一種檢測鴨瘟病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測鴨瘟病毒IgG抗體的間接ELISA方法。所述方法的鴨瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1mL和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清1mL；包被病毒為鴨瘟病毒貴州株，并進(jìn)行純化所得，使用包被緩沖液稀釋為2.0μg/100μL；包被緩沖液：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g溶于去離子水中，定容至1000mL，調(diào)至pH9.6；酶標(biāo)二抗：羊抗鴨IgG-HRP，按1:50倍稀釋待用；1×PBST緩沖液：NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、Tween-200.5mL溶于800mL蒸餾水，調(diào)整pH為7.4，定容至1000mL；封閉緩沖液：BSA1.0g溶于100mlPBST緩沖液；底物液A：Na2HPO414.60g、檸檬酸9.33g、過氧化氫脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL，調(diào)至pH5.2；底物液B：TMB20mg、無水乙醇10mL，加雙蒸水至1000mL，過濾除菌，無菌分裝；終止液：1.25mol/LH2SO4溶液。本發(fā)明能有效檢測鴨瘟抗體效價(jià)，從而為養(yǎng)鴨業(yè)的綜合防控提供重要監(jiān)測手段。
【專利說明】—種檢測鴨瘟病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測鴨瘟病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨痕(DuckPlague, DP)又稱鴨病毒性腸炎(Duck Virus Enteritis, DVE),是由鴨腸炎病毒(Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性、敗血性和高度接觸性的傳染病，是目前對世界范圍水禽養(yǎng)殖業(yè)危害最為嚴(yán)重的疫病之一，自1957年黃引賢在廣東省首次證實(shí)鴨瘟病毒在我國流行以來，全國其他省份包括貴州等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，給貴州省養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展帶來了極大的危害。
[0003]鴨瘟是可以通過疫苗免疫得到良好控制的一種疾病，但由于某些不可預(yù)知的原因，導(dǎo)致免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。血清學(xué)檢測是制定和實(shí)施鴨瘟防制措施的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前常用的血清學(xué)檢測方法有病毒中和試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，其中，ELISA方法因其具有方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)具有重要潛在開發(fā)前景。
[0004]目前，對鴨瘟的控制主要通過疫苗接種來完成，但隨著貴州省畜牧業(yè)的發(fā)展，特別是貴州省將三穗鴨作為地方特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)開發(fā)以來，三穗鴨的年養(yǎng)殖量持續(xù)上升，預(yù)計(jì)到2025年貴州三穗鴨產(chǎn)業(yè)區(qū)每年鴨的生產(chǎn)總量達(dá)4億羽以上，這對該病的預(yù)防帶來較大的威脅。目前，我國尚未建立商品化的鴨瘟血清抗體檢測試劑盒，使該病的臨床控制缺乏了一種關(guān)鍵實(shí)時(shí)的監(jiān)測手段，因此，建立一種可行的鴨瘟血清抗體檢測方法是十分必要的。
[0005]本發(fā)明通過鴨胚增殖鴨瘟病毒，建立了一種快速檢測鴨瘟病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，將為養(yǎng)鴨業(yè)的綜合防控提供重要監(jiān)測手段。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種快速檢測鴨瘟病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，并進(jìn)行條件優(yōu)化，制備成商品化的間接ELISA試劑盒。該間接ELISA試劑盒的發(fā)明，將為養(yǎng)鴨業(yè)的鴨瘟免疫效果評價(jià)提供一種有效手段。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其組成包括:包被病毒50 μ L~200 μ L、包被緩沖液25mL~40mL、酶標(biāo)二抗300~500 μ L、IXPBST緩沖液80(Tl000mL、陽性對照lmL、陰性對照lmL、封閉緩沖液25mL~40mL、底物液AlOmL~15mL、底物液BlOmL~15mL和終止液IOmL~15mL。
[0008]所述的包被緩沖液濃度為2.0 μ g/100 μ L^6.5 μ g /100 μ L。
[0009]所述酶標(biāo)二抗作1:100^300倍體積稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG。
