專利名稱：同時(shí)檢測(cè)傳染性微生物的抗原及抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳染性微生物特別是病毒微生物感染的體外檢測(cè)，具體而言，涉及丙型肝炎病毒(HCV)感染的體外檢測(cè)。更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明也涉及一種方法，用于同時(shí)檢測(cè)傳染性微生物特別是病毒微生物的抗原和針對(duì)該傳染性微生物的抗體，還涉及實(shí)施該方法的試劑和試劑盒。更具體而言，涉及一種同時(shí)檢測(cè)HCV抗原和抗HCV抗體的方法，以及實(shí)施該方法的試劑和試劑盒。
丙型肝炎病毒感染是一種肝炎形式，最初被稱為非甲非乙肝炎，是一個(gè)早就認(rèn)識(shí)到的健康問(wèn)題，特別是在輸血方面。
1989年5月31日公開(kāi)的專利申請(qǐng)EP 318 216描述了引起人類丙型肝炎的病毒(被稱為HCV)的cDNA片段的克隆。也描述了編碼該病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS5)的5個(gè)基因的序列(約占HCV總基因組的78％)，C100-3抗原(其含有NS3-NS4區(qū)的363個(gè)氨基酸，與超氧化物歧化酶融合)，以及利用C100-3抗原檢測(cè)抗HCV抗體的方法。這種檢測(cè)抗HCV抗體的“第一代”方法能夠確定HCV是非甲非乙肝炎(現(xiàn)在世界上稱為丙型肝炎)的一個(gè)主要原因。然而，該方法不能檢測(cè)70-80％以上的該病毒感染的血清。這種靈敏度的不足使之不能進(jìn)行感染的早期檢測(cè)。
Okamoto等人(1990a)和1990年9月19日公開(kāi)的專利申請(qǐng)EP 388 232描述了HCV病毒基因組的5’端序列，即編碼導(dǎo)致丙型肝炎的病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼、基質(zhì)、包膜)的基因序列。
Okamoto等人(1990b)發(fā)表了HCV衣殼的氨基酸39-74序列作為靶標(biāo)通過(guò)ELISA檢測(cè)抗HCV抗體的用途。
Hosein等人(1991)的文章描述了一種檢測(cè)抗HCV抗體的免疫測(cè)定法，它以使用結(jié)構(gòu)(衣殼在AA 1-120區(qū)中)和非結(jié)構(gòu)(NS3-NS4在AA1200-1800區(qū)中)合成肽抗原為基礎(chǔ)。已經(jīng)證明了合成肽在抗HCV抗體檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)，以及結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)抗原組合的優(yōu)點(diǎn)這種組合可提高靈敏度，因此可以及早檢測(cè)。此處所述的測(cè)定法能夠早4-10周檢測(cè)抗體。該文也顯示，不存在主要的優(yōu)勢(shì)免疫表位，例如，已知AIDS病毒同樣如此。
Nasoff等人(1991)指出，衣殼的大多數(shù)優(yōu)勢(shì)免疫反應(yīng)性表位位于N端區(qū)(AA 1-40)，針對(duì)這些表位的抗體在感染后很快產(chǎn)生。
檢測(cè)抗HCV抗體的“第二代”測(cè)定法(即以同時(shí)使用非結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)捕獲抗原為基礎(chǔ)的測(cè)定法)比第一代測(cè)定法有顯著進(jìn)步。然而，它們?nèi)匀蝗狈`敏性具體的，它們最多檢測(cè)95-98％的采自HCV感染患者的血清。因此，這種檢測(cè)還不能足夠早期地檢測(cè)，仍然會(huì)使感染的捐獻(xiàn)血液在輸血中不被注意地通過(guò)。實(shí)際上，為了降低輸血后的危險(xiǎn)，必須在感染之后在出現(xiàn)抗體之前盡可能早地檢測(cè)病毒本身的存在。感染與血清轉(zhuǎn)變(即抗體出現(xiàn))之間的階段被稱為“血清學(xué)窗口期”。
有多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)(Garson等人(1990)；Shieh等人(1991))提出，為了解決上述靈敏度和早期檢測(cè)問(wèn)題，可通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))檢測(cè)病毒RNA。該方法實(shí)際上可以極其靈敏地早期檢測(cè)HCV感染，也就是說(shuō)，只在接觸病毒幾天后，即循環(huán)抗病毒抗體增多之前4-8周即可檢測(cè)。目前，這是檢測(cè)生物液體中的病毒的參考方法。
然而，用于HCV的PCR方法也遇到許多困難。首先，它包括進(jìn)行RNA提取、純化，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的前期步驟，病毒材料的一部分在這些前期步驟中丟失。其次，它需要特殊、昂貴的擴(kuò)增設(shè)備。另外，它也不能同時(shí)處理大量樣品，并且常常產(chǎn)生污染。
目的在于早期檢測(cè)HCV感染的另外一種方法旨在檢測(cè)循環(huán)病毒抗原(衣殼)。這種抗原也在血清抗HCV抗體出現(xiàn)前幾周出現(xiàn)。Takahashi等人(1992)描述了一種ELISA技術(shù)，它利用一對(duì)抗體檢測(cè)衣殼抗原。
然而，這種抗原的檢測(cè)難以建立，這主要是因?yàn)檠褐锌蓹z測(cè)的抗原滴度低，以及可以獲得的免疫試劑的質(zhì)量問(wèn)題。
Hajime Tokita等人(2000)描述了一種使用一對(duì)單克隆抗體(5F11和5E3)的夾心型免疫測(cè)定法，在市場(chǎng)上被稱為“Immucheck F HCV Ag CoreKokusai”，它可獲得極其靈敏的檢測(cè)。該文章的作者強(qiáng)調(diào)，衣殼蛋白中的Thr49Pro突變可降低測(cè)定的靈敏度。Peterson等人(2000)也在研究早期檢測(cè)衣殼抗原，他們建立了一種ELISA技術(shù)，該技術(shù)不需要預(yù)處理樣品即可利用抗衣殼單克隆抗體檢測(cè)HCV的衣殼抗原。該文章通過(guò)比較三種獨(dú)立的測(cè)定法(PCR檢測(cè)HCV RNA，ELISA檢測(cè)抗HCV抗體和衣殼抗原)表明，能夠有效地檢測(cè)在感染早期血清陰性階段(即檢測(cè)到RNA約1天后)采集的血袋中的循環(huán)HCV衣殼抗原。
丙型肝炎病毒感染的早期檢測(cè)，以及在感染持續(xù)期間檢測(cè)血清轉(zhuǎn)變后抗體反應(yīng)的可能性，仍然是當(dāng)前的一個(gè)目標(biāo)，特別是對(duì)于輸血而言。
根據(jù)建立簡(jiǎn)單、靈敏、特異、可重復(fù)、經(jīng)濟(jì)、易于進(jìn)行并且能夠自動(dòng)化——旨在進(jìn)行大量篩選——的方法的觀點(diǎn)，最希望首先在血清學(xué)窗口期檢測(cè)HCV抗原，然后在血清轉(zhuǎn)變后追蹤患者的血清學(xué)進(jìn)化，聯(lián)合抗HCV抗體的檢測(cè)和HCV抗原的檢測(cè)。
然而，這就提出了一個(gè)重要問(wèn)題，即對(duì)于HCV抗原的測(cè)定，血清中存在的抗HCV抗體與標(biāo)記的抗HCV抗體之間的干擾問(wèn)題。因此，為了檢測(cè)一種指定抗體，向固相上引入一種靶抗原，而這種靶抗原與標(biāo)記抗體或用于同時(shí)夾心法檢測(cè)抗原的抗體可識(shí)別的抗原可能具有相同的表位，這將不可恢復(fù)地使標(biāo)記的一種或多種抗體與固相結(jié)合，因此使測(cè)定產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。
對(duì)于在同一固相上同時(shí)檢測(cè)抗HCV衣殼抗體和HCV衣殼抗原的系統(tǒng)，尤其如此。因此，為了檢測(cè)抗HCV衣殼抗體，衣殼抗原在固相上沉積，其中這種衣殼抗原與標(biāo)記的抗HCV衣殼抗體或用于檢測(cè)衣殼抗原的抗體可識(shí)別的抗原具有相同的表位，這將使標(biāo)記的一種或多種抗體與固相結(jié)合，使測(cè)定產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。
為了避免這種干擾的危險(xiǎn)，Chiron公司進(jìn)行了檢測(cè)患者的衣殼抗原以及只檢測(cè)抗NS3/NS4抗體的測(cè)定。為此，Chiron首先使用與固相附著的NS3/4a抗原來(lái)捕獲待測(cè)樣品中的抗HCV抗體，然后使用同樣為附著的單克隆抗HCV衣殼抗體(c11-3和c11-7)。在過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體存在下，利用與SOD(超氧化物歧化酶)融合的抗原檢測(cè)捕獲的抗體，而捕獲的抗原利用同樣以過(guò)氧化物酶標(biāo)記的另外一種單克隆抗體檢測(cè)(第七屆國(guó)際輸血學(xué)會(huì)歐洲會(huì)議(VII European Congress of theInternational Society of Blood Transfusion)巴黎，2001年7月15-18日)。
針對(duì)干擾問(wèn)題，專利申請(qǐng)EP 1 020 727(Advanced Life ScienceInstitute)提供了一種同時(shí)測(cè)定HCV衣殼抗原和抗HCV衣殼抗體的方法(一種“combo”型測(cè)定法)，其中該抗原被針對(duì)衣殼表位的抗體捕獲并標(biāo)記，其中這些衣殼表位與同時(shí)用來(lái)捕獲并顯示或檢測(cè)抗衣殼抗體的衣殼表位不同。它給出了一個(gè)代表性實(shí)施例，其中在通過(guò)夾心法檢測(cè)抗原、同時(shí)通過(guò)間接法檢測(cè)抗體的測(cè)定中，為了檢測(cè)抗原，使用針對(duì)HCV衣殼的氨基酸(AA)100-氨基酸130序列的表位的第一抗體(捕獲抗體)，和針對(duì)序列AA40-50的表位的第二抗體(檢測(cè)抗體)，為了檢測(cè)抗體，使用的捕獲抗原自身含有序列AA1-42和AA66-80。
然而，該方法不是沒(méi)有缺點(diǎn)，特別是它需要使用針對(duì)表位的抗體，而這些表位彼此相距較遠(yuǎn)，且實(shí)際上是次要的、相對(duì)非免疫原性的表位時(shí)。由于缺乏序列A43-65，也具有無(wú)法檢測(cè)針對(duì)該序列的抗體，因而靈敏性降低的缺點(diǎn)。
另外，它是通過(guò)衣殼蛋白的兩個(gè)區(qū)域捕獲衣殼抗原及捕獲抗衣殼抗體，這兩個(gè)區(qū)域明顯不同，即不重疊(AA 1-42和AA 66-80，用于檢測(cè)抗體，AA 100-130，用于檢測(cè)抗原)，這與本發(fā)明不同。
專利申請(qǐng)WO 01/96875 A2(Chiron)特別描述了一種同時(shí)檢測(cè)衣殼和抗NS3和抗NS4抗體的測(cè)定法(一種“不完全combo”，圖2)，它使用N-月桂酰肌氨酸作為去污劑。另一方面，它在圖8和第33頁(yè)非常概括地提到了一種“完全combo”測(cè)定法，即一種同時(shí)檢測(cè)衣殼抗原(通過(guò)夾心法)和抗HCV衣殼和抗HCV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體(通過(guò)雙抗原夾心法)的測(cè)定法。為了捕獲抗原，它使用可識(shí)別HCV衣殼N端大部分(AA 10-53)的兩種抗體c11-3和c11-7，為了檢測(cè)，它使用可識(shí)別HCV衣殼C端部分(AA 120-130)的第三抗體c11-14。為了檢測(cè)抗體，使用的捕獲抗原是含有多種表位的一種融合抗原(“MEFA 12”，見(jiàn)專利申請(qǐng)WO 01/96875的表2)，作為與超氧化物歧化酶、NS3、NS4和NS5抗原和幾種HCV株的一系列衣殼序列的融合含有突變R47L的AA 9-53、AA 64-88和AA67-84。序列AA 54-63和AA 54-66在這兩個(gè)系列的序列中缺失。
然而，專利申請(qǐng)WO 01/96875 A2的“完全combo”測(cè)定法的實(shí)際實(shí)施并沒(méi)有描述。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員不可能確切地肯定圖8的combo測(cè)定法是否能夠起作用，更不用說(shuō)它是否能夠解決所提出的問(wèn)題，即，盡可能早地檢測(cè)HCV感染。無(wú)論如何，在最好的情況下，專利申請(qǐng)WO 01/96875 A2的combo顯然也無(wú)法檢測(cè)針對(duì)丟失的序列AA 54-63和AA 54-66的所有抗體。結(jié)果是具有靈敏度降低的危險(xiǎn)。
