乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒以及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，包括試劑M、試劑R以及對(duì)照品，所述試劑M中組分包括經(jīng)診斷試劑防腐劑處理的親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒為通用型磁微粒；所述試劑R中的組分包括生物素化抗-HBe抗體、吖啶酯標(biāo)記的抗-HBe抗體、MES緩沖液以及診斷試劑防腐劑，所述吖啶酯標(biāo)記的抗-HBe抗體是以吖啶酯通過(guò)二甲基亞胺偶聯(lián)抗-HBe抗體；所述對(duì)照組包括人源性乙肝e抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。本發(fā)明涉及的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒具有靈敏度高、誤差小、安全快速檢測(cè)的益處。
【專利說(shuō)明】乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒以及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及乙型肝炎診斷試劑盒，具有設(shè)計(jì)基于雙抗體化學(xué)發(fā)光原理的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病。HBV可以通過(guò)血液和體液直接傳播，常見(jiàn)的傳播方式包括輸血、注射、傷口接觸、母嬰傳播等；常見(jiàn)的臨床癥狀有不適、發(fā)熱、黃疸、無(wú)癥狀肝炎、暴發(fā)性肝炎以及慢性肝炎等，慢性感染易發(fā)展成為肝癌，因此，檢測(cè)乙型肝炎的工作至關(guān)重要。
[0003]目前，常用的檢測(cè)方法是免疫學(xué)檢測(cè)，免疫學(xué)檢測(cè)時(shí)基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)被檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。免疫學(xué)檢測(cè)經(jīng)理了放射免疫檢測(cè)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)以及光生物學(xué)標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)三個(gè)階段，使免疫學(xué)檢測(cè)向著敏感性、準(zhǔn)確性以及操作簡(jiǎn)捷性的方向發(fā)展。
[0004]化學(xué)發(fā)光免疫分析是近十年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測(cè)原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號(hào)放大系統(tǒng)并借助其發(fā)光強(qiáng)度直接測(cè)定免疫結(jié)合。該方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，是免疫學(xué)檢測(cè)重要的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種靈敏度高、誤差小、安全快速檢測(cè)的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒及檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，包括試劑M、試劑R以及對(duì)照品，所述試劑M中組分包括經(jīng)診斷試劑防腐劑處理的親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒為通用型磁微粒；所述試劑R中的組分包括生物素化抗-HBe抗體、吖唳酯標(biāo)記的抗-HBe抗體、MES緩沖液以及診斷試劑防腐劑,所述吖唳酯標(biāo)記的抗-HBe抗體是以吖啶酯通過(guò)二甲基亞胺偶聯(lián)抗-HBe抗體；所述對(duì)照組包括人源性乙肝e抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述親和素包被磁微粒中的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述抗-HBe抗體為鼠源單克隆抗-HBe抗體。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，試劑R中所述MES緩沖液的濃度為
0.05M, pH 值為 6.0。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300 防腐劑。[0011]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述試劑R為23ml，所述試劑M的量為3ml。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述對(duì)照品包括對(duì)照品I和對(duì)照品2兩組，所述對(duì)照品I的量為0.5ml，濃度為0.0PEIU/ml，所述對(duì)照品2的量為0.5ml，濃度為1.5PEIU/ml。
[0013]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，一種使用該乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下幾步:
[0014](I)在將待測(cè)樣品和含有生物素化的e抗體(Ant1-HBe)及吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBe的試劑R進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合體的反應(yīng)液I ;
[0015](2)在反應(yīng)液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M,反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相；
[0016](3)將反應(yīng)液I置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)的檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2,檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎病毒e抗原濃度成正比。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過(guò)氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0018]本發(fā)明的解決了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，具有以下有益效果:
