專利名稱：用于檢測抗原/或抗體的診斷片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測抗原/或抗體的診斷片及其制備方法，屬血清學(xué)檢測抗原/或抗體技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清學(xué)反應(yīng)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)的凝聚性反應(yīng)，是通過抗原抗體在介質(zhì)中以不同形式的擴散和遷移，在特定部位結(jié)合，最終形成肉眼可見的抗原抗體復(fù)合物沉淀帶或凝集片。在現(xiàn)代標記技術(shù)中，通過檢測被標記的酶(酶促反應(yīng))、同位素或熒光素等發(fā)現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)的存在，所以可以檢測極微量的抗體或抗原。比較兩類反應(yīng)，前者簡便，不需要特殊儀器設(shè)備而敏感性差；后者敏感性高卻需要特殊儀器檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠簡便、敏感、快速檢測抗原/或抗體的診斷片，以適應(yīng)血清學(xué)檢測的應(yīng)用需要。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測抗原/或抗體診斷片的制備方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)措施和步驟實現(xiàn)的
一種用于檢測抗原/或抗體的診斷片，其特征在于在條形塑料底襯上，自上而下依次固定有紙質(zhì)吸水材料、玻璃纖維、吸附有抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠、吸附有酶標記抗體/或抗原的玻璃纖維載體、吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng)底物的玻璃纖維載體，以及紙質(zhì)吸水材料。
其制備方法是
1) 將純化的抗原/或抗體標記在瓊脂糖載體上，干燥成型，得抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠
2) 將相應(yīng)的純化抗體/或抗原用酶進行標記，吸附于玻璃纖維載體，干燥，得酶標記抗體/或抗原的玻璃纖維載體
3) 取與上述2)酶所催化的相應(yīng)底物，溶解吸附于玻璃纖維載體，干燥，得酶催化反應(yīng)的底物的玻璃纖維載體
4)將紙質(zhì)吸水材料和吸附有抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠、吸附有酶標記抗體/或抗原的玻璃纖維載體、吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng)底物的玻璃纖維載體，以及紙質(zhì)吸水材料，自上而下依次固定在條形塑料底襯上，經(jīng)真空干燥，即得用于檢測抗原/或抗體的診斷片。
其技術(shù)效果是與傳統(tǒng)血清學(xué)沉淀反應(yīng)和標記技術(shù)相比較，本發(fā)明的用于檢測抗原/或抗體的診斷片由于根據(jù)凝聚性反應(yīng)原理，把抗原/或抗體結(jié)合在瓊脂糖分子上(即抗原/或抗體被固定在凝膠中)，并結(jié)合了現(xiàn)代酶標記技術(shù)，改進了傳統(tǒng)沉淀反應(yīng)中需大量抗原抗體才能形成肉眼可見的沉淀帶，提高了敏感性，使少量或極少量抗原抗體的結(jié)合就能因酶標抗體/或抗原的存在而被顯色發(fā)現(xiàn)；同時，本發(fā)明依據(jù)親和層析和血清學(xué)沉淀反應(yīng)原理，將相關(guān)材料固定于條形塑料底襯上，使用時只要將條形片一端放置于樣品中，不需要儀器設(shè)備，也無需其他操作，就能簡便、快速的檢測出抗原/或抗體的結(jié)果。


圖1是本發(fā)明的診斷片結(jié)構(gòu)示意圖2是采用診斷片檢測抗原/或抗體的操作與判讀示意圖；其中，圖2A是將診斷片浸入樣品內(nèi)示意圖，圖2B是檢測呈陽性反應(yīng)示意圖，圖2C是檢測呈陰性反應(yīng)示意圖3是診斷片中抗原抗體反應(yīng)與顯色示意圖。
具體實施例方式
實施例l。制備用于檢測抗原的診斷片。
1)制備抗原標記的瓊脂糖凝膠
1. 1溴化氰活化瓊脂糖
直接購買的商品溴化氰活化瓊脂糖(CNBr-activated S印harose 4B)。1.2標記
1.2.1取3.7 g干膠置50ml lmM HC1加予以膨脹，膨脹后，用800mllmMHC1分4次，每次約用15min.進行清洗。
1.2.2取IIO 200mg(6 7ml， 15 30mg/ml)需標記的抗原，經(jīng)用0.1MNaHC03(pH8.3,含0.5 MNaCl)透析(4。C，隔夜)，離心(10000rpm, 10 min.)
