專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)狂犬病毒的方法及試劑盒的制作方法
檢測(cè)狂犬病毒的方法及試劑盒
所屬領(lǐng)域
本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中狂犬病毒存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)定量熒光 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)樣品中的狂犬病毒，以早期診斷狂犬病毒感染的方法及所使用的試劑
背景技術(shù)：
狂犬病又稱(chēng)為恐水癥，為狂犬病病毒引起的一種人畜共患的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病， 是法定的甲類(lèi)傳染病?？袢《嘁?jiàn)于狗、狼、貓等食肉動(dòng)物。人狂犬病主要是人被患病動(dòng)物 咬傷所致，或與家畜密切接觸有關(guān)。 一旦發(fā)病，死亡率幾乎100%。臨床表現(xiàn)為特有的狂躁、
恐懼不安、怕風(fēng)恐水、流涎和咽肌痙攣，終至發(fā)生癱瘓而危及生命。
狂犬病病毒(Rabies virus)屬?gòu)棤畈《究?Rhabdoviridae)，病毒外形呈彈狀(60 400nmX60 85nm)， 一端鈍園，另一端平凹，有囊膜，內(nèi)含衣殼呈螺旋對(duì)稱(chēng)。核酸是單股不 分節(jié)負(fù)鏈RNA。發(fā)展中國(guó)家的狂犬病主要傳染源是病犬，人狂犬病由病犬傳播者約占80 90%， 其次為貓和狼。在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于狗狂犬病被控制，野生動(dòng)物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和綜 熊等逐漸成為重要傳染源。
人對(duì)狂犬病普遍易感?？袢∮绊懙绞澜绱蟛糠值貐^(qū)，整個(gè)美州、非洲、亞洲以及歐洲 部分地區(qū)都有狂犬病。據(jù)報(bào)道，全世界每年因狂犬病死亡的人數(shù)約為4一7萬(wàn)人。絕大多數(shù)病 例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，其中98%在亞洲，而中國(guó)僅次于印度，居世界第二位。在中國(guó)，狂 犬病的主要傳染源是病犬，人狂犬病由病犬傳播者占80—90%。
狂犬病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括內(nèi)基小體檢査、熒光抗體檢査法、酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)、狂 犬病毒抗原、病毒分離。
由于狂犬病一旦發(fā)病，病死率幾乎百分之百，因此總是將重點(diǎn)在于預(yù)防上。懷疑被動(dòng)物 咬傷后，接種狂犬疫苗和應(yīng)用抗狂犬病血清幾乎是現(xiàn)有的唯一方法。但由于狂犬疫苗和抗狂 犬病血清價(jià)格昂貴，所以建立一種更為廉價(jià)、靈敏和特異的早期診斷方法應(yīng)是具有廣泛的應(yīng) 用前景的。
利用PCR技術(shù)檢測(cè)病毒RNA，具有早期發(fā)現(xiàn)、靈敏度和特異性高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR
技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來(lái)的。與傳統(tǒng)的(終點(diǎn)檢測(cè))PCR技術(shù)相 比，實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了很小拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和 精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣 品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法。
眾所周知，在使用已知的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)和定量分析臨床樣品中某特定靶核酸 的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測(cè)結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性，提高定量分析的準(zhǔn)確性， 一個(gè)關(guān)鍵 性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)并制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽?針。本發(fā)明人在以往多年從事PCR技術(shù)特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，將該技術(shù) 應(yīng)用于狂犬病毒基因組多核苷酸的檢測(cè)和定量分析，成功地完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法 及其試劑盒在狂犬病毒感染的早期實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中狂犬病毒存在的方法， 該方法包括(1)提供包括狂犬病毒基因組核酸的樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測(cè)體系的 反應(yīng)與檢測(cè)混合物，(2)通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多核苷酸，(3)使所說(shuō)的熒光發(fā)生 基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò) 增循環(huán)后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對(duì)量；其中核酸擴(kuò)增體系包括可與耙
多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光檢測(cè)體系包括可與耙多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；
特征在于所說(shuō)的擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5'-gacatgtttttctcccggattgagca -3， (SEQ ID NO: 1)禾口5'-tcttcttcaaagttcttatggaa -3， (SEQ ID NO: 2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5，-gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag-3， (S1':Q ID NO: 3)。
