I或其同裂酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中限制性內(nèi)切酶為能切開GACCGCGGTC片段的PshAI 或其同裂酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類型：具有總片段長 度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴(kuò)增產(chǎn) 物，通過判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人TERT基因rs2853669位點(diǎn)上的待定堿基 Y是C還是T。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝膠電泳 聯(lián)合紫外燈拍照后與參照圖對比來進(jìn)行的。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中參照圖是擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時間后經(jīng) 紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖像位置，其中第一參照圖像位 置針對的是未切斷的總片段長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照圖像位置則針對的是切斷后具有 較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長度而使得擴(kuò)增 產(chǎn)物的總片段長度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，使得酶切切 掉部分片段占總片段的長度的百分比超過20%。10. -種用于測定人TERT基因rs2853669位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，其包含： 用于PCR擴(kuò)增人TERT基因rs2853669位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游 引物具有錯配堿基G以獲得含GGTYC片段或GACCGCGGTY片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中Y為人TERT 基因rs2853669位點(diǎn)上的待定堿基C或T ;以及 能夠切開GGTTC片段與GGTCC片段之一的限制性內(nèi)切酶，或能夠切開GACCGCGGTT片 段與GACCGCGGTC片段之一的限制性內(nèi)切酶。
【專利摘要】人TERT基因rs2853669位點(diǎn)多態(tài)性檢測方法及試劑盒。該方法，包括：提供待測人基因組DNA；提供擴(kuò)增人TERT基因rs2853669位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有錯配堿基G；以所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以獲得含GGTYC片段或GACCGCGGTY片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中Y為人TERT基因rs2853669位點(diǎn)上的待定堿基C或T；提供限制性內(nèi)切酶；利用限制性內(nèi)切酶對所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以及根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人TERT基因rs2853669位點(diǎn)上的待定堿基Y是C還是T。限制性內(nèi)切酶為能夠切開GGTTC片段與GGTCC片段之一的限制性內(nèi)切酶,或能夠切開GACCGCGGTT片段與GACCGCGGTC片段之一的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明的測定手段不但快速可靠，而且測定成本大大降低。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105087817
【申請?zhí)枴緾N201510615764
【發(fā)明人】施學(xué)忠, 楊永利
【申請人】鄭州大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月24日