4和經(jīng)0.2或0.4um孔徑的濾膜過濾。清洗后的凝膠漿再用0.1MNaHC03作
最后一次處理，濾干后加入已處理過的標記物，在4。C旋轉(zhuǎn)混合16 h,或室溫1 2h。
1.2.3用5倍體積(約100ml)0.1MNaHCO3(同上)清洗未結(jié)合的標記物；轉(zhuǎn)至30 ml的Tris-HCl液(0.1 M， pH 8.0)中，放置2 h; 用兩種不同pH緩沖液(O.l M醋酸鹽，pH 4.0,含0.5 NaCl; 0.1 M Tris- HCl,pH 8，含0.5 M NaCl),
交替清洗三個循環(huán)，每次不少于5倍體積。
1. 3干燥成型
將瓊脂糖-抗原脫水干燥成型(約0.'2mm厚)。
2) 制備酶標記抗體
2. 1抗體制備與純化
2.1.1抗體制備按常規(guī)用純化抗原免疫青年健康家兔(lmg抗原/kg體重，四次免疫注射首免加氟氏完全佐劑，14天和21天加氟氏不完全佐劑，均經(jīng)乳化；28天根據(jù)血清抗體效價，直接靜脈免疫)?？贵w效價為沉淀反應(yīng)(瓊脂糖雙擴散l: 64)以上最佳)。
2.1.2抗體純化采血分離血清，經(jīng)50%、 33%、 33%飽和硫酸銨鹽析和透析去除血清白蛋白。
2.2酶標記(以過碘酸鈉一步法標記辣根過氧化物酶為例)
2. 2. 1稱取2 mg (HRP)溶于2 mL蒸溜水，置10 mL燒杯內(nèi)在磁力攪拌器上攪拌至完全溶解。加入配制好的0. 06 mol/L NaI04 2 mL，混勻4。C放置30min。加入0. 16 mol/L乙二醇溶液2 mL，混勻室溫放置30 min。
2.'2.2與含20 mg蛋白質(zhì)抗原(或抗體)的溶液4 mL混勻，裝如透析袋，用1 mol/L pH 9. 5碳酸緩沖液4'C透析6 h。在透析物中加入NaBH4溶液0. 8 mL， 4。C放置2 h。
2. 2. 3用50%飽和硫酸銨鹽析(30分鐘，離心)溶于0. 02 mol/L Ph 7. 4 PBS。然后將鹽析沉淀物溶于5mL生理鹽水，盛于透析袋內(nèi)，扎緊兩端，置裝有1000mL生理鹽水的燒杯內(nèi)，于4t:冰箱內(nèi)透ft 3天。'期間換液至少8次。
2.2.4將玻璃纖維浸入標定后的酶標抗體液，冷凍真空干燥。
3) 制備酶催化反應(yīng)的底物(以辣根過氧化物酶為例)。3. 1聯(lián)苯二胺配制0.4%溶液。先溶于少量甲醇，再加擰檬酸-磷酸緩沖液 (pH 5.0)溶液混勻，立即用玻璃纖維吸取。
3.2過氧化氫配制10°/晶02溶液。浸入玻璃纖維。
3.3立即分別真空干燥。干燥后用薄層塑料相隔并固定。
4)制備條形診斷片
4. 1將紙質(zhì)吸水材料1、玻璃纖維7、吸附有抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝 膠2、吸附有酶標記抗體/或抗原的玻璃纖維載體3、吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng) 底物的玻璃纖維載體4，以及紙質(zhì)吸水材料5，自上而下依次固定在條形塑料底 襯6上，經(jīng)真空干燥，即得用于檢測抗原的診斷片。
本診斷片用于檢測抗原的原理將底物下端的紙質(zhì)吸水材料部分置于經(jīng)處 理的樣品液中(圖2)。液體進入吸水材料后，向上擴散移動。在此過程中，水 分子先到達干膠，使之膨脹；同時帶動酶標抗體和底物隨液體(流動相)遷移。 如果樣品中不存在抗原(見圖3a-l)，遷移中的酶標抗體，其前端部分與凝膠 中固定抗原結(jié)合(圖3a-2)，其后續(xù)部分則因固定抗原的表位被飽和而不能結(jié) 合，越過瓊脂糖凝膠進入紙質(zhì)上端，與底物反應(yīng)，其產(chǎn)生的顏色范圍在瓊脂糖 凝膠的上部和下部(圖3a-3)。由于凝膠中酶標抗體較多，故顏色較深。如果 樣品中存在相應(yīng)抗原(圖3b-l)，遷移的酶標抗體與凝膠中固定抗原結(jié)合，盡 管遷移而至的酶標抗體增加，但是由于樣品中抗原也遷移而至，提供了新的抗 原表位與酶標抗體結(jié)合(圖3b-2)。酶標抗體既與凝膠中的固定抗原結(jié)合，同 時又與遷移而至的樣品抗原結(jié)合，在凝膠中形成類似網(wǎng)絡(luò)狀的抗原抗體復(fù)合物， 使之阻留在凝膠中，由于酶標抗體被阻截在瓊脂糖凝膠內(nèi)，遷移而至的底物所 被催化的顏色反應(yīng)只局限于瓊脂糖凝膠及其以下部位(圖3b-3)。