與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測(cè)的傳統(tǒng)PCR方法不同，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)方 法可以在擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程中隨時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和 精密度。如眾所周知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增中，同時(shí)加入引物和5'、 3'末端分別標(biāo) 記有熒光報(bào)告基團(tuán)(例如6-FAM amidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(tuán)(例如6-羧基四甲基 若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒(méi)有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，其序列保持完整，報(bào)告 基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)將被淬滅基團(tuán)吸收，所以沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生；而當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)， DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，因 而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈即有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同歩，實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲 線對(duì)未知靶多核苷酸(模板)進(jìn)行定量分析。
與通常的實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)相似，本發(fā)明的檢測(cè)樣品中狂犬病毒基因組雙鏈靶多核苷 酸存在的方法中同樣包括(1)提供包括(a)待檢樣品(b)耐熱DNA聚合酶和(c) 2-脫氧核 苷三磷酸(dNTP)的擴(kuò)增反應(yīng)體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第一條互補(bǔ) 鏈結(jié)合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第二條互補(bǔ)鏈結(jié)合的反向引物，以及 (c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的任一條鏈結(jié)合并且兩末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅 基團(tuán)的寡核苷酸探針的熒光檢測(cè)體系；(2)通過(guò)一次或多次聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多核 苷酸；(3)退火后使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)通過(guò)探針與靶多核苷酸的結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)；(4) 檢測(cè)并確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量；(5)分析一次或多次擴(kuò)增循環(huán)所發(fā)出的熒光量， 以檢測(cè)靶多核苷酸的存在；特征在于其中所說(shuō)的靶多核苷酸是狂犬病毒基因組多核苷酸，所 使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5，- gacatgtttttctcccggattgagca -3， (SEQ ID NO: 1)和5'- tcttcttcaaagttcttatggaa -3， (SEQ ID NO: 2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5'-gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag _3， (SEQ ID NO: 3)。
如前所述，為了檢測(cè)出臨床樣品中可能存在的所有類(lèi)型狂犬病毒野毒株及疫苗株，并能 夠準(zhǔn)確有效地將狂犬病毒感染與乙型腦炎病毒、辛德畢斯病毒、Colti病毒、克里米亞一剛 果出血熱病毒、破傷風(fēng)桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、柯薩奇病毒感染鑒別丌，設(shè)計(jì)并制備實(shí)現(xiàn)這 些目的的寡核苷酸引物和探針是一個(gè)非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。為此，我們?cè)谑褂眠m當(dāng)?shù)暮怂岱?析軟件對(duì)己知的狂犬病毒變異體的基因組核苷酸序列進(jìn)行同源性比較并找出同源區(qū)段的基礎(chǔ) 上，進(jìn)一歩設(shè)計(jì)了具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物l: 5，- gacatgtttttctcccggattgagca -3， (26mrs) (SEQ ID NO: 1)禾口弓l物2: 5，- tcttcttcaaagttcttatggaa -3, (23 mrs) (SEQ ID NO: 2);以及具有下示序列的寡核苷酸探針5，_ gggttcataaagc卿tcaatctcactgcgagag -3， (SEQ ID NO: 3)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)樣品中狂犬病毒 的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測(cè)體系在內(nèi)的反應(yīng)與檢 測(cè)混合物，(2)通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多聚核苷酸，(3)使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)'3 被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò)增循環(huán) 后，根據(jù)循環(huán)反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光量結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多核苷酸的存在及其相對(duì)量(即 靶核酸序列的拷貝數(shù))；其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒 光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)包括一個(gè)可與靶多核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的正 向和反向寡核苷酸引物分別是5，- gacatgtttttctcccggattgagca _3， (SEQ ID NO: 1)和5，-
tcttcttcaaagttcttatggaa _3' (SEQ ID NO: 2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5'
gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag -3， (SEQ ID NO: 3)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的樣品是可疑狂犬病毒感染者的臨床樣品。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶多核苷酸來(lái)自狂犬病毒。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是聚合酶鏈反應(yīng)，并且所說(shuō)