[0010]所述的陽性對照使用時(shí)用血清稀釋液按l:l(Tl:200倍稀釋；所述的陰性對照為未感染且未免疫鴨瘟疫苗的鴨血清，稀釋度為1: l(Tl: 200。
[0011]所述的封閉緩沖液為:BSA 1.0g溶于IOOmL PBST緩沖液；所述底物液A為:Na2HPO4 14.60g、檸檬酸9.33g和過氧化氫脲0.52g,溶于三蒸水，并定容至1000mL,調(diào)至pH5.0^5.4 ;所述底物液B為:TMB 20mg和無水乙醇IOmL,加雙蒸水至1000mL,過濾除菌。
[0012]所述的終止液為1.25mol/L H2SO4溶液。
[0013]用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒的制備方法，它包括以下步驟:
第一，將貴州株鴨瘟通過鴨胚增殖，獲得含有鴨瘟病毒貴州株的粗蛋白，通過層析柱進(jìn)行病毒蛋白純化；
第二，步驟一的純化病毒作為包被抗原，進(jìn)行抗原包被液濃度、抗原包被條件、封閉液、血清稀釋度、封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋濃度和顯色反應(yīng)時(shí)間按間接ELISA的條件優(yōu)化；
第三，取20份已經(jīng)DEV抗體陰性的鴨血清，按步驟二確定的最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)；樣本0D630nm值≥陰性樣本0D630nm值的平均值(X) +3 (標(biāo)準(zhǔn)差)，可在99%的水平上判斷為陽性，當(dāng)樣本(?63011111值<陰性樣本0D630nm值的平均值(X)+3(標(biāo)準(zhǔn)差)時(shí)，判為陰性。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明適用于檢測鴨瘟抗體，能夠體現(xiàn)機(jī)體內(nèi)抗體水平，為養(yǎng)鴨場鴨瘟病毒免疫提供一種有效評價(jià)手段， 減少生產(chǎn)中疫苗免疫的盲目性，降低生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的基于鴨瘟病毒貴州株的間接ELISA試劑盒制備生產(chǎn)流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明的實(shí)施例:
基于鴨瘟病毒貴州株的間接ELISA試劑盒原料及配方為:
鴨瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清ImL和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清ImL ;包被病毒為鴨瘟病毒貴州株，并進(jìn)行純化所得，使用包被緩沖液稀釋為2.0 μ g/100 μ L ;包被緩沖液=Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g溶于去離子水中，定容至1000mL,調(diào)至pH9.6 ;酶標(biāo)二抗:羊抗鴨IgG-HRP，按1:50倍稀釋待用；1XPBST 緩沖液:NaCl 8.0g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、Tween-200.5mL溶于800mL蒸餾水，調(diào)整pH為7.4，定容至1000mL ;封閉緩沖液:BSA1.0g溶于100mlPBST緩沖液；底物液A =Na2HPO4 14.60g、檸檬酸9.33g、過氧化氫脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL,調(diào)至pH5.2 ;底物液B:TMB 20mg、無水乙醇IOmL,加雙蒸水至1000mL,過濾除菌，無菌分裝；終止液:1.25mol/L H2SO4溶液。
[0017]所述的基于鴨瘟病毒貴州株的間接ELISA試劑盒制備步驟包括:
第一，純化鴨瘟病毒的獲得。通過鴨胚增殖獲得含有鴨瘟病毒貴州株的粗蛋白，通過層析柱進(jìn)行病毒蛋白純化，經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純化效果檢測及定量；
第二，步驟一的純化病毒作為包被抗原，采用矩陣法對間接ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。ELISA方法最佳反應(yīng)條件:抗原包被液濃度2.0 μ g/100 μ L ;血清稀釋度1:10 ;抗原包被條件室溫12h ;封閉液1%BSA，封閉時(shí)間Ih ;酶標(biāo)二抗稀釋濃度1:200 ;顯色反應(yīng)時(shí)間IOmin ；第三，取20份已經(jīng)鴨瘟抗體陰性的鴨血清，按步驟二確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)。樣本0D630nm值≥陰性樣本0D630nm值的平均值(X)+3 (標(biāo)準(zhǔn)差)=0.1755，可在99%水平上判斷為陽性，因此當(dāng)樣本0D630nm值≥0.1755時(shí)，判為陽性；當(dāng)樣本0D630nm值< 0.1755時(shí)，判為陰性。[0018]第四，基于鴨瘟病毒貴州株的間接ELISA試劑盒的最佳使用步驟與方法確定。