[0019]1.本發(fā)明涉及的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，內(nèi)含有親和素包被的磁微粒，利用了雙抗體化學(xué)發(fā)光原理(夾心法)，在磁場(chǎng)中反應(yīng)液中的磁微粒會(huì)被吸附，通過(guò)洗滌將未結(jié)合物沖洗除去，然后再注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液檢測(cè)化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度，因?yàn)楣鈴?qiáng)度與樣本中的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)濃度成正比，所以很容易就得到樣本中的HBeAg濃度，從而可以輔助診斷急性和慢性HBV感染。
[0020]2.使用本發(fā)明的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，只需按照常規(guī)醫(yī)用技術(shù)采集病人的全血樣本，使血清分離完全不含血細(xì)胞成分，然后使用本發(fā)明提供的試劑盒，即可檢測(cè)出乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)，結(jié)合其它HBV幾項(xiàng)標(biāo)志物，可以判斷HBV感染的臨床狀態(tài)，該方法簡(jiǎn)單易操作，誤差小，準(zhǔn)確度高。
[0021]3.本發(fā)明試劑盒中的生物素和親和素組成生物素-親和素系統(tǒng),該生物素-親和素系統(tǒng)做為測(cè)定過(guò)程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的人員更好地理解本發(fā)明，并使本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0023]本發(fā)明一種乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，組要組成成分如下:
[0024]試劑R:每瓶23ml，內(nèi)含有生物素化Ant1-HBe及吖啶酯標(biāo)記Ant1-HBe，
0.05MPH6.0的MES緩沖液，0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑，其中吖啶酯標(biāo)記的抗-HBe抗體是以吖啶酯通過(guò)二甲基亞胺偶聯(lián)抗-HBe抗體。
[0025]試劑M:每瓶3.0ml,內(nèi)含親和素包被的磁微粒,經(jīng)0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑防腐處理；其中，親和素包被磁微粒中的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，本發(fā)明中的磁微粒是通用型的磁微粒。
[0026]對(duì)照品(Cal):本發(fā)明實(shí)施例中的對(duì)照品分為I和2兩組，均內(nèi)含人源性的乙肝e抗原，新生牛血清，0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；對(duì)照品濃度如下:Call的近似濃度為
0.0PEIU/ml, Cal2 的近似濃度為 1.5PEIU/ml。
[0027]本發(fā)明的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒用于測(cè)定人血清(血漿)中乙型肝炎病毒e抗原。乙型肝炎病毒e抗原HBeAg是乙肝病毒(HBV)前C/C基因編碼蛋白產(chǎn)物，可出現(xiàn)在急性乙肝病毒感染者的血清中，和HBV的其他幾項(xiàng)標(biāo)志物結(jié)合，可診斷HBV感染的臨床狀態(tài)，可用于輔助診斷急性和慢性HBV感染。
[0028]本發(fā)明中涉及的抗-HBe抗體為鼠源單克隆抗-HBe抗體，使用該試劑盒的檢測(cè)原理是采用雙抗體化學(xué)發(fā)光原理，步驟如下:
[0029]第一步反應(yīng):將樣本和生物素化的乙型肝炎病毒e抗體(Ant1-HBe)及吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBe進(jìn)行反應(yīng)，如果標(biāo)本中含有HBeAg，將形成抗體-抗原一抗體夾心復(fù)合體。
[0030]第二步反應(yīng):加入親和素包被的微粒，復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相。
[0031]將反應(yīng)液置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)中的磁微粒將被吸住，通過(guò)洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)HBeAg濃度成正比。
[0032]實(shí)施例1
[0033]本發(fā)明具體實(shí)施例中的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0034]首先，要獲得待測(cè)樣品，即血清，按照常規(guī)應(yīng)用技術(shù)采集全血標(biāo)本，放置半小時(shí)以上使凝集，在3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘以上，使血清分離完全，血清中不含細(xì)胞成分；血漿用肝素鈉、EDTA-K3、枸櫞酸鈉或氟化鈉/草酸鉀抗凝。
[0035]然后，對(duì)該待測(cè)樣品使用乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè):
[0036](I)在將待測(cè)樣品和含有生物素化的e抗體(Ant1-HBe)及吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBe的試劑R進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合體的反應(yīng)液I ;
[0037](2)在反應(yīng)液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M,反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相；其中的生物素和親和素組成生物素-親和素系統(tǒng)，該生物素-親和素系統(tǒng)做為測(cè)定過(guò)程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性。