的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是大約重復(fù)30次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、 (b) 2，-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)
能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)體系包括能夠與靶多核苷酸
結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的方法進(jìn)一歩包括(1)確定樣品中的靶多核苷
酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣
品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中己知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計(jì)算
出樣品中靶多核苷酸的量。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中狂犬病
毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A (lOOul /管)、RNA提取液B (4ml/
瓶)、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系(20ul/管)、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPCH20) (2.0ml/管)、
RABV — PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I (180 y 1 /管)、陰性質(zhì)控品(250 u 1 /管)、RABV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品(200 u 1
/管)和RABV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品(200y 1 /管)、RABV陽(yáng)性定量參考品(1 x 106copies/ml、 lx
107copies/ml、 1x10s copies/ml、 lx109 copies/ml，各10 u 1/管)并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或離心
管，還包括PCR反應(yīng)管。(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或離心管的包裝盒。
其中RNA提取液A由Si02經(jīng)DEPC水處理后調(diào)節(jié)PH值為2.0，高壓滅菌后4。C保存。RNA提取液
B由GuSCN (異硫氰酸胍)120g， 0, lMTris-HC1 (pH6.4) 100ml 0. 2M， EDTA (PH8.0) 22ml
混合組成，4'C保存。DEPC H20由純水按H的比例加入DEPC溶解混勻，室溫放置12小時(shí)以上。
高壓滅菌后4i:保存。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系由mMLV酶原液(200U/ul)、 RNasin原液(40U/ul)
用酶稀釋緩沖液配制成每微升含有50U mMLV酶、4U RNasin， -20。C保存。
每人份RABV — PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I含有引物PRABV1和PRABV2 (40 pmol/y 1 )各O. 05 y 1 、
25raM dNTPs 0.4ul、 5XRT buffer 4ul組成，總量18ul， -20。C保存。
每個(gè)PCR反應(yīng)管由RABV PCR反應(yīng)液40W、固體封蓋劑30W、 Taq酶系組成。RABV PCR
反應(yīng)液、固體封蓋劑、Taq酶系組成如下RABVPCR反應(yīng)液由引物PRABV1， PRABV2 (幼pmo1/ ul)各0.25ul、熒光探針FP (30pmol/ul) 0. lul、 PCR反應(yīng)緩沖液39. 4y 1， -20。C保 存。其中PCR反應(yīng)緩沖液由50mM Tris-HCl(pH8.0)、 5mM MgCl2、 50rnM KC1、 3%的甲酰胺組 成，4"C保存。
固體封蓋劑由固體切片石蠟經(jīng)7(TC溶解，定性濾紙過(guò)濾與經(jīng)高壓滅菌處理的分析純液體 石蠟按l: 6的比例配制而成。
Taq酶系是將Taq酶原液(10U/y 1)、 25mMdNTPs、 3%瓊脂糖，用酶稀釋緩沖液稀釋成1U/ ul Taq酶，3mM dNTPs、 0.4%瓊脂糖。-20。C保存。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和逆向引物分 另U是5，- gacatgtttttctcccggattgagca -3， (SEQ ID NO: 1)禾口5，- tcttcttcaaagttcttatggaa -3， (SEQ ID NO: 2)。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸是 5，- gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag -3(SEQ ID NO: 3)。
引物所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)段相當(dāng)于狂犬病毒核蛋白編碼序列的保守區(qū)，長(zhǎng)度為173bp。其中， 引物l互補(bǔ)于病毒基因組的第701-726位核苷酸；引物2互補(bǔ)于病毒基因組的第851-873位核苷 酸。探針則互補(bǔ)與第800-833位核苷酸。
由于本發(fā)明所設(shè)計(jì)的這些引物和探針均具有互補(bǔ)于病毒基因組保守區(qū)的序列，而且與其
他類(lèi)型病毒的核苷酸序列沒(méi)有同源性，也不包括任何常見(jiàn)的核酸內(nèi)切酶，所以大大減少甚至 避免了狂犬病毒檢測(cè)的假陰性和假陽(yáng)性，提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度。
可使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和FPLC層析法純化后進(jìn)行氨解處 理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5'端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)道基團(tuán)) 的6-FAM amidite，并在其3'端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)并作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的TAMRA。 以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，可使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳 法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。
使用常規(guī)RNA提取方法或市售的RNA提取試劑盒，從得自受試者的唾液樣品中提取RNA，然 后使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將所提取的RNA轉(zhuǎn)化成eDNA并將此逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于繼后的PCR擴(kuò)增。
