Adrb1，grk5基因多態(tài)性的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體是提供不同檢測方法(包含 但不限于改良測序方法和Taqman探針基因分型的方法）同時對β受體信號通路相關(guān)基因 ADRB1，G服5上的2個SNP位點（401^1:'31801253^及6服5:'317098707)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的基 因分型，便于臨床對β受體阻滯劑的療效進(jìn)行評估。
【背景技術(shù)】：
[0002] 屯、力衰竭（簡稱屯、衰）是一種W屯、臟累血不足而導(dǎo)致全身多器官灌注不足W及循 環(huán)渺血為表現(xiàn)的復(fù)雜臨床綜合征，合并有神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常改變，是包括高血壓、冠屯、 病、屯、肌病在內(nèi)的多種屯、血管疾病的終末階段。β腎上腺素能受體(簡稱β受體)阻滯劑因能 通過阻斷過度活化的腎上腺能系統(tǒng)，有效降低屯、臟氧耗，改善屯、肌重構(gòu)和患者長期預(yù)后，作 為標(biāo)準(zhǔn)方案用于包括屯、衰在內(nèi)的多種屯、血管疾病的治療。但更多的臨床試驗和多中屯、的 me化分析報導(dǎo)β受體阻滯劑的總體獲益來自部分人群，即表現(xiàn)出個體差異性和種族差異性。
[0003] 目前，已有眾多文獻(xiàn)報道β腎上腺素能受體通路的基因多態(tài)性會影響β受體阻滯劑 的療效，進(jìn)而潛在的影響屯、衰患者的預(yù)后。Ste地en Β丄iggett等人2006年發(fā)表的一項1040 人的歐洲屯、衰人群的研究表明m受體基因 ADRBl-Arg389Gly位多態(tài)性導(dǎo)致氨基酸改變影響 了布新洛爾的治療效果。與安慰劑組相比，ADRBl-Arg-389純合基因型的患者接受β受體阻 滯劑布新洛爾治療的患者死亡率下降38%(ρ = 0.03)，再住院率下降34% (ρ = 0.004)，而基 因型為ADRBl-Gly-389基因型的患者治療組和安慰劑組之間預(yù)后無統(tǒng)計學(xué)差異。另一項224 例屯、衰患者研究通過檢測治療后屯、功能的改善證實了 ADRB1-389位點對β受體阻滯劑治療 效果的影響，具體為:與ADRB1-G1 y-389基因型的患者相比，ADRB1 -Arg389-純合基因型的患 者治療后左室射血分?jǐn)?shù)明顯改善(8.7 ± 1.1 % VS. 0.93 ± 1.7%，p<0.02) X服5是β受體下游 的G蛋白偶聯(lián)受體激酶，在其41位氨基酸的多態(tài)性G服5Gln41Leu位點在非洲人群的次要等 位基因頻率約是歐洲人群的10倍。兩項研究同時證明在不服用β受體阻滯劑的情況下GRK5- Leu41的患者的遠(yuǎn)期生存率更高化og rank ρ = 0.013)。而G服5-Gln41基因型的患者對β受 體阻滯劑的治療反應(yīng)更好，具體表現(xiàn)為G服5-Gln41純合基因型的患者治療后非屯、臟移植的 生存時間更長化3 = 0.22;95%(：1，0.12-0.40;口<0.001)，而〇服5-161141基因型的患者是否 接受0受體阻滯劑治療，預(yù)后無統(tǒng)計學(xué)差異(HR = 0.78; 95 % CI，0.35-1.17; P = 0.53)。
[0004] 從現(xiàn)有的研究中我們總結(jié)出β腎上腺素系統(tǒng)的基因多態(tài)性在屯、衰的發(fā)生中不起主 要作用，但能修飾β受體阻滯劑相關(guān)的臨床表型，包括β受體阻滯劑對短期屯、功能的改善和 長期生存率的影響，對臨床指導(dǎo)個體化醫(yī)療和治療效果評估有重要指導(dǎo)意義。但至目前為 止，根據(jù)文獻(xiàn)報道，針對β受體腎上腺素能系統(tǒng)基因多態(tài)性的檢測方法為直接測序的方法包 括傳統(tǒng)Sanger測序法和Pyrosequencing測序的方法。其優(yōu)點為測序結(jié)果準(zhǔn)確，但操作流程 較復(fù)雜，耗時較長，成本較高，限制了其在實際臨床工作中的發(fā)展和應(yīng)用，無法滿足快速指 導(dǎo)臨床評估的需求，一種新的快速、準(zhǔn)備、低成本的檢測方法成為迫切需求。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 為彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供針對W上ADRBl-Ar的89Gly(rsl801253) 和/或G服5-Gln42Leu(rsl7098707)2個多態(tài)性位點快速準(zhǔn)確的檢測方法，包括但不限于改 良測序和化qman探針基因分型的方法，為臨床評估屯、衰患者預(yù)后和/或β受體阻滯劑的預(yù)期 療效提供指導(dǎo)方案。