實施例2。用于快速檢測抗體的診斷片，其制備方法與實施例1相同，只 要將實施例1中制備抗原標記的瓊脂糖凝膠，改為制備抗體標記的瓊脂糖凝膠; 并將制備酶標記抗體，改為制備酶標記抗原，即得檢測抗體的診斷片。
其用于檢測抗體的原理也與實施例1相同。
權(quán)利要求
1、一種用于檢測抗原/或抗體的診斷片，其特征在于在條形塑料底襯(6)上，自上而下依次固定有紙質(zhì)吸水材料(1)、玻璃纖維(7)、吸附有抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠(2)、吸附有酶標記抗體/或抗原的載體(3)、吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng)底物(4)，以及紙質(zhì)吸水材料(5)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用乎檢測抗原/或抗體的診斷片，其特征在 于所述的載體(3、 4)，為玻璃纖維。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測抗原/或抗體的診斷片，其特征在于所述的吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng)底物，為有色產(chǎn)物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測抗原/或抗體的診斷片，其特征在于其制備方法o將純化的抗原/或抗體標記在瓊脂糖載體上，干燥成型，得抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠2) 將相應(yīng)的純化抗體/或抗原用酶進行標記，吸附于玻璃纖維載體，干燥，得酶標記抗體/或抗原的玻璃纖維載體3) 取與上述酶所催化的相應(yīng)底物，溶解吸附于玻璃纖維載體，干燥，得酶 催化反應(yīng)的相應(yīng)底物的玻璃纖維載體4)將紙質(zhì)吸水材料和吸附有抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠、吸附有酶標 記抗體/或抗原的玻璃纖維載體、吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng)底物的玻璃纖維載 體，以及紙質(zhì)吸水材料，自上而下依次固定在條形塑料底襯上，經(jīng)真空干燥， 即得用于檢測抗原/或抗體的診斷片。
全文摘要
用于檢測抗原/或抗體的診斷片及其制備方法，屬血清學(xué)檢測抗原/或抗體技術(shù)領(lǐng)域。其目的是提供一種能夠簡便、敏感、快速檢測抗原/或抗體的診斷片及其制備方法，以適應(yīng)血清學(xué)檢測的應(yīng)用需要。其技術(shù)要點將紙質(zhì)吸水材料、玻璃纖維、吸附有抗原/或抗體標記的瓊脂糖凝膠、吸附有酶標記抗體/或抗原的玻璃纖維載體、吸附有酶催化反應(yīng)的相應(yīng)底物的玻璃纖維載體，以及紙質(zhì)吸水材料，自上而下依次固定在條形塑料底襯上，經(jīng)真空干燥，即得用于檢測抗原/或抗體的診斷片。其綜合了血清學(xué)中特異性抗原抗體反應(yīng)，層析中蛋白分子可遷移和固定以及酶促反應(yīng)敏感顯見的特點，具有特異、簡便、敏感和快速的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/552GK101509923SQ20091011620
公開日2009年8月19日 申請日期2009年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
發(fā)明者余為一, 陳芳芳 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)