專利申請(qǐng)EP 1 251 353 A2(Ortho-Clinical Diagnostics)描述了一種“完全combo”測(cè)定法，它使用相同的抗體檢測(cè)衣殼，但是沒(méi)有說(shuō)明它們的來(lái)源或它們的表位特異性。另外，它說(shuō)明使用的去污劑是BRIJ或MYRJ類型的去污劑，對(duì)于Ortho Clinical Diagnostics銷售的衣殼抗原檢測(cè)試劑盒的N-月桂酰肌氨酸來(lái)說(shuō)，這種去污劑是優(yōu)選的(參見(jiàn)實(shí)施例3)?？挂職た贵w使用一種(通過(guò)誘變)修飾的衣殼抗原檢測(cè)C22KSN47，48(與SOD融合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，含有缺失氨基酸47和48的衣殼序列AA 10-99)或C22KSR47L(與SOD融合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，含有衣殼序列AA 10-99，在位點(diǎn)47處以亮氨酸替換精氨酸)。
專利申請(qǐng)WO 03/002 749 A2(Abbott)描述了用于檢測(cè)HCV衣殼抗原的多種抗原和測(cè)定法。它描述的唯一的“完全combo”測(cè)定法——被稱為“真正的Combo”(

圖1，第59頁(yè))利用一種生物素化肽檢測(cè)抗衣殼抗體，該生物素化肽對(duì)應(yīng)于衣殼的氨基酸11-28，固定在固相中。為了檢測(cè)衣殼，它使用在固相中的來(lái)自Advanced Life Science Institute的抗體C11-14(識(shí)別衣殼序列AA 45-50)與吖啶標(biāo)記的C11-10(識(shí)別衣殼序列AA 32-36)的組合。因此，專利申請(qǐng)WO 03/002 749 A2通過(guò)兩個(gè)明顯不同的(即不重疊的)衣殼位點(diǎn)(AA 11-28，用于檢測(cè)抗體，AA45-50，用于檢測(cè)抗原)實(shí)現(xiàn)了衣殼抗原的捕獲和抗衣殼抗體的捕獲，這與本發(fā)明不同。
因此，為了解決所提出的問(wèn)題，本發(fā)明的作者努力發(fā)展了另外一種方法。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種同時(shí)檢測(cè)HCV抗原和患者針對(duì)該抗原的抗體的方法，該方法避免了這種干擾問(wèn)題，并且達(dá)到了與PCR接近的檢測(cè)靈敏度和早期檢測(cè)水平，同時(shí)，能夠在血清轉(zhuǎn)變后追蹤患者的血清學(xué)進(jìn)化。
本發(fā)明的作者通過(guò)人工結(jié)構(gòu)修飾使得用來(lái)捕獲抗體的靶抗原的某些表位不同，解決了這一問(wèn)題。這樣修飾的表位隨后被破壞。同時(shí)，選擇用來(lái)捕獲和/或檢測(cè)抗原的抗體，使得它們精確識(shí)別患者抗原上存在的未修飾的表位，因而它們不能結(jié)合不再顯示這些相同表位的修飾的抗原。由于這些表位不再相同，因此在用來(lái)捕獲和/或檢測(cè)HCV抗原的抗體與患者的抗體之間不再存在任何競(jìng)爭(zhēng)。與現(xiàn)有水平的一些技術(shù)不同，衣殼抗原和抗衣殼抗體的捕獲能夠在衣殼的單一的、相同的蛋白質(zhì)區(qū)域上發(fā)生，而且避免漏檢某些抗衣殼抗體，如下文所述。
由于已經(jīng)在衣殼的N端部分鑒定了多種表位，該蛋白質(zhì)區(qū)最適于獲得對(duì)衣殼抗原和抗衣殼抗體的極靈敏的檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明，能夠利用最具免疫反應(yīng)性的序列同時(shí)檢測(cè)抗體和抗原，從而提高檢測(cè)靈敏度。
當(dāng)然本發(fā)明不只限于丙型肝炎病毒(HCV)所致感染的檢測(cè)。也包括以下所述的用來(lái)檢測(cè)感染的方法、試劑和試劑盒和/或感染監(jiān)測(cè)的概括，這種感染可以是由任何種類的傳染性微生物(例如病毒，如引起不同類型的甲、乙、丙、丁或戊型肝炎的病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是引起人類(HIV-1、HIV-1之0組、HIV-2)或猴AIDS的逆轉(zhuǎn)錄病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV)，黃病毒，包括登革病毒，以及細(xì)菌、微生物寄生蟲(chóng)等)引起的，希望同時(shí)檢測(cè)其抗原和抗體。本發(fā)明在此用丙型肝炎病毒(HCV)更具體地描述，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的極廣泛的范圍。
定義此處的術(shù)語(yǔ)“丙型肝炎病毒”或“HCV”包括導(dǎo)致丙型肝炎的病毒的所有株和所有類型、亞型和基因型。本發(fā)明的方法實(shí)際上旨在檢測(cè)所有HCV感染，無(wú)論其來(lái)源和基因型如何。具體包括在歐洲、美國(guó)、日本等地流行的病毒的眾所周知的類型和亞型(即6種主要基因型1、2、3、4、5、6，及其亞型1a、1b、3a等)。參見(jiàn)Stuyver等人(1994)；Bukh(1995)。
術(shù)語(yǔ)“人類免疫缺陷病毒”或“HIV”是指導(dǎo)致人類AIDS的逆轉(zhuǎn)錄病毒的所有株和所有類型、亞型、群和基因型。術(shù)語(yǔ)HIV具體包括HIVs-1(HIV-1之M組，HIV-1之0組)和各種HIV-2及其變體。
在本發(fā)明的上下文中，“生物樣品”優(yōu)選地包括生物液體，如血液、血漿、血清、尿、腦脊液、唾液等。
術(shù)語(yǔ)“抗體”是指任何完整抗體或抗體的功能性片段，其含有或者由至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)組成，使得該抗體能夠結(jié)合抗原化合物的至少一個(gè)抗原決定簇。關(guān)于抗體片段的例子，可以提到Fab、Fa b’和F(ab’)2片段，以及scFv(單鏈可變片段)鏈、dsFv(雙鏈可變片段)鏈等。這些功能片段具體地能夠通過(guò)基因工程技術(shù)獲得。
在本發(fā)明中使用的單克隆抗體或單特異性多克隆血清通過(guò)常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生，其細(xì)節(jié)在下文給出。
術(shù)語(yǔ)“捕獲抗體”是指抗體或抗體的一部分，優(yōu)選地與固相結(jié)合的抗體或抗體的一部分，它通過(guò)親和力結(jié)合能夠滯留生物樣品中存在的微生物的抗原，例如HCV或HIV的抗原。
生物樣品中抗體和抗原的存在通過(guò)“檢測(cè)單元”顯示。關(guān)于抗原的檢測(cè)，本發(fā)明具體提供利用至少一種“檢測(cè)抗體”的檢測(cè)。這種標(biāo)記的檢測(cè)抗體能夠通過(guò)親和結(jié)合與捕獲的抗原結(jié)合，通過(guò)識(shí)別與捕獲抗體所識(shí)別的位點(diǎn)不同的表位位點(diǎn)或者由于衣殼中存在重復(fù)基序而相同的表位位點(diǎn)。關(guān)于抗體的檢測(cè)，具體地可以使用標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體，例如抗免疫球蛋白G。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”是指直接標(biāo)記(通過(guò)酶、放射性同位素、熒光染料、發(fā)光化合物等)和間接標(biāo)記(例如通過(guò)本身直接標(biāo)記的抗體，或者使用包含標(biāo)記的“親和對(duì)”的試劑，例如，但不是唯一地，標(biāo)記的抗生物素蛋白-生物素對(duì)，等等)。
術(shù)語(yǔ)“抗原性片段”是指一種傳染性微生物的天然或重組蛋白質(zhì)的全部或部分，如丙型肝炎病毒或HIV，其在感染的患者或免疫的動(dòng)物中能夠誘導(dǎo)抗體合成。具體而言，可以是衣殼蛋白的全部或部分，或者是HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白的全部或部分，特別是NS3和NS4，無(wú)論它們是否是通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的。也可以是HIV的gag基因編碼的蛋白質(zhì)的全部或部分，特別是P25(HIV-1)或P26(HIV-2)，或者是包膜基因編碼的蛋白質(zhì)的全部或部分，特別是gp41(HIV-1)或gp36(HIV-2)。
術(shù)語(yǔ)“捕獲抗原”是指一種分離的抗原片段，其優(yōu)選地與固相結(jié)合，它能夠被針對(duì)微生物的抗體(如抗HCV抗體或抗HIV抗體)識(shí)別，并且能夠與后者親和結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)抗原”是指一種標(biāo)記且修飾類似捕獲抗原的抗原(即含有至少一個(gè)已經(jīng)破壞的表位位點(diǎn)或表位)。它使得能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)捕獲的抗原，或者通過(guò)常規(guī)抗原-抗體-抗原夾心法(也被稱為“雙抗原夾心”法(Maiolini等人(1978))檢測(cè)抗體。
根據(jù)本發(fā)明，具體地在通過(guò)抗原-抗體-抗原夾心法的抗體檢測(cè)中，捕獲抗原和/或任選地使用的檢測(cè)抗原含有至少一個(gè)已經(jīng)破壞的表位位點(diǎn)或表位?！氨砦晃稽c(diǎn)”或“表位”是可被抗體識(shí)別的氨基酸序列，可使其特異性結(jié)合。
對(duì)于HCV蛋白，已經(jīng)鑒定了衣殼蛋白的幾種表位。具體知道位于氨基酸16與氨基酸40之間以及位于氨基酸44與氨基酸47之間的表位。例如，也可以參考文章或公開(kāi)內(nèi)容Okamoto等人(1990)；Nasoff等人(1991)；Leahy等人(1991)；Takahashi等人(1992)；Sllberg等人(1992)；和Ishida(1993)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的多種表位。在NS3蛋白上，已知位于氨基酸1188與氨基酸1493之間的表位(Yang等人(1995))和位于氨基酸1175與氨基酸1334之間的表位(Yang等人(1999))和位于氨基酸1460與氨基酸1532之間的表位(Clayes等人(1995))。
最眾所周知的NS4表位之一，表位5-1-1(AA 1689-1706)，在Cerino等人(1991)中提及。
對(duì)于HIV，現(xiàn)有技術(shù)中也描述了幾種表位。具體包括HIV-1(M組)P25蛋白位于氨基酸293與350之間的表位，以及Gnann等人(1987)描述的gp41的優(yōu)勢(shì)免疫表位，或該序列的變體；還包括P26蛋白的表位，特別是例如帶有與上述HIV-1 P25的表位序列同源的序列之表位，或者HIV-2 gp36的表位，特別是Gnann等人(1987)描述的gp36的優(yōu)勢(shì)免疫表位，或該序列的變體。
“已經(jīng)破壞的”表位位點(diǎn)或表位的表述是指該表位位點(diǎn)或表位在其(一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和/或四級(jí))結(jié)構(gòu)內(nèi)修飾，以致含有這種破壞的表位的捕獲抗原或檢測(cè)抗原可能無(wú)法同時(shí)結(jié)合針對(duì)所檢測(cè)的抗原的捕獲抗體和/或檢測(cè)抗體，但同時(shí)能夠結(jié)合生物樣品中可能存在的針對(duì)該微生物的抗體，如抗HCV或抗HIV抗體，其是通過(guò)識(shí)別保持完整的其它一些表位位點(diǎn)。因此，選擇捕獲和/或檢測(cè)抗體，以特異性識(shí)別生物樣品中存在的抗原上的所述目標(biāo)表位，這些表位是“完整”形式，即“未破壞的”或“天然的”形式。在本發(fā)明的上下文中，這種完整形式的表位也被稱為與破壞的表位“同源的”表位。
當(dāng)指抗體與抗原特異識(shí)別或結(jié)合時(shí)，術(shù)語(yǔ)“特異地”是指該抗體與該抗原相互作用，而與其它抗原沒(méi)有任何實(shí)質(zhì)的相互作用，或者，如果是一種表位的“特異”識(shí)別問(wèn)題，是指實(shí)際上排他性地識(shí)別該表位。大于108L.mol-1的結(jié)合常數(shù)是優(yōu)選的。