[0006] 為此，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供一種屯、衰患者預(yù)后和/或β受體阻滯劑藥物治療療效評估的遺傳標(biāo)志 物，其中，所述遺傳標(biāo)志物是40381-4'旨389617('3 1801253)和/或6陸5-61114化611 (rsl7098707)多態(tài)性位點的基因分型。優(yōu)選的，所述遺傳標(biāo)志物是（l)ADRBl-Arg389Gly (rsl801253)或（2)G 服 5-Gln41Leu(rsl7098707)多態(tài)性位點的基因分型。
[000引本發(fā)明還提供一些用于檢測上述標(biāo)志物的試劑。
[0009] 優(yōu)選的，所述試劑包括1、針對包含上述2個SNP位點相應(yīng)的目標(biāo)序列的特異性擴增 引物對;和/或2、識別多態(tài)性位點的檢測探針。
[0010] 更優(yōu)選的，所述針對W上2個SNP位點相應(yīng)的目標(biāo)序列的特異性擴增引物對的結(jié)構(gòu) 如沈Q ID No. 1-4所示或者如沈Q IN No.5-6或沈Q ID No.9-10。
[00川優(yōu)選的，用于擴增包含^1801253位點的目的片段的引物序列560 10齡.1-2;用 于擴增rsl7098707位點的目的片段的引物SEQ ID齡.3-4。或者用于擴增包含'31801253位 點的目的片段引物序列56010齡.5-6;用于擴增包含^17098707位點的目的片段引物序 列沈Q IN No.9-10。
[0012] 所述識別多態(tài)性位點的檢測探針為14-50個核酸的寡核巧酸序列，能特異性的與 上述多態(tài)性位點特異性雜交。進(jìn)一步，所述識別探針序列由5'端的巧光報告基團，3'端的非 巧光巧滅基團W及與多態(tài)性性位點前后序列雜交的序列組成。更優(yōu)選的，所述巧光報告基 團為Fam、Vi C等，3 '端的非巧光巧滅基團為MGB修飾基團。
[0013] 更優(yōu)選的，所述的針對W上2個SNP位點的檢測探針結(jié)構(gòu)如SEQ ID No.7-8或者SEQ ID No. 11-12所示。
[0014] 優(yōu)選的，用于識別rsl801253位點等位基因 A/G的探針序列SEQIDNo.7-8;用于識 別rsl7098707位點等位基因 C/G的探針序列沈Q ID No.11-12。
[0015] 本發(fā)明還提供一種上述試劑在制備評估屯、衰患者預(yù)后和/或β受體阻滯劑藥物治 療療效的試劑盒中的用途。
[0016] 本發(fā)明還提供一種用于評估屯、衰患者預(yù)后和/或β受體阻滯劑藥物治療療效的試 劑盒，所述試劑盒包含至少一種選自上述任意一項的試劑。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括用于 檢測反應(yīng)的合適的緩沖體系和檢測體系。
[0017] 優(yōu)選的，所述β受體阻滯劑包括但不僅限于美托洛爾、比索洛爾、布新洛爾、卡維地 洛。
[0018] 本發(fā)明還提供檢測患者樣本中上述遺傳標(biāo)志物的方法，其中，所述方法中利用上 述試劑。
[0019] 優(yōu)選的，所述患者樣本選自：外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清、尿樣、唾液、體液和/或(活 檢)組織樣本，優(yōu)選的，所述樣品預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
[0020]優(yōu)選的，所述方法包括（1)改良測序的方法；（2)化qman探針基因分型的方法;和/ 或(3)其他基于特異性擴增和/或識別W上多態(tài)性位點及周圍序列的方法。
[0021 ]更優(yōu)選的，所述（1)改良測序的方法中，包括使用針對包含上述SNP位點相應(yīng)目標(biāo) 序列的特異性擴增引物。
[0022] 進(jìn)一步，所述（1)改良測序的方法中，所述針對包含上述SNP位點相應(yīng)的目標(biāo)序列 的特異性擴增引物對結(jié)構(gòu)，如SEQ ID No. 1-4。