在含有引物1和2 (各10pmo1)、熒光探針FP (3pmo1)、 DNA模板(PCR擴(kuò)增靶序列)、dNTP (3mM)、耐熱DNA聚合酶(T叫man)、 PCR緩沖液和水的反應(yīng)體系中，使用PE5700型或其他結(jié)構(gòu) 類(lèi)型的自動(dòng)熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀上對(duì)如上得到的eDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所使用的反應(yīng)條件是 93。C預(yù)變性2分鐘后，首先按93。C， 15秒一60°C， 60秒完成10次循環(huán)，然后再按93。C, 15秒 —6(TC, 60秒條件共進(jìn)行30次循環(huán)。
反應(yīng)完成后，借助裝置上配置的自動(dòng)分析系統(tǒng)分析結(jié)果。對(duì)PEGeneAmp 5700 (AB1 Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler參照此方法)而言，如果增長(zhǎng)曲線 不呈S型或循環(huán)閾(Ct)值等于30，結(jié)果即為陰性；如果增長(zhǎng)曲線呈S型且Ct值小于30，結(jié)果 則為陽(yáng)性。對(duì)Light Cycle而言，如果增長(zhǎng)曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，結(jié)果即為陰性； 如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且CT值小于40，結(jié)果則為陽(yáng)性。其中以反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)所產(chǎn)生的熒 光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。 一般說(shuō)來(lái)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。因?yàn)樵跀U(kuò)增反應(yīng)的Ct值之前的階段，擴(kuò)增系統(tǒng)中的酶、引物、探針和dNTPs均大大過(guò) 量，而且系統(tǒng)的p值和離子濃度等也相對(duì)穩(wěn)定，所以此時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)的效率是一個(gè)與模板數(shù)無(wú) 關(guān)的飽和定值。與Ct值相關(guān)的只有起始模板數(shù)(多聚核苷酸樣品的拷貝數(shù))和與樣品無(wú)關(guān)的 PCR系統(tǒng)效率。
可利用己知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為 橫坐標(biāo)，并以如上測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從基于平行 實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，然后計(jì)算出該靶多核苷酸的起 始拷貝數(shù)(當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)達(dá)到Ct值即初始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一靶多 核苷酸在不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間在不同管內(nèi)擴(kuò)增所得到的Ct值總是恒定的)。也就是說(shuō)，為 了基于上述的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多核苷酸的量(起始拷貝數(shù))，本發(fā)明的方法還進(jìn)一歩包 括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的 閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量耙多核苷 酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中狂犬病 毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A (100ul /管)、RNA提取液B (4ml/ 瓶)、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系(20ul/管)、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPCH力)(2.0ml/管)、 RABV—PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I (180ul/管)、陰性質(zhì)控品(250ul/管)、RABV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品(200u丄 /管)和RABV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品(200u 1 /管)、RABV陽(yáng)性定量參考品(lxl06copies/ml 、 lx 107copies/ml 、 lx108copies/ml 、 lx109copies/ml，各10y 1 /管)并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或離心 管，還包括PCR反應(yīng)管。(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或離心管的包裝盒。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中濃縮液用于濃縮液態(tài)待檢樣品。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中稀釋液用于稀釋陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品。 根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和逆向引物分 另ll是5，- gacatgtttttctcccggattgagca _3， (SEQ ID NO: 1)禾口5，_ tcttcttcaaagttcttatggaa<formula>formula see original document page 10</formula>
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸是 5，_ gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag _3(SEQ ID NO: 3)，。
可按照如上所描述的和試劑盒中所附使用說(shuō)明書(shū)中指出的方法使用本發(fā)明的試劑盒。 如前所述，為了檢測(cè)出臨床樣品中可能存在的所有狂犬病毒變異體，并能夠準(zhǔn)確有效地