捕獲與檢測(cè)抗體本發(fā)明中使用的抗體是抗原特異的抗體，因此，是單克隆抗體或單特異性多克隆抗體，也就是說(shuō)，它們只特異性識(shí)別一種表位。
單克隆抗體能夠根據(jù)Khler和Milstein(1975)描述的常規(guī)淋巴細(xì)胞融合和雜交瘤培養(yǎng)方法獲得。制備單克隆抗體的其它方法也是公知的(Harlow等人(1988))。單克隆抗體的制備可包括免疫一種哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔乃至人等)，利用淋巴細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤(Khler和Milstein，(1975))。
這種常用技術(shù)也有備選的技術(shù)。例如，通過(guò)表達(dá)用雜交瘤克隆的一種核酸，能夠產(chǎn)生單克隆抗體。也能夠用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)抗體，方法是將抗體cDNA導(dǎo)入載體內(nèi)，一般是絲狀噬菌體(例如，對(duì)于大腸桿菌是fUSE5，Scott等人(1990))。后者組成文庫(kù)，在其表面展示scFv片段。Marks等人(1991)描述了構(gòu)建這些抗體文庫(kù)的方案。
多克隆抗體能夠按照常用程序，從針對(duì)一種抗原免疫的動(dòng)物的血清中獲得，這種抗原實(shí)際上是肽。
通常，多肽，特別是重組多肽，或者寡肽，例如可以用作免疫原。根據(jù)一種常規(guī)方案，按照Benoit等人(1982)所述的程序，用1mg當(dāng)量的肽免疫原免疫兔子。以4周的間隔，給動(dòng)物注射200μg抗原，10-14天后采血。在第三次注射后，評(píng)價(jià)抗血清與利用氯胺-T法制備的碘放射性標(biāo)記的抗原肽結(jié)合的能力。然后用羧甲基纖維素(CMC)組成的離子交換柱通過(guò)層析純化。然后利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如使用DEAE Sephadex獲得IgG級(jí)分，將洗脫收集的抗體分子調(diào)節(jié)為希望的濃度。
為了提高多克隆血清的特異性，能夠利用用于免疫的固定于固相中的肽(如HCV的衣殼肽AA 16-44和AA 39-74，作為非限制性實(shí)例)，通過(guò)免疫親和層析(或免疫吸附層析)純化這些抗體?？寡迮c這種固定于固相中的肽接觸足夠長(zhǎng)的一段時(shí)間，以使該肽與抗體分子免疫反應(yīng)，從而在固相中形成一種免疫復(fù)合物。
更具體而言，本發(fā)明人使用以下表1所示的特異性抗HCV抗體。
表1
對(duì)于檢測(cè)HIV的Combo測(cè)定法，使用的抗體優(yōu)選地是一種單克隆抗體，它可識(shí)別下列多肽序列之一或變異HIV株的相應(yīng)序列-HIV-1 M組的P25蛋白的表位，序列為308QASQEVKNWMTETLL322(SEQ ID No.24)；-P26蛋白的表位，特別是與序列號(hào)SEQ ID No.24所示HIV-1 P25的表位同源的序列的表位，例如含有序列QTDPAVKNWMTQTLL(SEQ ID No.25)的一種表位(HIV-2分離株ROD)。
當(dāng)然，生產(chǎn)或獲得具有與上述抗體相似或相同的表位特異性的單克隆抗體也在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握范圍之內(nèi)，它們適于實(shí)施本發(fā)明。
捕獲和/或檢測(cè)抗原本發(fā)明中使用的捕獲抗原和/或檢測(cè)抗原含有至少一個(gè)已經(jīng)破壞的表位位點(diǎn)。當(dāng)使用與捕獲抗原和/或檢測(cè)抗原都有相互作用危險(xiǎn)的兩種不同抗體時(shí)，抗原上至少兩個(gè)位點(diǎn)的破壞可能是必需的。例如，對(duì)于使用與捕獲抗原固定于同一表面的捕獲抗體和檢測(cè)抗體的夾心型免疫測(cè)定，同樣如此。然后選擇捕獲抗體，使其可特異性識(shí)別患者的天然抗原上的一個(gè)表位，該表位與捕獲抗原上兩個(gè)破壞的表位之一同源，同時(shí)選擇檢測(cè)抗體，使其可特異性識(shí)別患者的天然抗原上的一個(gè)表位，該表位與捕獲抗原上兩個(gè)破壞的表位中的另一個(gè)同源。
捕獲抗原和/或檢測(cè)抗原可以含有或者由一種肽組成，這種肽模擬來(lái)自于微生物，特別是HCV或HIV的抗原蛋白質(zhì)之表位的全部或部分。
優(yōu)選地是衣殼蛋白的一種肽，檢測(cè)抗衣殼抗體特別有利，特別是對(duì)于慢性肝炎，在這種情況下只可見(jiàn)極少的抗原，可見(jiàn)較多的循環(huán)抗衣殼抗體。也可以是一種非結(jié)構(gòu)蛋白的肽，如NS3和/或NS4。不同的捕獲或檢測(cè)抗原也能夠組合在一起。該實(shí)施方案使用幾種不同的捕獲和/或檢測(cè)抗原，例如能夠同時(shí)檢測(cè)抗衣殼抗體和針對(duì)HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和/或NS4的抗體。同時(shí)檢測(cè)抗衣殼抗體和抗NS3抗體是特別優(yōu)選的。本發(fā)明也包括同時(shí)檢測(cè)衣殼抗原、抗衣殼抗體、針對(duì)E1和/或E2包膜結(jié)構(gòu)蛋白的抗體、E1和/或E2包膜抗原，和/或針對(duì)HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和/或NS4的抗體。能夠想象的其它一些組合也是本發(fā)明的一部分。
同樣，同時(shí)檢測(cè)gag抗原、抗gag抗體和/或針對(duì)AIDS病毒(HIV-1、HIV-2等)包膜的抗體也是本發(fā)明的一部分，其序列已經(jīng)在Wain-Hobson等人(1985)；Ratner等人(1985)；Sanchez-Pescador等人(1985)；Guyader等人(1987)的文章中公布。優(yōu)選地，將要檢測(cè)的gag抗原是HIV-1 P25蛋白或HIV-2 P26，所述抗gag抗體針對(duì)這些蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，用于檢測(cè)針對(duì)HIV-1和HIV-2包膜的抗體之包膜抗原是HIV-1gp41和HIV-2 gp36。
類似地，Alcon等人(2002)描述的NS1抗原的檢測(cè)，抗NS1抗體的同時(shí)檢測(cè)，以及抗登革病毒NS2、NS3和/或S4抗體的檢測(cè)，也是本發(fā)明的一部分。
使用的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
優(yōu)選地，由于更加實(shí)用的原因，捕獲和/或檢測(cè)抗原是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)的合成肽。例如，可以提到Merrifield型的合成，由于純度、抗原特異性和沒(méi)有不希望的副產(chǎn)物以及易于使用等原因，它是有利的(Merrifield，(1963)；R.C.Sheppard(1971)；Atherton等人(1989))。可以使用來(lái)自Millipore的“9050 Plus Pep合成儀”、來(lái)自Perseptive的“Pioneer”合成儀、來(lái)自ABI的“433A”合成儀(Applied Biosystems Inc.)或來(lái)自Rainin的“Symphony”合成儀作為自動(dòng)合成儀。也能夠通過(guò)均相合成獲得這些肽。
這些捕獲和/或檢測(cè)抗原上表位的破壞能夠用多種方法進(jìn)行。表位位點(diǎn)的這種修飾需要的唯一條件是，捕獲和/或檢測(cè)抗原可能不結(jié)合捕獲抗體和/或檢測(cè)抗體，但是同時(shí)基本上保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗微生物抗體(具體而言，是抗HCV或抗HIV抗體)的能力。
在每個(gè)靶向表位位點(diǎn)中，至少一種氨基酸，優(yōu)選地兩種氨基酸的修飾可能足以破壞該表位，而不會(huì)去穩(wěn)定化未修飾的其它表位。具體而言，這種修飾可以通過(guò)氨基酸置換實(shí)現(xiàn)，例如用甘氨酸或丙氨酸殘基置換非甘氨酸殘基，或者用一類氨基酸置換另一類氨基酸。例如，能夠用含有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸)置換含有極性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)，反之亦然。也能夠用含有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸或谷氨酸)置換含有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)，反之亦然，或者用含有線性側(cè)鏈的氨基酸置換側(cè)鏈含有環(huán)的氨基酸(例如酪氨酸或苯丙氨酸)，反之亦然。表位中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入，特別是對(duì)于非天然氨基酸，也能夠破壞該表位。氨基酸的官能團(tuán)，即具體地OH、NH2或SH基的修飾也是可能的。
在本發(fā)明上下文使用的肽中，能夠設(shè)想來(lái)源于所有種類的傳染性微生物(例如病毒，如引起不同類型的甲、乙、丙、丁或戊型肝炎的病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是引起AIDS的逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV-1、HIV-2等)、CMV病毒、登革病毒，以及細(xì)菌、微生物寄生蟲(chóng)等)的肽，希望同時(shí)檢測(cè)其抗原和抗體。
具體而言，通過(guò)非限制性的說(shuō)明，具體可以提到HCV衣殼肽，更具體而言，是氨基酸1-75、6-68和1-53的肽。這些序列對(duì)應(yīng)于基因型1(亞型1a、1b、1c)的共有序列，在附后的序列表中列出，分別被稱為SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3SEQ ID No.11MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YL36LPRRGPRL44GVR47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75SEQ ID No.26KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YL36LPRRGPRL44GVR47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKA68SEQ ID No.31MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YL36LPRRGPRL44GVR47ATRKTS53同樣，在本發(fā)明上下文中使用的肽或多肽是HIV的gag多肽或包膜多肽。
具體而言，是對(duì)應(yīng)于HIV-1 P25蛋白的共有序列的一種肽，其序列在附后的序列表中被稱為序列號(hào)SEQ ID No.23。
SEQ ID No.23293FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350也可以是含有HIV-1 gp41的表位的一種肽，具體的是序列SEQ IDNo.26到SEQ ID No.31的一種肽SEQ ID No.26LGLWGCSGKLIC，SEQ ID No.27LGIWGCSGKLIC，SEQ ID No.28LGLWGCSGKHIC，SEQ ID No.29LGMWGCSGKHICSEQ ID No.30RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICSEQ ID No.31RILAVERYLKDQQLLGIWGSGKLICTTAVPWNAS.
HIV-2的gag多肽或包膜多肽作為捕獲和/或檢測(cè)抗原的用途也是本發(fā)明的一部分。具體的是gp36的多肽，其序列為如下的SEQ ID No.32或SEQ ID No.33SEQ ID No.32LNSWGCAFRQVC，SEQ ID No.33RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDS.