[0023] 更優(yōu)選的，所述(2)Taqman探針分型檢測方法中，包括使用針對包含上述SNP位點 相應(yīng)的目標(biāo)序列的特異性擴增引物和上述識別多態(tài)性位點的檢測探針對遺傳標(biāo)志物進(jìn)行 檢測。
[0024] 進(jìn)一步，所述(2)Taqman探針基因分型檢測方法中，所述針對包含上述SNP位點相 應(yīng)的目標(biāo)序列的特異性擴增引物對的結(jié)構(gòu)如SEQ ID No.5-6或者SEQ IN No.9-10所示。所 述識別多態(tài)性位點的探針結(jié)構(gòu)如SEQ ID No.7-8或者SEQ ID No. 11-12。
[0025] 進(jìn)一步，所述(3)其他基于特異性擴增和/或識別W上多態(tài)性位點及周圍序列的方 法還包括高分辨率溶解曲線的方法、液相DNA忍片分型技術(shù)、固相DNA忍片分型技術(shù)、針對包 含目的片段的PCR產(chǎn)物的質(zhì)譜分析技術(shù)、限制性內(nèi)切酶分型技術(shù)、等位基因特異性雜交技 術(shù)、寡核巧酸連接實驗等。
[00%]本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0027] 1.本發(fā)明提供的針對ADRBlrsl801253和G服虹S17098707位點的改良測序的檢測 方法在傳統(tǒng)測序方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化引物設(shè)計，PCR擴增引物同時可作為測序引物，降低了引 物設(shè)計成本，簡化了操作。
[0028] 2.本發(fā)明提供的改良測序的方法在傳統(tǒng)測序方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化反應(yīng)體系，在保證 正確正確率的前提下大大減少了測序試劑的用量，可降低到標(biāo)準(zhǔn)用量的1/16,大大降低了 檢測成本。
[0029] 3.本發(fā)明提供的改良測序的方法在傳統(tǒng)測序方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化操作流程，1天內(nèi) 從樣本處理到得到檢測結(jié)果，大大簡化了操作步驟，實現(xiàn)了快速檢測，符合臨床試劑運用的 需要。
[0030] 4.本發(fā)明提供的化qman探針分型的方法，在引物和探針序列設(shè)計和實驗方案上做 出優(yōu)化，在保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，采用半量試劑的方法，有效的節(jié)約了檢測成本， 能更好滿足臨床應(yīng)用的需求。作為優(yōu)選3'端的非巧光巧滅基團為MGB修飾基團，保證檢測的 特異性和成功率。
【附圖說明】
[0031] 圖1.利用改良測序的方法對ADRBlrsl801253Ar的89Gly位點進(jìn)行基因分型的圖示
[0032] 圖1-上部表示ADRBlrsl801253位點對側(cè)互補連等位基因為G，患者基因型為CC型， 圖1-中部表示ADRBlrsl801253位點基因型為CG雜合型，圖1-下部表示ADRBlrsl801253位點 對側(cè)互補鏈等位基因為CC，患者基因型為GG型。
[0033] 圖2.利用改良測序的方法對G服5rs 17098707位點進(jìn)行基因分型的圖示
[0034] 圖2-上部表示G服5rsl7098707位點基因型為AA型，圖2-下部表示G服5rsl7098707 位點基因型為AT型。
[0035] 圖3.利用化qman探針的方法對ADRBlrsl801253Ar的89Gly位點進(jìn)行基因分型的圖 示
[0036] 右下散點代表樣品中只檢測到Fam巧光，受試者基因型為GG(右下）。左上散點表示 樣品中只檢測到Vic巧光，受試者基因型為CC(左上）。中間散點代表樣品中既檢測到化m巧 光，又檢測到Vic巧光，受試者基因型為雜合型型CG(中間）。
[0037] 圖4.利用化qman探針的方法對G服5rs 17098707位點進(jìn)行基因分型的圖示
[0038] 右下散點表示樣品中只檢測到Fam巧光，受試者基因型為野生型AA(右下）。中上散 點代表樣品中既檢測到Fam巧光，又檢測到Vic巧光，受試者基因型為野生突變混合基因型 AT(中上）。
【具體實施方式】：
[0039] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案