將狂犬病毒感染與乙型腦炎病毒、辛德畢斯病毒、Colti病毒、克里米亞一剛果出血熱病毒、 破傷風(fēng)桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、柯薩奇病毒等其他常見(jiàn)病毒感染鑒別開(kāi)，本發(fā)明基于對(duì)這些 變異體和相關(guān)病毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設(shè)計(jì)了適用本發(fā)明試劑盒的寡核苷 酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，大大減小了狂犬病毒多核苷酸檢 測(cè)的假陽(yáng)性和假陰性。我們的實(shí)驗(yàn)證明，檢測(cè)狂犬病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為100%， 靈敏度達(dá)到l X 105個(gè)拷貝/1111。
值得特別說(shuō)明的是，為了確保本發(fā)明的狂犬病毒檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，我們使用攜帶有狂 犬病毒核苷酸(c;DNA)序列的重組質(zhì)粒作為DNA定量檢測(cè)參考品。借助這些額外參考品，使用 本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行平行檢測(cè)并制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進(jìn)一歩驗(yàn)證 本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)精確度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒的附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
另外，由于本發(fā)明試劑盒的擴(kuò)增反應(yīng)條件中所采用的退火溫度為6(TC，距離預(yù)定的實(shí)際 退火溫度66.2'C相差達(dá)8.2i:。所以，即使樣品中的靶核苷酸只有單個(gè)核苷酸的變異，也足以 保證熒光探針與在靶核苷酸上的結(jié)合和熒光信號(hào)的產(chǎn)生和釋放。


當(dāng)病毒拷貝數(shù)為105時(shí)，檢測(cè)樣品得Ct值在25左右，即檢測(cè)下限靈敏度可到達(dá)105拷貝(圖 1A)。圖lB顯示Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對(duì)模板數(shù)為105 109拷貝的反應(yīng)體系進(jìn)行 TaqMan PCR分析。繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3. 08， R = -0. 997432 (圖1B)。
圖2顯示強(qiáng)中弱三個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本的曲線。三個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是15.36，18.35， 23.10;結(jié)合 擴(kuò)增曲線為S形，三者均能夠判定位陽(yáng)性。
圖3顯示陰性標(biāo)本曲線。三個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增曲線為比較平直的折線，與熒光檢測(cè)閾值線沒(méi) 有交點(diǎn)，或者顯示Ct值為30并且擴(kuò)增曲線不具有S形特征。
圖4顯示5個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本曲線，CT值均小于30，擴(kuò)增曲線為S形，均能夠判定為陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式
(1)制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液A (100ul /管)、RNA提取液B (4ml/ 瓶)、逆轉(zhuǎn)錄酶系(20ul /1管)、DEPC H20 (2.0ml/管)、PCR反應(yīng)液I (180ul /管)、陰性 對(duì)照標(biāo)本(250iil /管)、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品(200yl /管)、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品(200u 1 /管)、陽(yáng)性
定量參考品(lxl06copies/ml 、 lxl07copies/ml 、 lx108 copies/ml 、 lx109 copies/ml，各10u 1 /管)。
其中RNA提取液A由一-組成；RNA提取液B由-一組成；逆轉(zhuǎn)錄酶系包括一一；PCR反應(yīng)液I由-一 組成。本發(fā)明中使用一作為陰性對(duì)照；使用一作為強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品；使用一-作為臨界陽(yáng)性質(zhì) 控品并使用一一作為陽(yáng)性定量參考品。
(2) 標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存使用無(wú)菌容器采集受檢者唾液，而后轉(zhuǎn)入無(wú)菌凍存管。如 集中檢驗(yàn)，標(biāo)本需在-2(TC以下低溫(例如-7(TC)、液氮中或含50X甘油的PBS中保存。
(3) 檢測(cè)和結(jié)果
首先處理標(biāo)本、陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。8000rpm離心數(shù)秒。取高壓滅菌處理過(guò)的l. 5ml 離心管，向離心管加入10pl的RNA提取液A，再加入標(biāo)本、陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品，再加入 200ul的RNA提取液B并混合均勻。室溫放置5分鐘后8000rpm離心l分鐘，小心吸去上清。加入 200y 1的RNA提取液B并混合均勻，8000rpm離心l分鐘，小心吸去上清。用75%的預(yù)冷乙醇洗沉 淀，8000rpm離心l分鐘，去上清。共洗兩次。然后65'C、 IO分鐘干燥沉淀。向干燥后的沉淀管 加入18ul PCR反應(yīng)液I打勻，再加入逆轉(zhuǎn)錄酶2pl，混勻。65。C放置45分鐘，95。C加熱3分 鐘。8000rpm離心l分鐘，待用。的存在下將吸附在沉淀上的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后， 吸取5nl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做PCR反應(yīng)。陽(yáng)性定量參考品離心數(shù)秒后備用。
然后分別取標(biāo)本(每份5ul)和同體積的定量參考品及質(zhì)控品，加樣進(jìn)PCR反應(yīng)體系中并 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是
93°C—2分鐘預(yù)變性，然后按93'C 15秒一60°C 60秒，IO個(gè)循環(huán)后，按93。C 15秒一60 °C 60秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)分析參數(shù)使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Std curve ) 窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳(即correlation數(shù)值介于一1.0 一0.97)(參見(jiàn)圖4)。由圖4 可看出，陽(yáng)性標(biāo)本的熒光曲線與設(shè)定的閾值線有一交點(diǎn)，而陰性標(biāo)本的熒光曲線低于閾值。 最后儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的未知標(biāo)本數(shù)值(Qty)。標(biāo)本的狂犬病毒RNA含量(基因拷貝數(shù) /ml)=2 . 07X 107基因拷貝/ ml (Qty)。