也可以是HIV-2的P26的一種多肽，例如與序列號(hào)SEQ ID No.23所示P25蛋白的多肽序列同源的一種多肽。
用作捕獲和/或檢測(cè)抗原之修飾的肽或多肽也是本發(fā)明的一部分。具體地可以是攜帶至少一個(gè)修飾的表位位點(diǎn)的衣殼肽片段。因此本發(fā)明的一個(gè)主題是來(lái)源于HCV衣殼蛋白的一種肽或多肽，其攜帶至少一個(gè)完整的表位位點(diǎn)和至少一個(gè)破壞的表位位點(diǎn)，所述破壞的表位位點(diǎn)不能被抗衣殼抗體識(shí)別。優(yōu)選的肽具體地在氨基酸20-40組成的部分中和在氨基酸44-47組成的部分中顯示2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)氨基酸的置換。下列突變是特別有利的和優(yōu)選的-氨基酸34、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.4，被稱為“Cap 1-75(G34-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.4Cap 1-75(G34-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-氨基酸31、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.5，被稱為“Cap 1-75(G31-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.5Cap 1-75(G31-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIG31GGV34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-氨基酸36、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.6，被稱為“Cap 1-75(G36-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.6Cap 1-75(G36-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YG36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-氨基酸34、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.7，被稱為“Cap 6-68(G34-G44-G47)”的序列)SEQ ID No.7Cap 6-68(G34-G44-G47)6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKA68-氨基酸31、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.8，被稱為“Cap 6-68(G31-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.8Cap 6-68(G31-G44-G47)6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIG31GGV34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKA68-氨基酸36、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.9，被稱為“Cap 6-68(G36-G44-G47)”的序列)SEQ ID No.9Cap 6-68(G36-G44-G47)6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YG36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-氨基酸34、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.10，被稱為“Cap 1-53(G34-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.10Cap 1-53(G34-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTS53-氨基酸31、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.11，被稱為“Cap 1-53(G31-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.11Cap 1-53(G31-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIG31GGV34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTS53-氨基酸36、44和47被置換為甘氨酸殘基(序列SEQ ID No.12，被稱為“Cap 1-53(G36-G44-G47)”的肽)SEQ ID No.12Cap 1-53(G36-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YG36LPRRGPRG44GVG47ATRKTS53-氨基酸45和46的缺失SEQ ID No.13Cap 1-75(G34-del(45-46))1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRL44--R47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-骨架長(zhǎng)度的修飾SEQ ID No.14Cap 1-75(G34-βA45)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRL44βA45VR47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75其中βA代表β-丙氨酸-通過(guò)氨基酸插入和突變，骨架長(zhǎng)度的修飾SEQ ID No.15Cap 1-75(G34-G46-G46’)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRL44G45G46G46′R47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-極性轉(zhuǎn)化SEQ ID No.16Cap 1-75(nL29-G30-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGnL29G30V31GGV34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75其中nL代表正亮氨酸-氨基酸置換SEQ ID No.17Cap 1-75(G34-F35-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34F35L36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75-氨基酸置換SEQ ID No.18Cap 1-75(G34-hS35-G44-G47)
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34hS35L36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75其中hS代表高絲氨酸。
本發(fā)明也涉及來(lái)源于HIV的gag蛋白的一種肽或多肽，其攜帶至少一個(gè)完整的表位位點(diǎn)和至少一個(gè)破壞的表位位點(diǎn)，所述破壞的表位位點(diǎn)不能被針對(duì)相同gag蛋白的抗體識(shí)別。更具體而言，該多肽含有HIV-1P25蛋白的一種共有序列，具體地在氨基酸293-322組成的部分中可能顯示1、2、3、4或5個(gè)氨基酸的置換。優(yōu)選地，這種修飾的多肽含有HIV-1(M)P25蛋白的共有序列，其中氨基酸295、298、310和312被置換為甘氨酸殘基，氨基酸316被置換為苯丙氨酸殘基293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350(SEQ ID No.22)當(dāng)使用這些肽序列時(shí)，為了使其能夠更容易地與支持體或任何目的分子結(jié)合，在N端位點(diǎn)添加氨基酸C-G-G-(即Cys-Gly-Gly-)可能是有利的。就此而言，肽C-G-G-Cap 1-75(G34-G44-G47)是特別有利的。
檢測(cè)方法本發(fā)明一般提供一種體外檢測(cè)生物樣品中微生物感染的方法，包括同時(shí)檢測(cè)生物樣品中存在的該微生物的一種抗原和針對(duì)該微生物的一種抗體，該方法包括a)使生物樣品接觸一種針對(duì)該微生物的捕獲抗體，和來(lái)源于該微生物的一種捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物，任選地使用至少一種標(biāo)記的檢測(cè)抗體，和/或任選地一種標(biāo)記的檢測(cè)抗原，該檢測(cè)抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的該微生物的抗原，該檢測(cè)抗原能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的針對(duì)該微生物的抗體；其中該微生物的捕獲抗原包含(或者是)該微生物的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位已經(jīng)被破壞；該捕獲和/或檢測(cè)抗體可識(shí)別已經(jīng)被捕獲的抗原的這個(gè)完整表位。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法不只限于使用一個(gè)抗體/抗原對(duì)。也可以用幾種不同的捕獲抗體和幾種不同的捕獲抗原進(jìn)行。
具體而言，本發(fā)明因此提供一種體外檢測(cè)生物樣品中丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括同時(shí)檢測(cè)生物樣品中存在的HCV抗原和針對(duì)該HCV抗原的抗HCV抗體，該方法包括a)使生物樣品接觸抗HCV捕獲抗體和HCV捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物，任選地使用標(biāo)記的檢測(cè)抗體，和/或任選地標(biāo)記的檢測(cè)抗原，該檢測(cè)抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的HCV抗原，該檢測(cè)抗原能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的抗HCV抗體；其中該HCV捕獲抗原包含(或者是)HCV的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位被破壞；該捕獲和/或檢測(cè)抗體可識(shí)別已經(jīng)捕獲的抗原的這個(gè)完整表位。
本發(fā)明也提供一種體外檢測(cè)生物樣品中人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，包括同時(shí)檢測(cè)生物樣品中存在的HIV抗原和針對(duì)該HIV抗原的抗HIV抗體，該方法包括a)使生物樣品接觸抗HIV捕獲抗體和HIV捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物，任選地使用標(biāo)記的檢測(cè)抗體，和/或任選地標(biāo)記的檢測(cè)抗原，該檢測(cè)抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的HIV抗原，該檢測(cè)抗原能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的抗HIV抗體；其中該HIV捕獲抗原包含或者是HIV的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位被破壞；該捕獲和/或檢測(cè)抗體可識(shí)別已經(jīng)捕獲的抗原的這個(gè)完整表位。
優(yōu)選地，該方法允許檢測(cè)HIV-1，檢測(cè)HIV-2，或同時(shí)檢測(cè)HIV-1或HIV-2。因此，根據(jù)另外一種考慮，使用的HIV捕獲抗原可包含(或者分別可能是)HIV-1捕獲抗原、HIV-2捕獲抗原以及HIV-1和HIV-2捕獲抗原，或HIV-1捕獲抗原和HIV-2捕獲抗原的組合。
生物樣品任選地可以在前期步驟中處理，或者在促使待測(cè)抗原暴露的條件下接觸捕獲抗原和捕獲抗體。有利的是，在檢測(cè)前，優(yōu)選地在接觸使用的抗體前，用變性劑處理該樣品。對(duì)于HCV衣殼的檢測(cè)，或者HIVgag蛋白的檢測(cè)，這種變性劑具體地可能包含一種或多種非離子型去污劑，例如Nonidet P-40(NP40)(叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，也被稱為IGEPAL CA630)，或者酸溶液。
這種組合免疫測(cè)定可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種形式進(jìn)行固相或均相；一步或兩步；雙夾心法(對(duì)于兩種抗原和抗體檢測(cè)的夾心法)；或與夾心法(用于抗原檢測(cè))組合的間接法(用于抗體檢測(cè))，作為非限制性實(shí)例。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，捕獲抗體和捕獲抗原固定于固相上。作為固相的非限制性實(shí)例，可以使用微孔板，特別是聚苯乙烯微孔板，如丹麥Nunc公司所售。也可以使用固體顆?；蛑椋豁槾胖?，如Dynal或Merck-Eurolab(法國(guó))所售(商標(biāo)為EstaporTM)，或者由聚苯乙烯或聚丙烯制成的試管等。
為了檢測(cè)生物樣品中存在的抗原，兩種抗體(捕獲和檢測(cè)抗體)夾心類型的免疫測(cè)定形式是特別有利的，而抗體能夠用一種捕獲抗原和與該抗體連接的一種標(biāo)記的偶聯(lián)物顯示(根據(jù)通常稱為“間接形式”的形式)，例如標(biāo)記的蛋白A或標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體。這些抗體也能夠用一種捕獲抗原和與該抗體連接的一種標(biāo)記的抗原方便地檢測(cè)(根據(jù)被稱為“抗原-抗體-抗原夾心法”或“雙抗原夾心法”的形式)。
通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原的免疫測(cè)定形式也是可能的。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠設(shè)想并且公知其它一些免疫測(cè)定形式。
根據(jù)本發(fā)明，通常選擇捕獲抗體和檢測(cè)抗體(特別是夾心法使用的)，使得它們可識(shí)別生物樣品中存在的待檢測(cè)的天然靶抗原，作為與捕獲抗原上破壞的表位同源的一種完整表位，并且使得它們不能識(shí)別捕獲抗原上的破壞的表位。
根據(jù)本發(fā)明，同時(shí)檢測(cè)一種微生物的抗原和針對(duì)該微生物的抗體，特別是同時(shí)檢測(cè)HCV抗原和抗HCV抗體，或HIV抗原或抗HIV抗體，可以在一步中進(jìn)行，即使生物樣品同時(shí)接觸檢測(cè)單元(具體而言，例如一種或多種檢測(cè)抗體)和捕獲抗體和捕獲抗原。在此情況下，用于檢測(cè)抗原的免疫測(cè)定和用于檢測(cè)抗體的免疫測(cè)定都優(yōu)選地通過(guò)夾心法進(jìn)行。此外，檢測(cè)單元，具體而言例如一種或多種檢測(cè)抗體，能夠在第二步加入混合物中，即在第一種抗原-抗體復(fù)合物形成后。于是被描述為兩步測(cè)定法。
如上所述，捕獲抗原具體地可以是HCV衣殼的一種抗原性片段，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。該捕獲抗原也可含有HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性片段，具體地但并非唯一地是NS3或NS4，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。最后，該捕獲抗原也可含有衣殼蛋白的抗原性片段(其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞)與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性片段NS3或NS4(其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)也已經(jīng)被破壞)的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)想的任何一種變體都是本發(fā)明的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，檢測(cè)生物樣品中丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法包括a)使該樣品接觸與固相結(jié)合的HCV捕獲抗體和HCV捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)分離固相與液相；d)使固相接觸一種標(biāo)記的檢測(cè)抗體和一種或多種標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體，前一種抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的HCV抗原，后一種抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的抗HCV抗體，用于捕獲抗HCV抗體的抗原包含(或者是)HCV衣殼蛋白的抗原性片段，其中有兩個(gè)表位已經(jīng)被破壞，該捕獲和檢測(cè)抗體都可識(shí)別已經(jīng)被捕獲的衣殼抗原的這些完整表位之一。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法可以檢測(cè)HIV感染，如HIV-1或HIV-2感染。優(yōu)選地，該方法包含來(lái)源于HIV-1的捕獲抗原和來(lái)源于HIV-2的捕獲抗原，以便能夠檢測(cè)抗HIV-1和抗HIV-2抗體。根據(jù)這一優(yōu)選模式，能夠使用根據(jù)本發(fā)明的方法沒(méi)有區(qū)別地檢測(cè)HIV-1和/或HIV-2感染。
