本發(fā)明是一種具有HIV整合酶抑制作用的聚乙二醇化拉替拉韋、其藥物組合物及其用途，涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

拉替拉韋是一種HIV整合酶抑制劑，能快速抑制HIV復(fù)制，安全性較高，藥物間相互作用少。其適用于與其它抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合使用，用于治療人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染。

HIV-1整合酶是HIV病毒復(fù)制中一個(gè)重要的酶，也是治療艾滋病藥物的一個(gè)重要靶點(diǎn)。HIV病毒入侵宿主細(xì)胞后，首先將兩條RNA鏈(自帶的)逆轉(zhuǎn)錄為兩條互補(bǔ)的DNA鏈(HIV病毒為RNA病毒)，然后該酶才會(huì)發(fā)生作用。該酶與DNA連接酶作用類似，可以使病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA分子之間脫水縮合，從而連接成為一體，為下一步的轉(zhuǎn)錄和翻譯，即復(fù)制病毒自己做好準(zhǔn)備。默沙東的拉替拉韋鉀片(艾生特)是利用抑制整合酶的功能來達(dá)到治療艾滋病的目的。

盡管拉替拉韋在艾滋病治療時(shí)具有較好的療效，但是其存在較大的副作用，具體表現(xiàn)為在臨床上顯示出頭痛、腹瀉、惡心等不良反應(yīng)，從細(xì)胞層面數(shù)據(jù)顯示，副作用主要體現(xiàn)在藥物對細(xì)胞的毒性作用較大。

因此，有必要在不降低藥物抗HIV治療效果的情況下，尋找減輕拉替拉韋的毒副作用的藥物組合物和應(yīng)用方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種具有降低毒副作用的拉替拉韋及其藥物組合物，該組合物通過PEG修飾，實(shí)現(xiàn)拉替拉韋的PEG化，本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，特定聚合度的PEG化的拉替拉韋對細(xì)胞的毒性顯著下降，且抗病毒活性提高。

本發(fā)明的如式I所示的化合物

本發(fā)明還提供一種制備式I化合物的方法，包括將含有拉替拉韋鉀和五甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯的溶液在堿的存在下加熱反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離純化得產(chǎn)品。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包括上述的PEG化的拉替拉韋與藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選方案中，藥物組合物中還包括助劑。

本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選方案中，藥物組合物是液體制劑、固體制劑、半固體制劑、膠囊劑、顆粒劑、凝膠劑、注射劑、緩釋制劑或控釋制劑。

本發(fā)明藥物組合物的用途包括利用聚乙二醇化的拉替拉韋作為HIV聚合酶抑制劑，治療HIV感染引起的疾病。進(jìn)一步地，本發(fā)明藥物組合物的用途還包括利用聚乙二醇化的拉替拉韋與其他HIV治療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，用于治療HIV感染引起的疾病，其中所述其他HIV病毒感染性疾病治療藥物包括拉米夫定、司他夫定、去羥肌苷、奈韋拉平、依非韋侖或茚地那韋或它們的組合。

盡管現(xiàn)有技術(shù)中某些小分子藥物經(jīng)過聚乙二醇化之后顯示出較未聚乙二醇化的藥物更低的毒性，但是并沒有明確的數(shù)據(jù)或證據(jù)能夠顯示聚乙二醇化修飾的藥物一定較未修飾的藥物具有更低的毒性作用，更沒有現(xiàn)有技術(shù)證據(jù)顯示聚乙二醇化的拉替拉韋能夠在不降低拉替拉韋藥效的前提下具有更低的毒性作用。

具體實(shí)施方式

四甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯、五甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯和六甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯購自北京鍵凱科技有限公司，拉替拉韋鉀購自上海江萊生物科技有限公司，其余均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

實(shí)施例一、mPEG₅-拉替拉韋(GQ-80402)的制備

將拉替拉韋鉀(14.1g，29.2mmol)、五甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯(21.4g，52.6mmol)和K₂CO₃(8.1g，58.5mmol)溶于DMF(250mL)中，加熱升溫至100℃保溫反應(yīng)7h。冷卻至室溫，加入蒸餾水(350mL)，攪拌混合均勻。用乙酸乙酯(200mL×4)提取，混合有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾、濃縮，殘留物用硅膠柱分離得油狀固體產(chǎn)品6.9g，收率34.8％，HPLC純度98.0％。ESI-MS：679[M+H]⁺。

所獲得的產(chǎn)物I為mPEG₅-拉替拉韋(GQ-80402)。

對比例1：mPEG₄化拉替拉韋的制備-對照A

將拉替拉韋鉀(14.1g，29.2mmol)、四甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯(52.6mmol)和K₂CO₃(8.1g，58.5mmol)溶于DMF(250mL)中，加熱升溫至100℃保溫反應(yīng)7h。冷卻至室溫，加入蒸餾水(350mL)，攪拌混合均勻。用乙酸乙酯(200mL×4)提取，混合有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾、濃縮，殘留物用硅膠柱分離得油狀固體產(chǎn)品6.4g，，HPLC純度98.0％。ESI-MS：635[M+H]⁺。

對比例2：mPEG₆化拉替拉韋的制備-對照B

將拉替拉韋鉀(14.1g，29.2mmol)、六甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯(52.6mmol)和K₂CO₃(8.1g，58.5mmol)溶于DMF(250mL)中，加熱升溫至100℃保溫反應(yīng)7h。冷卻至室溫，加入蒸餾水(350mL)，攪拌混合均勻。用乙酸乙酯(200mL×4)提取，混合有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾、濃縮，殘留物用硅膠柱分離得油狀固體產(chǎn)品6.5g，，HPLC純度98.0％。ESI-MS：723[M+H]⁺。