序列表
<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
<120>檢測(cè)狂犬病毒的方法及試劑盒
<140>
<141〉
〈160〉 3
〈210〉 1
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213>人工序列
<220〉
〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 〈400〉 1
gacatgtttt tctcccggat tgagca
<210〉 2 〈211〉 23 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>
〈223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 〈400〉 2
tcttcttcaa agttcttatg gaa
〈210〉 3 〈211〉 34 <212>腿 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。 〈400〉 3
gggttcataa agcagatcaa tctcactgcg agag
權(quán)利要求
1、一種使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測(cè)樣品中狂犬病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、包括耐熱DNA聚合酶、2’-脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物和能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物的核酸擴(kuò)增體系，以及熒光監(jiān)測(cè)體系的反應(yīng)與檢測(cè)混合物，(2)通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多核苷酸，(3)使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò)增循環(huán)后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對(duì)量；其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于其中核酸擴(kuò)增體系中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-gacatgtttttctcccggattgagca-3’和5’-tcttcttcaaagttcttatggaa-3’，并且其中熒光監(jiān)測(cè)體系中所使用的寡核苷酸探針是5’-gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說(shuō)的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b) 2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物5，-gacatgtttttctcccggattgagca -3'，和(d)能夠與雙鏈耙多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引 物5'- tcttcttcaaagttcttatggaa—3'。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的熒光檢測(cè)體系包括能夠與耙多核苷酸結(jié)合并且兩 未端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針 5'-gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag-3，。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第(5)步驟中所說(shuō)的方法進(jìn)一歩包括(1)確定樣品 中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2) 將己確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中己知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相 比較，以計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說(shuō)的靶多核苷酸來(lái)自狂犬病毒。
6、 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中狂犬病毒的試劑盒，該試劑盒包括: (1)分別裝有RNA提取液A (100 u 1 /管)、RNA提取液B (4ml/瓶)、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系(20 ix L /管)、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPCH20) (2.0ml/管)、RABV — PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I (180 y 1 /管)、陰性質(zhì)控品(250ul /管)、RABV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品(200txl /管)和RABV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品 (200 ul /管)、RABV陽(yáng)性定量參考品(lxl06copies/ml、 lxl07copies/ml、 lx108 copies/ml、 lx109 卿ies/ml，各10ul/管)并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或離心管，還包括PCR反應(yīng)管。(2)分隔 并集中包裝這些試劑瓶或離心管的包裝盒，特征在于靶多核苷酸擴(kuò)增中使用的正向和反向引 物分另U是5'- gacatgtttttctcccggattgagca隱3，禾口 5，- tcttcttcaaagttcttatggaa-3'， 并且其 中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)的寡核苷酸探針是5'-gggttcataaagcagatcaatctcactgcgagag-y 。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中狂犬病毒(RABV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)早期診斷狂犬病毒感染的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N21/00GK101178350SQ20061012341
公開(kāi)日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2006年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日
發(fā)明者青 唐, 強(qiáng) 張, 浩 李, 瑪 李, 王方金, 鋼 程, 陳劍平, 黃立英 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司;中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所