該捕獲抗原含有HIV的gag蛋白(例如HIV-1 P25蛋白或HIV-2 P26)的至少一個(gè)抗原性片段，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。該捕獲抗原也可含有HIV的包膜蛋白(具體地但不是唯一地，HIV-1 gp41或HIV-2gp36)的抗原性片段。最后，該捕獲抗原可以由HIV-1和HIV-2的gag蛋白的抗原性片段(適當(dāng)時(shí)添加的與HIV-1包膜蛋白和HIV-2包膜蛋白的抗原性片段)的組合構(gòu)成。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)想的任何變體都是本發(fā)明的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，檢測(cè)生物樣品中人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法包括a)使該樣品接觸與固相結(jié)合的HIV捕獲抗體和HIV捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)分離固相與液相；d)使固相接觸一種標(biāo)記的檢測(cè)抗體和一種或多種標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體，前一種抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的HIV抗原，后一種抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的抗HIV抗體；用于捕獲抗HIV抗體的抗原包含(或者是)HIV的gag蛋白的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位已經(jīng)被破壞，該捕獲和檢測(cè)抗體都可以識(shí)別已經(jīng)被捕獲的gag抗原的這些完整表位之一。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法旨在檢測(cè)HIV-1或HIV-2的感染，或者HIV-1和HIV-2的感染。根據(jù)后一種選擇，用于捕獲抗HIV抗體的抗原是HIV-1 gag蛋白的片段與HIV-2 gag蛋白的片段的組合。
ELISA測(cè)定、放射免疫測(cè)定或其它任何一種檢測(cè)技術(shù)，都能夠用來(lái)顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物的存在。能夠利用相同類型或幾種類型的標(biāo)記物首先檢測(cè)傳染性微生物抗原，具體的是HCV或HIV抗原，其次檢測(cè)針對(duì)該傳染性微生物的抗體，具體的是抗HCV或抗HIV抗體。
檢測(cè)生物樣品中是否存在抗原或抗體能夠根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)定量完成，例如通過(guò)測(cè)定標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)(顏色、發(fā)光、放射性等)。
試劑盒能夠提供根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)生物樣品中微生物(如丙型肝炎病毒(HCV)或人類免疫缺陷病毒(HIV))感染的試劑盒和試劑，以使本發(fā)明能夠以適合多種生物樣品的方式容易地實(shí)施。
因此本發(fā)明的一個(gè)主題是用于檢測(cè)生物樣品中微生物感染的一種試劑盒，其包含-捕獲或檢測(cè)抗原，其含有(或者是)一種微生物蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的針對(duì)該微生物的抗體的能力；-抗體，其針對(duì)該微生物的該蛋白質(zhì)的這個(gè)完整表位。
本發(fā)明的另一個(gè)具體主題是用于檢測(cè)生物樣品中丙型肝炎病毒(HCV)感染的一種試劑盒，其包含-捕獲或檢測(cè)抗體，其含有(或者是)HCV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HCV抗體的能力；-針對(duì)該HCV蛋白質(zhì)的這個(gè)完整表位的抗體，它優(yōu)選地是用于捕獲生物樣品中存在的該HCV抗原的一種抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)具體主題是用于檢測(cè)生物樣品中人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的一種試劑盒，其包含-捕獲或檢測(cè)抗體，其含有(或者是)HIV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HIV抗體的能力；-針對(duì)該HIV蛋白質(zhì)的這個(gè)完整表位的抗體，它優(yōu)選地是用于捕獲生物樣品中存在的該HIV抗原的一種抗體。
有利地，該試劑盒可以含有幾種捕獲抗原和幾種捕獲抗體。
如上所述，捕獲抗體和捕獲抗原可以方便地是固定于固相(如微孔板)上的形式。
一種優(yōu)選的試劑盒含有
a)捕獲抗原，其含有(或者是)HCV的蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少兩個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HCV抗體的能力；b)捕獲抗體，其針對(duì)該HCV蛋白質(zhì)的所述完整表位之一；該捕獲抗原和該捕獲抗體固定于固相上；c1)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其針對(duì)該HCV蛋白質(zhì)的所述完整表位中的另外一個(gè)；和/或c2)任選地標(biāo)記的檢測(cè)抗原，其含有(或者是)HCV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少兩個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HCV抗體的能力；同樣優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的一種試劑盒含有a)捕獲抗原，其含有(或者是)HIV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HIV抗體的能力；b)捕獲抗體，其針對(duì)該HIV蛋白質(zhì)的所述完整表位之一；該捕獲抗原和該捕獲抗體固定于固相上；c1)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其針對(duì)該HIV蛋白質(zhì)的所述完整表位中的另外一個(gè)；和/或c2)任選地標(biāo)記的檢測(cè)抗原，其含有(或者是)HIV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HIV抗體的能力；該試劑盒還可含有一種檢測(cè)生物樣品中存在的該抗體并與該捕獲抗原形成復(fù)合物的單元，例如一種標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體，或一種檢測(cè)抗原。該檢測(cè)抗原優(yōu)選地是例如HCV或HIV蛋白質(zhì)的抗原性片段，其含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗體(抗HCV或抗HIV抗體)的能力。
該試劑盒也可含有去污劑，更具體而言，非離子型去污劑，如NP40(Sigma)，或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何相當(dāng)?shù)姆请x子型去污劑。
如上所述，該捕獲抗原，如檢測(cè)抗原，具體地可以是HCV衣殼蛋白的片段，其中至少一個(gè)表位已經(jīng)被破壞，于是選擇捕獲和/或檢測(cè)抗體，以識(shí)別該衣殼蛋白的這種完整的表位位點(diǎn)。
具體而言，本發(fā)明的一個(gè)主題是包含或者由下列成分組成的一組試劑HCV的衣殼肽，它在至少兩個(gè)不同的表位位點(diǎn)處突變，如肽1-75(G34-G44-G47)，和不能識(shí)別肽1-75(G34-G44-G47)的一對(duì)抗體，盡管它們可以識(shí)別相應(yīng)的天然HCV序列。
當(dāng)檢測(cè)的微生物是HIV時(shí)，該捕獲抗原，類似檢測(cè)抗原，具體地可以是HIV gag蛋白的片段，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞，于是選擇捕獲和/或檢測(cè)抗體，以gag蛋白的這種完整的表位位點(diǎn)。
具體而言，本發(fā)明的一個(gè)主題是包含或者由下列成分組成的一組試劑P25蛋白的肽，它在至少一個(gè)不同的表位位點(diǎn)處突變，如序列SEQ IDNo.22的肽，和不能識(shí)別序列SEQ ID No.22的肽的一對(duì)抗體，盡管它們可以識(shí)別HIV-1 P25蛋白的天然序列。
下列附圖和實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明，而非限制其范圍。
圖例圖1是一張圖示，說(shuō)明如在本發(fā)明之前使用的類型的一種檢測(cè)方法，它用與固相結(jié)合的捕獲抗體和未修飾的捕獲抗原進(jìn)行檢測(cè)。該圖示說(shuō)明患者抗體與檢測(cè)抗體在結(jié)合捕獲抗原方面的競(jìng)爭(zhēng)。
圖2，通過(guò)比較，是說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的圖示。由于捕獲抗原突變，它不再能夠被檢測(cè)抗體識(shí)別。因此抗體檢測(cè)與抗原檢測(cè)之間不再存在任何干擾。
實(shí)施例丙型肝炎病毒感染的檢測(cè)方案1a和1b使用的材料抗衣殼單克隆抗體-過(guò)氧化物酶(“mAb-POD”)偶聯(lián)物用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 2(見(jiàn)表1)的偶聯(lián)物按照專利申請(qǐng)EP 0752 102所述的方法制備。該過(guò)氧化物酶標(biāo)記的mAb2抗體偶聯(lián)物用第一步(下文所述)的稀釋劑稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度(例如，大于1.5單位)。
也使用另外一種抗衣殼單克隆抗體mAb 1(見(jiàn)表1)，固定于固相上(見(jiàn)下文)。
方案1c使用的材料抗衣殼單克隆抗體-過(guò)氧化物酶(“mAb-POD”)偶聯(lián)物用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 1(見(jiàn)表1)的偶聯(lián)物按照專利申請(qǐng)EP 0752 102所述的方法制備。該過(guò)氧化物酶標(biāo)記的mAb1抗體偶聯(lián)物用第一步(下文所述)的稀釋劑稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度(例如，大于1.5單位)。
也使用另外一種抗衣殼單克隆抗體，抗衣殼單克隆抗體mAb 3(見(jiàn)表1)，固定于固相上(見(jiàn)下文)。
方案1d的材料1)抗衣殼單克隆抗體生物素偶聯(lián)物用生物素標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 5(見(jiàn)表1)的偶聯(lián)物按照Greg T.Hermanson于1996所述的方案制備。該生物素標(biāo)記的mAb5抗體用第一步(下文所述)的稀釋劑稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度(例如，大于1.5單位)。
也使用另外一種抗衣殼單克隆抗體，抗衣殼單克隆抗體mAb 1(見(jiàn)表1)，固定于固相上(見(jiàn)下文)。
2)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)物用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白的偶聯(lián)物按照Greg T.Hermanson于1996所述的方案制備。在使用方案1d時(shí)，這種過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)物用第二步(下文所述)的稀釋劑稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度(例如，大于1.5單位)。
方案1a、1b、1c和1d的通用材料1)選擇的固相Maxisorp microplate，Nunc(丹麥)。
2)根據(jù)本發(fā)明的方案的第一步和第二步的稀釋劑
第一步的稀釋劑Tris NaCl緩沖液，0.05M，pH6.7，補(bǔ)充0.25％NP40((叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇-IGEPAL CA 630，Sigma)。
第二步的稀釋劑檸檬酸緩沖液(50mM，pH6.7，含有20％甘油，并且含有一定稀釋度的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(Fc)小鼠多克隆抗體偶聯(lián)物(Jackson Immunoresearch Laboratories，USA)，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度(例如，大于1.5單位)。
3)顯色溶液顯色溶液由下列成分組成3a)底物緩沖液檸檬酸(0.075M)和乙酸鈉(0.1M)的溶液，pH4.0，含有0.015％H2O2和4％二甲亞砜(DMSO)(PROLABO)，和3b)顯色試劑在底物緩沖液中終濃度為0.7mM的四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma)。
4)終止溶液1N H2SO4。
方法方案1a同時(shí)檢測(cè)樣品(血清或血漿)中丙型肝炎病毒的衣殼抗原和抗體(抗衣殼和抗NS3、NS4抗體)的方案該測(cè)定的原理基于檢測(cè)抗原的夾心型和檢測(cè)抗體的間接型免疫酶法。
它基于下列步驟首先用下列成分制備一種包被溶液·HCV抗原的混合物含有序列SEQ ID No.4的突變的肽C-G-G-Cap1-75(G34-G44-G47)(衣殼)和大腸桿菌由選擇自非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3(克隆NS3.1AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1AA 1694-1735)的克隆產(chǎn)生的兩種重組蛋白，和·抗衣殼單克隆抗體(mAb 1)，在0.5M Tris緩沖液，pH7.4中。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔(cupule)，比例為每個(gè)凹孔110μl。
微量滴定板在室溫(18-24℃)下溫育過(guò)夜。
除去包被溶液后，用含有0.1％Tween 20的磷酸緩沖液(0.01M，pH7.4)洗板，然后加入含有5％蔗糖、25％脫脂牛奶(CandiaTM，法國(guó)，或其它任何相當(dāng)?shù)目梢宰鳛樯唐帆@得的脫脂牛奶)和10mM EDTA的磷酸緩沖液(0.01M，pH7)飽和。
將100μl第一步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 2，隨后將50μl樣品(血清或血漿)，連續(xù)分配到每個(gè)凹孔中。
反應(yīng)培養(yǎng)基在37℃下溫育1.5小時(shí)?？赡芎械腍CV衣殼抗原與固相上的單克隆抗體mAb 1結(jié)合，并且與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 2結(jié)合，從而與這兩種抗體形成夾心復(fù)合物。類似地，如果存在抗HCV抗體，它們也可結(jié)合與固相附著的抗原。
然后用洗滌溶液(Tris NaCl緩沖液，0.01M，pH7.4，補(bǔ)充0.1％Tween 20)洗板(3次)。
將100μl第二步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，分配于每個(gè)凹孔中。反應(yīng)培養(yǎng)基在室溫(18-24℃)下溫育30分鐘。標(biāo)記的抗人IgG抗體隨后與保留在固相上的特異性抗體連接。
然后用洗滌溶液(Tris NaCl緩沖液，0.01M，pH7.4，補(bǔ)充0.1％Tween 20)洗板(5次)。從而除去未結(jié)合的抗人IgG偶聯(lián)物。
向每個(gè)凹孔中添加100μl顯色溶液。使反應(yīng)體系在室溫(18-24℃)下在暗處顯色30分鐘。
然后將100μl終止溶液分配到每個(gè)凹孔中。
在終止反應(yīng)后，用分光光度計(jì)讀取450/620nm的光密度。
閾值的定義利用ROC(Receiver Operating Characteristic)曲線(Berck和Schultz，(1986))統(tǒng)計(jì)學(xué)分析特異性和靈敏度數(shù)據(jù)，然后確定閾值。
特異性研究涉及1000份來(lái)自健康個(gè)體的樣品，靈敏度研究涉及200份來(lái)自商品組(panel)的HCV陽(yáng)性樣品(具體來(lái)自血清轉(zhuǎn)化開(kāi)始時(shí))BBI(Boston Biomedica Company，USA)，Impath(USA)，Serologicals(USA)，Nabi(USA)，ProMedDx(USA)。
由陽(yáng)性對(duì)照獲得的信號(hào)，除以該試驗(yàn)特異的常系統(tǒng)數(shù)X，計(jì)算每塊板的閾值。在所述的實(shí)施例中約為0.280 OD(光密度)單位。
該方案指出，與現(xiàn)有的一些技術(shù)不同，在本發(fā)明中，衣殼抗原和抗衣殼抗體的捕獲在衣殼的單一、相同的蛋白質(zhì)區(qū)上發(fā)生捕獲抗衣殼抗體的抗原區(qū)(AA 1-75)顯然包括抗原特異性區(qū)(AA 44-47)，固定的抗衣殼抗體(mab 1)通過(guò)該區(qū)捕獲衣殼抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明，一定數(shù)量抗衣殼抗體的漏檢被減少到最低，因此靈敏度提高。
方案1b同時(shí)檢測(cè)樣品(血清或血漿)中丙型肝炎病毒的衣殼抗原和抗體(抗NS3和NS4抗體)的方案該測(cè)定的原理基于檢測(cè)抗原的夾心型和檢測(cè)抗體的間接型免疫酶法。