[0019](I)以2.0 μ g/100 μ L的鴨瘟病毒貴州株100 μ L包被ELISA反應(yīng)板，輕輕振蕩，加蓋封口膜4°C作用12h后，應(yīng)用PBST洗滌ELISA反應(yīng)板5次；(2)每孔加入1% BSA溶液封閉液100 μ L，37°C封閉Ih后，應(yīng)用PBST洗滌反應(yīng)板5次；(3)將待檢血清用PBST做1:10倍稀釋，按100 μ L每孔加入ELISA反應(yīng)板，輕輕振蕩后37°C作用1.0h,應(yīng)用PBST溶液洗滌ELISA反應(yīng)板作用5次；(4)將羊抗鴨IgG-HRP用PBST作1:200倍稀釋，按100 μ L加入ELISA反應(yīng)板，輕輕振蕩37°C作用Ih后，應(yīng)用PBST洗滌ELISA反應(yīng)板5次；(5)將底物液A和B各50 μ L加入ELISA反應(yīng)板，避光室溫顯色lOmin，加入50 μ L終止液，立即在酶標(biāo)儀630nm波長下讀取OD值。(6)試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為樣本(?63011111值> 0.1755為陽性，0D630nm值≤0.1755為陰性。
[0020]第五，應(yīng)用步驟三建立的間接ELISA方法，檢測鴨瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的0D630nm值為
0.573 ;鴨病毒性肝炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、鴨禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、番鴨細(xì)胞病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的0D630nm值為0.1025~0.1437，確定特異性良好；
第六，應(yīng)用步驟三建立的間接ELISA方法，批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均(15.0%，確定該間接ELISA批內(nèi)重復(fù)性及批間重復(fù)性良好；
第七，應(yīng)用步驟三建立的間接ELISA方法，檢測140份中和試驗(yàn)檢測陽性的臨床鴨血清樣本，陽性率為93.6%(131/140)，確定其臨床適用性良好；
第八，步驟五、步驟六和步驟七合格即制得基于鴨瘟病毒貴州株的間接ELISA試劑盒。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:其組成包括:包被病毒50 μ L~200 μ L、包被緩沖液25mL~40mL、酶標(biāo)二抗300~500 μ L、I XPBST緩沖液80(Tl000mL、陽性對照lmL、陰性對照lmL、封閉緩沖液25mL~40mL、底物液AlOmL~15mL、底物液BlOmL~15mL和終止液10mL~15mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述的包被緩沖液濃度為2.0 μ g/100 μ L~6.5 μ g /100 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利I要求所述的用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述酶標(biāo)二抗作1:100-300倍體積稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG。
4.根據(jù)權(quán)利I要求所述的用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照使用時(shí)用血清稀釋液按l:l(Tl:200倍稀釋；所述的陰性對照為未感染且未免疫鴨瘟疫苗的鴨血清，稀釋度為1: l(Tl: 200。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述的封閉緩沖液為:BSA 1.0g溶于IOOmL PBST緩沖液；所述底物液A為:Na2HPO4 14.60g、檸檬酸9.33g和過氧化氫脲0.52g,溶于三蒸水，并定容至1000mL,調(diào)至pH5.0^5.4 ;所述底物液B為:TMB 20mg和無水乙醇IOmL,加雙蒸水至1000mL,過濾除菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述的終止液為1.25mol/L H2SO4溶液。
7.如權(quán)利1~6任一項(xiàng)所述的用于檢測鴨瘟病毒貴州株抗體的間接ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于: 它包括以下步驟: 第一，將貴州株鴨瘟通過鴨胚增殖，獲得含有鴨瘟病毒貴州株的粗蛋白，通過層析柱進(jìn)行病毒蛋白純化； 第二，步驟一的純化病毒作為包被抗原，進(jìn)行抗原包被液濃度、抗原包被條件、封閉液、血清稀釋度、封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋濃度和顯色反應(yīng)時(shí)間按間接ELISA的條件優(yōu)化； 第三，取20份已經(jīng)DEV抗體陰性的鴨血清，按步驟二確定的最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)；樣本0D630nm值≥陰性樣本0D630nm值的平均值(X) +3 (標(biāo)準(zhǔn)差)，可在99%的水平上判斷為陽性，當(dāng)樣本(?63011111值<陰性樣本0D630nm值的平均值(X)+3(標(biāo)準(zhǔn)差)時(shí)，判為陰性。
【文檔編號】G01N33/569GK103777011SQ201410045088
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月7日
【發(fā)明者】嵇辛勤, 阮涌, 文明, 傅心亮, 李世靜 申請人:貴州大學(xué)