[0038](3)將反應(yīng)液I置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)的檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2,檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎病毒e抗原濃度成正比。
[0039]其中，化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過(guò)氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0040]本發(fā)明實(shí)施例中的化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀是EVERESYSA1800 I類，在檢測(cè)時(shí)，將試劑裝載到化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀試劑倉(cāng)上，并在軟件操作系統(tǒng)上確定裝載就試劑的名稱；試劑在裝載前，應(yīng)輕輕混勻，但禁止上下顛倒已打開(kāi)的試劑；將檢測(cè)樣本裝載在樣本倉(cāng)中，并在軟件操作系統(tǒng)上確定樣本檢測(cè)項(xiàng)目；將反應(yīng)杯裝載滿，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況裝載相應(yīng)數(shù)量反應(yīng)杯；每次檢測(cè)樣本量需要50ul，考慮檢測(cè)系統(tǒng)死體積因素，應(yīng)確保樣本量在200ul以上，同時(shí)應(yīng)考慮樣本容器的死腔因素。
[0041]結(jié)果計(jì)算
[0042]測(cè)定儀自動(dòng)計(jì)算得出Cut-off值，每份標(biāo)本根據(jù)標(biāo)本的RLU與Cut-off值的比值(S/C0),計(jì)算抗HBeAg的檢測(cè)結(jié)果即可。標(biāo)本的HBeAg測(cè)量S/C0值> I判斷為抗HBeAg無(wú)反應(yīng)性；標(biāo)本的HBeAg測(cè)量S/C0值≤I判斷為HBeAg反應(yīng)性。
[0043]靈敏度
[0044]使用上述的檢測(cè)方法，得到本發(fā)明的HBeAg試劑盒的靈敏度Cut-off值為(0.5PEIU/mL ;檢測(cè)HBeAg試劑國(guó)家盤(pán)靈敏度，符合標(biāo)準(zhǔn)；檢測(cè)國(guó)家陽(yáng)性參考品，符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0045]精密度
[0046]精密度依照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS) EP5-A方案制定，對(duì)5份HBeAg質(zhì)控品(其中三份血清，二份為校準(zhǔn)品)，采用同一批次試劑，每天不同時(shí)間各檢測(cè)一次，每次雙孔，共進(jìn)行20天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。
[0047]表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，包括試劑M、試劑R以及對(duì)照品，所述試劑M中組分包括經(jīng)診斷試劑防腐劑處理的親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒為通用型磁微粒；所述試劑R中的組分包括生物素化抗-HBe抗體、吖啶酯標(biāo)記的抗-HBe抗體、MES緩沖液以及診斷試劑防腐劑，所述吖啶酯標(biāo)記的抗-HBe抗體是以吖啶酯通過(guò)二甲基亞胺偶聯(lián)抗-HBe抗體；所述對(duì)照組包括人源性乙肝e抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述親和素包被磁微粒中的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述抗-HBe抗體為鼠源單克隆抗-HBe抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，試劑R所述MES緩沖液的濃度為0.05M, pH值為6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300防腐劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑R為23ml，所述試劑M的量為3ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述對(duì)照品包括對(duì)照品I和對(duì)照品2兩組，所述對(duì)照品I的量為0.5ml，濃度為0.0 PEI U/ml，所述對(duì)照品2的量為0.5ml，濃度為1.5 PEI U/ml。
8.一種使用權(quán)利要求1-7所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下幾步: (1)在將待測(cè)樣品和含有生物素化的e抗體(Ant1-HBe)及吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBe的試劑R進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合體的反應(yīng)液I ; (2)在反應(yīng)液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M，反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相； (3)將反應(yīng)液I置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)的檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎病毒e抗原濃度成正比。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過(guò)氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103616513SQ201310653455
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】陳秀發(fā), 胡慶鋒, 常立峻, 徐海偉, 李勇 申請(qǐng)人:蘇州長(zhǎng)光華醫(yī)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司