它基于下列步驟首先用下列成分制備一種包被溶液·HCV抗原的一種混合物大腸桿菌由選擇自非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3(克隆NS3.1AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1AA 1694-1735)的克隆產(chǎn)生的兩種重組蛋白，和·抗衣殼單克隆抗體(mAb 1)，在0.5M Tris緩沖液，pH7.4中。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例為每個(gè)凹孔110μl。
以后的步驟與方案1a相同。
方案1c同時(shí)檢測(cè)樣品(血清或血漿)中丙型肝炎病毒的衣殼抗原和抗體(抗衣殼和抗NS3，NS4抗體)的方案該測(cè)定的原理基于檢測(cè)抗原的夾心型和檢測(cè)抗體的間接型免疫酶方法。
它基于下列步驟首先用下列成分制備一種包被溶液
·HCV抗原的一種混合物一種突變的肽C-G-G-Cap 1-75(G31-G44-G47)(衣殼)，其含有序列SEQ ID No.5，或突變的肽C-G-G-Cap1-53(G31-G44-G47)，其含有序列SEQ ID No.11，或突變的肽C-G-G-Cap6-68(G31-G44-G47)，其含有序列SEQ ID No.8和大腸桿菌由選擇非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3(克隆NS3.1AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1AA1694-1735)的克隆產(chǎn)生的兩種重組蛋白，和·抗衣殼單克隆抗體(mAb 3)，在0.5M Tris緩沖液，pH7.4中。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例為每個(gè)凹孔110μl。
微量滴定板在室溫(18-24℃)下溫育過(guò)夜。
除去包被溶液后，用含有0.1％Tween 20的磷酸緩沖液(0.01M，pH7.4)洗板，然后加入含有5％蔗糖、25％脫脂牛奶(CandiaTM，法國(guó)，或其它任何相當(dāng)?shù)目梢宰鳛樯唐帆@得的脫脂牛奶)和10mM EDTA的磷酸緩沖液(0.01M，pH7)飽和。
將100μl第一步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 1，然后將50μl樣品(血清或血漿)，連續(xù)分配到每個(gè)凹孔中。
反應(yīng)培養(yǎng)基在37℃下溫育1.5小時(shí)。
可能含有的HCV衣殼抗原與固相上的單克隆抗體mAb 3結(jié)合，并且與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 1結(jié)合，從而與這兩種抗體形成夾心復(fù)合物。類似地，如果存在抗HCV抗體，它們則結(jié)合與固相附著的抗原。
以后的步驟與方案1a相同。
在此類似地注意到，在本發(fā)明中，衣殼抗原和抗衣殼抗體的捕獲在衣殼的單一、相同的蛋白質(zhì)區(qū)上發(fā)生捕獲抗衣殼抗體的抗原區(qū)(AA 1-75)顯然包括抗原特異性區(qū)(AA 29-34)，固定的抗衣殼抗體(mab 3)通過(guò)該區(qū)捕獲衣殼抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明，一定數(shù)量抗衣殼抗體的漏檢被減少到最低，因此靈敏度提高。
方案1d同時(shí)檢測(cè)樣品(血清或血漿)中丙型肝炎病毒的衣殼抗原和抗體(抗衣殼和抗NS3，NS4抗體)的方案該測(cè)定的原理基于檢測(cè)抗原的夾心型和檢測(cè)抗體的間接型免疫酶法。
它基于下列步驟首先用下列成分制備一種包被溶液·HCV抗原的一種混合物一種突變的肽C-G-G-Cap 1-75(G34-G44-G47)(衣殼)，其含有序列SEQ ID No.4，或一種突變的肽C-G-G-Cap 1-75(G34-G46-G46’)，其含有序列SEQ ID No.15，或一種突變的肽C-G-G-Cap 1-75(G34-βA45)，其含有序列SEQ ID No.14，和大腸桿菌由選擇非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3(克隆NS3.1AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1AA 1694-1735)的克隆產(chǎn)生的兩種重組蛋白，和·抗衣殼單克隆抗體(mAb 1)，在0.5M Tris緩沖液，pH7.4中。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例為每個(gè)凹孔110μl。
微量滴定板在室溫(18-24℃)下溫育過(guò)夜。
除去包被溶液后，用含有0.1％Tween 20的磷酸緩沖液(0.01M，pH7.4)洗板，然后加入含有5％蔗糖、25％脫脂牛奶(CandiaTM，法國(guó)，或其它任何相當(dāng)?shù)目梢宰鳛樯唐帆@得的脫脂牛奶)和10mM EDTA的磷酸緩沖液(0.01M，pH7)飽和。
將100μl第一步的稀釋劑，其含有生物素標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 5，然后將50μl樣品(血清或血漿)，連續(xù)分配到每個(gè)凹孔中。
反應(yīng)培養(yǎng)基在37℃下溫育1.5小時(shí)。
可能含有的HCV衣殼抗原與固相上的單克隆抗體mAb 1結(jié)合，并且與生物素標(biāo)記的抗衣殼單克隆抗體mAb 5結(jié)合，從而與這兩種抗體形成夾心復(fù)合物。
類似地，如果存在抗HCV抗體，則它們結(jié)合與固相附著的抗原。
然后用洗滌溶液(Tris，NaCl緩沖液，0.01M，pH7.4，補(bǔ)充0.1％Tween 20)洗板(3次)。
將100μl第二步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白，分配到每個(gè)凹孔中。反應(yīng)培養(yǎng)基在室溫(18-24℃)下溫育30分鐘。標(biāo)記的抗人IgG抗體隨后與保留在固相上的特異性抗體連接，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白與保留在相同固相上的生物素化抗體mAb 5連接。
以后的步驟與方案1a相同。
同樣可以注意到，在本發(fā)明中，衣殼抗原和抗衣殼抗體的捕獲在衣殼的單一、相同的蛋白質(zhì)區(qū)上發(fā)生捕獲抗衣殼抗體的抗原區(qū)(AA 1-75)顯然包括抗原特異性區(qū)(AA 44-47)，固定的抗衣殼抗體(mab 1)通過(guò)該區(qū)捕獲衣殼抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明，一定數(shù)量抗衣殼抗體的漏檢減少到最低，因此靈敏度提高。
實(shí)施例1血清學(xué)窗口期樣品(血清或血漿)中HCV衣殼抗原的檢測(cè)采自HCV感染患者，并且歸類為可以作為商品獲得的組(Impath，USA)，根據(jù)抗體檢測(cè)為陰性，根據(jù)核酸檢測(cè)(PCR)為陽(yáng)性的血清或血漿樣品，按照方案1a所述的方法檢測(cè)。
表2顯示的結(jié)果與PCR獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。
表2
*稀釋應(yīng)當(dāng)指出，利用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果與PCR獲得的結(jié)果直接相關(guān)。因此本發(fā)明清楚地表明，盡管沒(méi)有抗體，即在血清學(xué)窗口期采集的樣品中，但仍然能夠檢測(cè)衣殼抗原。
實(shí)施例2HCV抗原陰性樣品(血清或血漿)中抗衣殼抗體的檢測(cè)采自HCV感染患者，并且歸類為內(nèi)部和可以作為商品獲得的組，抗體(衣殼)陽(yáng)性，抗原(衣殼)陰性的血清或血漿樣品，按照方案1a和1b所述的方法檢測(cè)。
在固相上沒(méi)有肽1-75(G34-G44-G47)(含有SEQ ID No.4)時(shí)(方案1b)，待測(cè)樣品(衣殼特異的)未檢測(cè)，而通過(guò)方案1a和常規(guī)抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)為陽(yáng)性(見(jiàn)表3)。
表3
因此，本發(fā)明能夠檢測(cè)HCV感染患者的抗衣殼抗體陽(yáng)性、衣殼抗原陰性的樣品。
實(shí)施例3樣品(血清或血漿)中衣殼抗原和抗HCV抗體的同時(shí)檢測(cè)BBI(Boston Biomedica Company，USA)所售的兩組血清轉(zhuǎn)化樣品，PHV 907和PHV 917(即兩個(gè)系列的血清或血漿，采自HCV感染后或血清轉(zhuǎn)化期間的兩名患者)，按照方案1a檢測(cè)(見(jiàn)表4和表5)。
表4
表5
在表4和表5中，使用根據(jù)本發(fā)明的方案1a觀察到抗原陽(yáng)性信號(hào)，它與病毒RNA的存在(PCR檢測(cè))相關(guān)；同樣，抗體和/或抗原陽(yáng)性的血清轉(zhuǎn)化樣品獲得陽(yáng)性反應(yīng)。這清楚地表明，這兩種檢測(cè)(衣殼抗原和抗衣殼抗體)能夠在同一個(gè)測(cè)定中不相干擾地同時(shí)進(jìn)行。
另外，從PCR診斷的觀點(diǎn)出發(fā)，所述的本發(fā)明尤其具有價(jià)值，因?yàn)樗軌驒z測(cè)PCR結(jié)果陰性和抗體陽(yáng)性的樣品。
實(shí)施例4多種突變肽在抗衣殼抗體檢測(cè)方面的性能比較采自HCV感染患者，并且歸類為內(nèi)部和可以作為商品獲得的組，抗體(衣殼)陽(yáng)性、抗原(衣殼)陰性的血清或血漿樣品，按照方案1c和1d所述的方法檢測(cè)(見(jiàn)表6和表7)。
表6方案1c
*稀釋表7方案1d
*稀釋表6中比較的突變肽對(duì)待測(cè)樣品顯示極其類似的性能。
另一方面，表7中肽之間的反應(yīng)差別更顯著。肽SEQ ID No.15和SEQ ID No.14不能檢測(cè)某些稀釋的抗衣殼樣品，當(dāng)檢測(cè)為純凈時(shí)，相同的樣品可被檢測(cè)。
實(shí)施例5衣殼抗原和抗HCV抗體的同時(shí)檢測(cè)對(duì)診斷的影響和血清學(xué)窗口期縮短8個(gè)可以作為商品獲得的血清轉(zhuǎn)化組(BBI，Boston Biomedica，US)(Impath，US)，用根據(jù)本發(fā)明的方案(被稱為Combo測(cè)定)，按照方案1a(使用肽C-G-G-Cap 1-75(G34-G44-G47)，其含有SEQ ID No.4)、1c(使用使用肽C-G-G-Cap 1-75(G31-G44-G47)，其含有SEQ ID No.5)和1d(使用肽C-G-G-Cap 1-75(G34-G44-G47)，其含有SEQ ID No.4)檢測(cè)。
表8列出了對(duì)這些不同的血清轉(zhuǎn)化檢測(cè)抗原(Elisa測(cè)定)或RNA(PCR)以及檢測(cè)抗體和進(jìn)行Combo(形式1a、1c和1d)獲得的結(jié)果。對(duì)于8個(gè)血清轉(zhuǎn)化中的4個(gè)，方案1a、1c和1d能夠檢測(cè)第一個(gè)陽(yáng)性樣品，同時(shí)通過(guò)PCR檢測(cè)到病毒RNA的出現(xiàn)。對(duì)于兩種方案1a、1c和1d，對(duì)應(yīng)于血清學(xué)窗口期縮短的抗原檢測(cè)與抗體檢測(cè)之間的平均天數(shù)為33天。
表9
最后一份樣品未檢測(cè)＝任意增加3天用根據(jù)本發(fā)明的方案1a、1c和1d獲得的結(jié)果允許在抗體出現(xiàn)之前早期檢測(cè)HCV感染(對(duì)于方案1a，相對(duì)于PCR平均只延遲8天，對(duì)于方案1c延遲7.7天，對(duì)于方案1d延遲7.4天)。
因此，在這種分類中首先進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明所述的檢測(cè)，這采用三種方案(1a、1c和1d)，使用不同的抗體和突變肽對(duì)。
總之，用根據(jù)本發(fā)明的方案1a、1c和1d獲得的結(jié)果清楚地表明，后者能夠極早期地有效檢測(cè)HCV感染，其靈敏度與PCR非常接近，而同時(shí)能夠在血清轉(zhuǎn)化后追蹤患者的血清學(xué)進(jìn)化。
實(shí)施例7三種Combo方案1a、1c和1d的特異性研究對(duì)供血者的血清(來(lái)源于Etablissement Francais du Sang，Rungis，法國(guó))進(jìn)行特異性研究。不同方案1a、1c和1d獲得的結(jié)果分別在表10、11、12中列出。
表10方案1
表11方案1c
表12方案1d
無(wú)論是使用方案1a、1c還是1d，在特異性方面都注意到有良好的表現(xiàn)。
在本說(shuō)明書(shū)中可以注意到，根據(jù)本發(fā)明的HCV Combo檢測(cè)通過(guò)在衣殼的單一、相同的蛋白質(zhì)區(qū)上捕獲衣殼抗原和抗衣殼抗體，令人驚訝地能夠產(chǎn)生與PCR接近而好于現(xiàn)有的一些技術(shù)的靈敏度。
這個(gè)結(jié)果是令人驚訝的，因?yàn)樵谛揎棸幸職る臅r(shí)，本發(fā)明人考慮了漏檢很大一部分抗體的危險(xiǎn)。
實(shí)施例8人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的檢測(cè)本發(fā)明描述的方法也用來(lái)檢測(cè)任何種類的傳染性微生物(例如病毒，如引起不同類型的肝炎的病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是引起人類(HIV-1、HIV-1之0組、HIV-2)或猴AIDS的逆轉(zhuǎn)錄病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV)、黃病毒，包括登革病毒，以及細(xì)菌、微生物寄生蟲(chóng)等)引起的感染，希望同時(shí)檢測(cè)其抗原和抗體。
實(shí)施例8顯示本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的P25(gag)病毒抗原和抗P25抗體的用途。
方案a、b、c的通用材料1)選擇的固相Maxisorp microplate，Nunc(丹麥)。
2)第一步的稀釋劑Tris，NaCl緩沖液，0.05M，pH6.7，補(bǔ)充0.25％NP40(IGEPAL CA 630，Sigma)。
3)第二步的稀釋劑Tris，NaCl緩沖液，0.01M，pH7.4，補(bǔ)充0.1％Tween 20。
4)顯色溶液顯色溶液含有4a)一種底物緩沖液檸檬酸(0.075M)和乙酸鈉(0.1M)溶液，pH4.0，含有0.015％H2O2和4％二甲亞砜(DMSO)(PROLABO)，和4b)顯色試劑在底物緩沖液中終濃度為0.7mM的四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma)。
5)終止溶液1N H2SO4。
方案a的材料抗-HIV1 P25抗體的檢測(cè)突變的合成肽，其對(duì)應(yīng)于下列序列SEQ ID No.22293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350與HIV-1M的P25蛋白的共有序列相比，含有突變(G295-G298-G310-G312-F316)，即SEQ ID No.23293FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(H+L)綿羊多克隆抗體偶聯(lián)物(Bio-Rad)。該偶聯(lián)物在使用前用第二步的稀釋劑(如上所述)稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度。
方案b的材料HIV-1 P25抗原的檢測(cè)抗P25單克隆抗體Pm25，它可識(shí)別HIV-1 M P25蛋白的下列序列308QASQEVKNWMTETLL322(SEQ ID No.24)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的上述單克隆抗體Pm25的偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物在使用前用第二步的稀釋劑(如上所述)稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度。
方案c的材料抗P25抗體和HIV-1 P25抗原的同時(shí)(“ Combo”)檢測(cè)突變的合成肽，其對(duì)應(yīng)于下列序列SEQ ID No.22293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350單克隆抗體Pm25，它可識(shí)別HIV-1 M P25蛋白的下列序列
308QASQEVKNWMTETLL322(SEQ ID No.24)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(H+L)綿羊多克隆抗體偶聯(lián)物(Bio-Rad)。
用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的上述單克隆抗體Pm25的偶聯(lián)物。
上述兩種免疫過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物在使用前用第二步的稀釋劑(如上所述)一起稀釋，以便能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下，用得到證明的陽(yáng)性樣品最終獲得高光密度。
方法方案a抗-HIV-1 P25抗體的檢測(cè)該測(cè)定的原理基于檢測(cè)抗HIV-1 P25抗體的間接型免疫酶法。
它基于下列步驟首先用含有序列SEQ ID No.22的突變肽SEQ ID No.22(G295-G298-G310-G312-F316)在pH9.6的碳酸緩沖液中制備包被溶液。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例為每個(gè)凹孔110μl。
微量滴定板在室溫(18-24℃)下溫育過(guò)夜。
除去包被溶液后，用含有0.1％Tween 20的磷酸緩沖液(0.01M，pH7.4)洗板，然后加入含有5％蔗糖和25％脫脂牛奶(CandiaTM，法國(guó)，或其它任何相當(dāng)?shù)目梢宰鳛樯唐帆@得的脫脂牛奶)的磷酸緩沖液(0.01M，pH7)飽和。
將80μl第一步的稀釋劑，然后將20μl樣品(血清或血漿)，連續(xù)分配到每個(gè)凹孔中。
反應(yīng)培養(yǎng)基在37℃下溫育1小時(shí)。如果存在抗HIV-1 P25抗體，則它們結(jié)合與固相附著的肽。