實(shí)施例四、化合物GQ-80402在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的抗HIV-1活性

4、材料和方法

4.1試驗(yàn)材料

4.1.1藥物

待試藥物：

化合物GQ-80402，批號：080402，水不溶，DMSO可溶解，試驗(yàn)時(shí)用DMSO溶解配成適當(dāng)濃度后用培養(yǎng)基稀釋，立即加入細(xì)胞培養(yǎng)。

陽性對照藥：

拉替拉韋(RAL)，購自默沙東市售藥品，片劑，規(guī)格400mg，避光、密閉、干燥處保存。

對照A，對照B按對比例1和2的方法制備。

4.1.2病毒

HIV-1實(shí)驗(yàn)病毒株選用HIV-1_IIIB，由南開大學(xué)惠贈(zèng)。按常規(guī)方法培養(yǎng)制備HIV-1病毒。HIV-1感染性滴定按常規(guī)方法進(jìn)行。病毒小量分裝于凍存管，-80℃保存。

4.1.3細(xì)胞

人T淋巴細(xì)胞系MT-4細(xì)胞由南開大學(xué)惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640完全培養(yǎng)基，含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM2-巰基乙醇，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。

細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)蘇，傳代：從液氮中復(fù)蘇細(xì)胞，用RPMI-164培養(yǎng)基洗去凍存液，加入含10％FCS的完全培養(yǎng)基10ml，混勻，37℃ 5％CO2培養(yǎng)。每隔3天對細(xì)胞傳一次代。實(shí)驗(yàn)前1天傳一次代，使所用細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

4.1.4主要試劑

RPMI-1640、胎牛血清、硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate)、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、HEPES(N-2，2-Hydroxyothyl piperazine-N′-2-ethanesufonic acid)、MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl，噻唑藍(lán))-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)、DMF(N，N’-Dimethyl formamine，N，N-二甲基甲酰胺)、Triton X-100、青霉素(Penicillin)、谷氨酰胺(Glutamine)、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、二甲基亞砜(DMSO)。

4.1.5主要儀器

酶標(biāo)儀(Biotek ELX800)、離心機(jī)(Thermo IEC CL40)、二級生物安全柜(Thermo Forma Class II，A2)、CO₂培養(yǎng)箱(Thermo)、加樣槍(Thermo Finnpipeette F2)。

4.2試驗(yàn)方法

4.2.1 GQ-80402對MT-4細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

4×10⁵/ml MT-4細(xì)胞懸液100μl與不同的待測藥物溶液混合，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不含藥物的對照孔，37℃，5％CO₂培養(yǎng)3天，采用MTT比色法檢測細(xì)胞毒性。ELx800 ELISA儀測定OD值，測定波長為570nm，參考波長為630nm。計(jì)算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic concentration)，即對50％的正常T淋巴細(xì)胞系MT-4產(chǎn)生毒性時(shí)的藥物濃度。

4.2.2 GQ-80402對HIV-1_IIIB感染MT-4細(xì)胞致細(xì)胞死亡的保護(hù)試驗(yàn)

在96孔板上，將待測藥物按照5倍梯度稀釋，每孔加50μL 8×105/mL的MT-4細(xì)胞與HIV-1_IIIB病毒上清(MOI＝0.03)，同時(shí)設(shè)置僅含MT-4細(xì)胞的陰性對照孔、未加化合物但含有MT-4細(xì)胞與病毒的陽性對照孔、以及陽性藥物對照組。置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3天每孔補(bǔ)充100μL培養(yǎng)基，第6天用MTT方法測OD值。計(jì)算藥物對細(xì)胞生長的抑制率和對HIV-1_IIIB感染細(xì)胞的保護(hù)率。CC₅₀為對50％的宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性的藥物濃度；EC₅₀為保護(hù)50％的HIV-1_IIIB感染細(xì)胞存活時(shí)的藥物濃度。

4.3結(jié)果

4.3.1化合物GQ-80402對MT-4細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果

MT-4細(xì)胞是HIV-1敏感的T細(xì)胞，MT-4感染HIV-1不會(huì)形成合胞體但會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，檢測GQ-80402對未感染的MT-4 細(xì)胞的毒性。結(jié)果如表1所示。

表1 GQ-80402和RAL對MT-4細(xì)胞的毒性作用

從MT-4細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，GQ-80402的細(xì)胞毒性最低，而對照A，B雖然同樣對拉替拉韋鉀進(jìn)行了修飾，但是效果不明顯。

4.3.2化合物GQ-80402對HIV-1_IIIB感染MT-4細(xì)胞致細(xì)胞死亡的保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

MT-4細(xì)胞在感染HIV后，6-7天會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，加入藥物后如果細(xì)胞能存活，則表明化合物有抗HIV作用，并保護(hù)細(xì)胞不受HIV導(dǎo)致的死亡作用。結(jié)果如表2所示。

表2 GQ-80402和RAL對HIV-1_IIIB感染MT-4細(xì)胞的保護(hù)試驗(yàn)

表2續(xù)

由表1和表2可知，GQ-80402對MT-4細(xì)胞的毒性較小，對HIV-1_IIIB感染的MT-4細(xì)胞有很好的保護(hù)細(xì)胞不受HIV導(dǎo)致死亡的作用，同時(shí)還增強(qiáng)了對病毒的抑制作用，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。而其他聚合度PEG化拉替拉韋對MT-4細(xì)胞的保護(hù)作用以及對病毒的抑制作用與陽性藥物相差不大。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。