然后用洗滌溶液(Tris，NaCl緩沖液，0.01M，pH7.4，補(bǔ)充0.1％Tween 20)洗板(3次)。
將100μl第二步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(H+L)抗體，分配到每個(gè)凹孔中。反應(yīng)培養(yǎng)基在室溫(18-24℃)下溫育30分鐘。標(biāo)記的抗人IgG(H+L)抗體隨后與保留在固相上的特異性抗體連接。
然后用洗滌溶液(Tris NaCl緩沖液，0.01M，pH7.4，補(bǔ)充0.1％Tween 20)洗板(5次)。從而除去未結(jié)合的抗人IgG偶聯(lián)物。
向每個(gè)凹孔中添加100μl顯色溶液。使反應(yīng)體系在室溫(18-24℃)下在暗處顯色30分鐘。
然后將100μl終止溶液分配到每個(gè)凹孔中。
在終止反應(yīng)后，用分光光度計(jì)讀取450/620nm的光密度。
方案bHIV-1 P25抗原的檢測(cè)該測(cè)定的原理基于檢測(cè)HIV-1 P25抗原的夾心型免疫酶法。它基于下列步驟首先用抗HIV-1 P25單克隆抗體(Pm25)在pH9.6的碳酸緩沖液中制備一種包被溶液。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例為每個(gè)凹孔110μl。
以后的步驟與方案a相同，直到第二步。
對(duì)于第二步，分配100μl第二步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體Pm25。反應(yīng)培養(yǎng)基在室溫(18-24℃)下溫育30分鐘。標(biāo)記的單克隆抗體Pm25然后與保留在固相上的P25抗原(如果存在的話)連接。
最后的步驟與方案a相同。
方案c樣品(血清或血漿)中HIV-1 P25抗原和抗HIV-1 P25抗體的同時(shí)(“Combo”)檢測(cè)該測(cè)定的原理基于檢測(cè)抗原的夾心型和檢測(cè)抗體的間接型免疫酶法。
它基于下列步驟首先用下列成分制備一種包被溶液·突變的肽SEQ ID No.22(G295-G298-G310-G312-F316)，和·抗P25單克隆抗體(Pm25)，在碳酸緩沖液，pH9.6中。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例為每個(gè)凹孔110μl。
微量滴定板在室溫(18-24℃)下溫育過(guò)夜。
除去包被溶液后，用含有0.1％Tween 20的磷酸緩沖液(0.01M，pH7.4)洗板，然后加入含有5％蔗糖和25％脫脂牛奶(CandiaTM，法國(guó)，或其它任何相當(dāng)?shù)目梢宰鳛樯唐帆@得的脫脂牛奶)的磷酸緩沖液(0.01M，pH7)飽和。
將80μl第一步的稀釋劑，然后將20μl樣品(血清或血漿)，連續(xù)分配到每個(gè)凹孔中。
反應(yīng)培養(yǎng)基在37℃下溫育1.5小時(shí)。可能存在的P25抗原與固相上的單克隆抗體結(jié)合。類似地，如果存在抗P25抗體，則它們結(jié)合與固相附著的抗原肽。
以后的步驟與方案1a相同，直到第二步。
對(duì)于第二步，分配100μl第二步的稀釋劑，其含有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體Pm25和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(H+L)抗體。反應(yīng)培養(yǎng)基在室溫(18-24℃)下溫育30分鐘。標(biāo)記的單克隆抗體Pm25然后與保留在固相上的P25抗原連接。類似地，標(biāo)記的抗人IgG(H+L)抗體隨后與保留在固相上的特異性抗體連接。
最后的步驟與方案a相同。
結(jié)果
在此同樣也可以注意到，在本發(fā)明中，HIV-1 P25抗原和抗HIV-1P25抗體的捕獲在衣殼的單一、相同的蛋白質(zhì)區(qū)上發(fā)生捕獲抗P25抗體的抗原區(qū)(AA 293-350)顯然包括抗原特異性區(qū)(AA 308-322)，固定的抗P25抗體(Pm25)通過(guò)該區(qū)捕獲P25抗原。
本領(lǐng)域技術(shù)人員例如以實(shí)施例8為基礎(chǔ)，當(dāng)然也可以容易地進(jìn)行免疫檢測(cè)，以同時(shí)檢測(cè)HIV-1 P25(gag)抗原、抗HIV-1 P25抗體和針對(duì)HIV-1的gp41糖蛋白(包膜)的抗體。為了檢測(cè)抗HIV-1 gp41抗體，一個(gè)并非唯一的例子是，可以使用其本身已知的整個(gè)天然或重組的gp41，或者含有g(shù)p41的優(yōu)勢(shì)免疫表位的一種肽，如JW.Gnann等人(1987)的公開(kāi)文本所述。
同時(shí)檢測(cè)HIV-2 P26(gag)抗原、抗HIV-2 P26抗體和針對(duì)HIV-2的gp36糖蛋白(包膜)的抗體的免疫測(cè)定也是本發(fā)明的一部分。為了檢測(cè)P26抗原，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本身已知的抗P26抗體，為了檢測(cè)抗P26抗體，可以使用P26的抗原肽，例如，它能夠來(lái)源于Guyader等人(1987)發(fā)表的HIV-2序列。為了檢測(cè)抗gp36抗體，一個(gè)并非唯一的例子是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其本身已知的整個(gè)天然或重組的gp36，或者含有g(shù)p36的優(yōu)勢(shì)免疫表位的一種肽，如JW.Gnann等人(1987)的公開(kāi)文本所述。
他們也能夠容易地同時(shí)進(jìn)行“HIV-1+HIV-2 Combo”免疫測(cè)定，聯(lián)合檢測(cè)HIV-1 P25抗原、HIV-2 P26抗原、抗HIV-1 P25抗體、抗HIV-2P26抗體、抗HIV-1 gp41抗體和抗HIV-2 gp36抗體，這也是本發(fā)明的一部分。
參者文獻(xiàn)-Alcon等人，J.of Clin.Microbiol.，2002，vol.40(2)，pp.376-381-Atherton等人(1989)固相肽合成實(shí)用手冊(cè)“solid phase peptide synthesis，apractical approach”，IRL Press，Oxford University Press，pp.25-34-Benoit等人(1982)PNAS USA，79，pp.917-921-Berck et Schultz，(1986)，Arch.Pathol.Lab.Med.，10，pp.13-20-Bukh，Semin.Liver Dis.(1995)1541-63-Cerino等人(1991)，J.Immunology，Vol.147(8)，pp.2692-2696-Clayes等人(1995)，J of Medical Virology，45，pp.273-281-Garson等人，(1990)Lancet，336，PP.878-879-Gnann，JW.，等人(1987)Science，237pp.1346-1349-Guyader等人(1987)Nature 326，pp.662-669-Hajime Tokita等人(2000)J.Clin.Microbiol，Vol.38，pp.3450-3452-Harlow等人(1988)ed.，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)“Antibodiesa Laboratory manua”-Hermanson Greg T.，(1996)Bioconjugate techniques，Academic Press，NewYork，pp.373-380 et pp.580-583-Hosein等人(1991)PNAS Vol.88，May，pp.3647-3651-Icardi等人(2001)J.Clin.Microbiol.，39，pp.3110-3114-Ishida，(1993)，J.Clin.Microbiol.，Vol.31，No.4，pp.936-940-Khler et Milstein，(1975)Nature，256，pp.495-497-Leahy等人(1991)第三屆丙型肝炎國(guó)際討論會(huì)，Strasbourg，poster B35-Maiolini等人，(1978)Journal of Immunological Methods，20，pp.25-34-Marks等人(1991)J.Mol.Biol，222，pp.581-597-Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc，85，pp.2149-2154-Nasoff等人(1991)PNAS Vol.88，No.12，pp.5462-5466-Okamoto等人(1990a)Japan J.Exp.Med.，vol.60(3)，pp.167-177-Okamoto等人(1990b)Japan J.Exp.Med.，vol.60(4)，pp.223-233-Peterson等人(2000)Vox sanguinis，Vol.78，pp.80-85-Ratner等人(1985)Nature，313，pp.277-284-Sllberg等人(1992)J.Clin.Microbiology，Vol.30(8)，pp.1989-1994-Sanchez-Pescador等人(1985)Science，227，pp.484-492
序列表<110>BIORAD PASTEUR<120>同時(shí)檢測(cè)傳染性微生物的抗原及抗體的方法<130>BET 03P0457<150>FR 0205808<151>2002-05-10<160>33<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>1Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>2<211>63<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>2Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp1 5 10 15Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu20 25 30Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser35 40 45
Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala50 55 60<210>3<211>53<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>3Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser50<210>4<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>4Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>5<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>5
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Gly Gly20 25 30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>6<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>6Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Val Tyr Gly Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>7<211>63<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>7Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp1 5 10 15Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Gly Tyr Leu Leu20 25 30
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala Thr Arg Lys Thr Ser35 40 45Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala50 55 60<210>8<211>63<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>8Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp1 5 10 15Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Gly Gly Gly Val Tyr Leu Leu20 25 30Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala Thr Arg Lys Thr Ser35 40 45Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala50 55 60<210>9<211>70<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>9Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp1 5 10 15Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Gly Leu20 25 30Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala Thr Arg Lys Thr Ser35 40 45Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg50 55 60Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70<210>10
<211>53<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>10Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser50<210>11<211>53<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>11Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Gly Gly20 25 30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser50<210>12<211>53<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>12Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Val Tyr Gly Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala
35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser50<210>13<211>73<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>13Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Arg Ala Thr Arg35 40 45Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro50 55 60Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70<210>14<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220>
<221>MOD_RES<222>(45)..(45)<223>bAla<400>14Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Ala Val Arg Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>15<211>76<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>15Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Gly Gly Arg35 40 45Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln50 55 50Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>16<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220>
<221>MOD_RES<222>(29)..(29)<223>Nle<400>16Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Leu Gly Val Gly20 25 30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>17<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>17Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Phe Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>18<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>高絲氨酸<400>18Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Gly Ser Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser65 70 75<210>19<211>4<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>19Leu Gly Val Arg1<210>20<211>7<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>20Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu1 5<210>21<211>6<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>21Gln Ile Val Gly Gly Val1 5<210>22<211>58<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>22Phe Arg Gly Tyr Val Gly Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln1 5 10 15Ala Gly Gln Gly Val Lys Asn Phe Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln20 25 30Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala35 40 45Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys50 55<210>23
<211>58<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>23Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln1 5 10 15Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln20 25 30Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala35 40 45Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys50 55<210>24<211>15<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>24Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu1 5 10 15<210>25<211>15<212>PRT<213>II型人免疫缺陷病毒<400>25Gln Thr Asp Pro Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu1 5 10 15<210>26<211>12<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>26Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys1 5 10<210>27<211>12<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>27
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys1 5 10<210>28<211>12<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>28Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys His Ile Cys1 5 10<210>29<211>12<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>29Leu Gly Met Trp Gly Cys Ser Gly Lys His Ile Cys1 5 10<210>30<211>26<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>30Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys20 25<210>31<211>34<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>31Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn20 25 30Ala Ser
<210>32<211>12<212>PRT<213>II型人免疫缺陷病毒<400>32Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys1 5 10<210>33<211>36<212>PRT<213>II型人免疫缺陷病毒<400>33Arg Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn1 5 10 15Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp20 25 30Val Asn Asp Ser3權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)生物樣品中微生物感染的方法，包括同時(shí)檢測(cè)生物樣品中存在的該微生物的至少一種抗原和針對(duì)該微生物的一種抗體，該方法包括a)使生物樣品接觸針對(duì)該微生物的捕獲抗體，和來(lái)源于該微生物的捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物，任選地使用一種標(biāo)記的檢測(cè)抗體，和/或任選地一種標(biāo)記的檢測(cè)抗原，該檢測(cè)抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的該微生物的抗原，該檢測(cè)抗原能夠結(jié)合于已經(jīng)被捕獲的針對(duì)該微生物的抗體；其中該微生物的捕獲抗原和/或標(biāo)記的檢測(cè)抗原包含該微生物的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位已經(jīng)被破壞；該捕獲和/或檢測(cè)抗體可識(shí)別已經(jīng)被捕獲的抗原的該完整表位。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物選自病毒、細(xì)菌和微生物寄生蟲(chóng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述微生物是丙型肝炎病毒(HCV)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述捕獲抗原含有HCV衣殼蛋白的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述捕獲抗原含有HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3或NS4的抗原性片段。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述微生物是人類免疫缺陷病毒(HIV)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述HIV是HIV-1和/或HIV-2。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述捕獲抗原含有HIV gag蛋白的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述捕獲抗原含有HIV的包膜蛋白的抗原性片段。
10.如權(quán)利要求3-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述捕獲抗原含有至少兩個(gè)已經(jīng)被破壞的不同的表位位點(diǎn)。
11.如權(quán)利要求3-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述捕獲抗原含有被至少一個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入所破壞的表位位點(diǎn)。
12.如權(quán)利要求3-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述捕獲抗體和捕獲抗原固定于固相上。
13.如權(quán)利要求3-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中在抗原-抗體復(fù)合物形成之后向混合物中添加檢測(cè)抗體。
14.如權(quán)利要求3-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)抗體和/或檢測(cè)抗原與捕獲抗體和捕獲抗原同時(shí)接觸生物樣品。
15.如權(quán)利要求3所述的方法，其包括a)使生物樣品接觸與固相結(jié)合的HCV捕獲抗體和HCV捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)分離固相與液相；d)使固相首先接觸一種標(biāo)記的檢測(cè)抗體，該檢測(cè)抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的HCV抗原，然后使固相接觸一種標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體或標(biāo)記的檢測(cè)抗原，其能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的抗HCV抗體，用于捕獲的抗原和用于檢測(cè)抗HCV抗體的抗原包含HCV衣殼蛋白的抗原性片段，其中有兩個(gè)表位已經(jīng)被破壞，該捕獲和檢測(cè)抗體各個(gè)可識(shí)別已經(jīng)被捕獲的衣殼抗原的這些完整表位之一。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中捕獲抗體和檢測(cè)抗體各個(gè)可識(shí)別具有選自下列序列的表位44LGVR47(SEQ ID No.19)、30IVGGVYL36(SEQ ID No.20)和29QIVGGV34(SEQID No.21)。
17.如權(quán)利要求6或7所述的檢測(cè)方法，其包括a)使該樣品接觸與固相結(jié)合的HIV捕獲抗體和HIV捕獲抗原；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物；c)分離固相與液相；d)使固相接觸一種標(biāo)記的檢測(cè)抗體和一種或多種標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體，前一種抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的HIV抗原，后一種抗體能夠結(jié)合已經(jīng)被捕獲的抗HIV抗體；用于捕獲抗HIV抗體的抗原包含HIV gag蛋白的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位已經(jīng)被破壞，該捕獲和檢測(cè)抗體各個(gè)可以識(shí)別已經(jīng)被捕獲的衣殼抗原的這些完整表位之一。
18.如權(quán)利要求19所述的方法，其中捕獲抗體和檢測(cè)抗體各個(gè)可識(shí)別序列QASQEVKNWMTETLL(SEQ ID No.24)的表位。
19.如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中在至少一種非離子型去污劑的存在下，使生物樣品接觸與固相結(jié)合的所述捕獲抗體和所述捕獲抗原。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述非離子型去污劑是NP40。
21.一種用于檢測(cè)生物樣品中微生物感染的試劑盒，其含有-一種捕獲或檢測(cè)抗原，其含有一種微生物的蛋白質(zhì)之抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的針對(duì)該微生物的抗體的能力；-一種抗體，其針對(duì)該微生物的該蛋白質(zhì)的這個(gè)完整表位。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述微生物是丙型肝炎病毒(HCV)。
23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述抗體是一種用于捕獲生物樣品中存在的HCV抗原的抗體。
24.如權(quán)利要求22和23之一所述的試劑盒，其中所述抗體可識(shí)別具有選自下列序列的表位44LGVR47(SEQ ID No.19)、30IVGGVYL36(SEQID No. 20)、29QIVGGV34(SEQ ID No.21)。
25.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述微生物是人類免疫缺陷病毒(HIV)。
26.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述HIV是HIV-1和/或HIV-2。
27.如權(quán)利要求25和26之一所述的試劑盒，其中所述抗體是一種用于捕獲生物樣品中存在的HIV抗原的抗體。
28.如權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述抗體可識(shí)別序列QASQEVKNWMTETLL(SEQ ID No.24)的表位。
29.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的試劑盒，除了捕獲抗原之外，它還含有用于檢測(cè)生物樣品中存在的抗HCV抗體并與該捕獲抗原形成復(fù)合物的單元。
30.如權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)所述的試劑盒，除了捕獲抗原之外，它還含有用于檢測(cè)生物樣品中存在的抗HIV抗體并與該捕獲抗原形成復(fù)合物的單元。
31.如權(quán)利要求28或29所述的試劑盒，其中所述檢測(cè)的單元是標(biāo)記的抗免疫球蛋白或抗同種型抗體。
32.如權(quán)利要求23、24、29和31之一所述的試劑盒，其中捕獲抗體和捕獲抗原以固定于固相上的形式存在。
33.如權(quán)利要求32所述的試劑盒，其含有a)捕獲抗原，其含有HCV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少兩個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HCV抗體的能力；b)捕獲抗體，其針對(duì)該HCV蛋白質(zhì)的所述完整表位之一；該捕獲抗原和該捕獲抗體被固定于固相上；和c1)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其針對(duì)該HCV蛋白質(zhì)的所述完整表位中的另外一個(gè)；和/或c2)任選的標(biāo)記的檢測(cè)抗原，它是HCV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HCV抗體的能力。
34.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中標(biāo)記的檢測(cè)抗原是HCV衣殼蛋白的片段，該片段的至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。
35.如權(quán)利要求22-24、29和31-33之一所述的試劑盒，其中所述捕獲抗原含有HCV衣殼蛋白的一個(gè)片段，該片段的至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞，所述抗體可識(shí)別衣殼蛋白的這個(gè)完整的表位位點(diǎn)。
36.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其含有a)捕獲抗原，其含有HIV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HIV抗體的能力；b)捕獲抗體，其針對(duì)該HIV蛋白質(zhì)的所述完整表位之一；該捕獲抗原和該捕獲抗體被固定于固相上；c1)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其針對(duì)該HIV蛋白質(zhì)的所述完整表位中的另外一個(gè)；和/或c2)任選的標(biāo)記的檢測(cè)抗原，它是HIV蛋白質(zhì)的抗原性片段，該片段含有至少一個(gè)被破壞的表位，而同時(shí)保留結(jié)合生物樣品中可能存在的抗HIV抗體的能力。
37.如權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述捕獲抗原含有HIV gag蛋白的抗原性片段，其中至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞。
38.如權(quán)利要求25-28、30-32和36之一所述的試劑盒，其中所述捕獲抗原含有HIV gag蛋白的一個(gè)片段，該片段的至少一個(gè)表位位點(diǎn)已經(jīng)被破壞，所述抗體可識(shí)別gag蛋白的這個(gè)完整的表位位點(diǎn)。
39.如權(quán)利要求23-38之一所述的試劑盒，它還含有至少一種非離子型去污劑。
40.如權(quán)利要求39所述的試劑盒，其中所述非離子型去污劑是NP40。
41.一種來(lái)源于HCV衣殼蛋白的肽或多肽，其攜帶至少一個(gè)完整的表位位點(diǎn)和至少一個(gè)被破壞的表位位點(diǎn)，這個(gè)被破壞的表位位點(diǎn)因此不能被抗衣殼抗體識(shí)別。
42.如權(quán)利要求41所述的肽或多肽，其含有序列SEQ ID No.4至序列SEQ ID No.18中的任意一個(gè)。
43.一種來(lái)源于HIV gag蛋白的肽或多肽，其攜帶至少一個(gè)完整的表位位點(diǎn)和至少一個(gè)被破壞的表位位點(diǎn)，這個(gè)被破壞的表位位點(diǎn)因此不能被抗gag蛋白抗體識(shí)別。
44.如權(quán)利要求43所述的肽或多肽，其含有序列SEQ ID No.22。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)方法，其通過(guò)同時(shí)檢測(cè)微生物(如丙型肝炎病毒)的抗原和針對(duì)這同一種抗原的抗體，體外檢測(cè)生物樣品中該微生物的感染，還涉及實(shí)施該方法的試劑和試劑盒。
文檔編號(hào)C07K14/16GK1659440SQ03813516
公開(kāi)日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月10日
發(fā)明者F·里厄尼耶, M·費(fèi)薩蓋, S·昂利奧, N·朗貝爾 申請(qǐng)人:比奧-拉德 巴斯德公司