一種car?t細(xì)胞毒性指示載體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，具體涉及一種CAR?T細(xì)胞毒性指示載體，該細(xì)胞毒性指示載體為一種重組慢病毒載體，由原始慢病毒載體和插入序列組成。插入序列從5’端到3’端依次為腫瘤相關(guān)靶抗原編碼基因、連接肽編碼基因和熒光素酶編碼基因。當(dāng)CAR?T細(xì)胞與CAR?T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞混合后，指示細(xì)胞表達(dá)的腫瘤相關(guān)靶抗原能夠靶向引導(dǎo)CAR?T進(jìn)行結(jié)合，并裂解指示細(xì)胞，釋放熒光素酶。由于裂解細(xì)胞位于上清中，未裂解細(xì)胞位于沉淀中，因此通過(guò)檢測(cè)上清和沉淀中的熒光素酶活力值，再根據(jù)指示細(xì)胞數(shù)目和熒光素酶活力值的關(guān)系，即可推算出裂解和未裂解細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算裂解細(xì)胞比例，指示CAR?T細(xì)胞毒性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種CAR-T細(xì)胞毒性指示載體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，具體涉及一種CAR-T細(xì)胞毒性指示載體。
【背景技術(shù)】
[0002] CAR-T細(xì)胞指能夠表達(dá)嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的T細(xì)胞 (CAR-T)，CAR由胞外抗原結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成。CAR-T細(xì)胞治療 技術(shù)是指通過(guò)將上述CAR結(jié)構(gòu)在體外進(jìn)行基因重組得到重組質(zhì)粒再在體外將其導(dǎo)入到患者 的T細(xì)胞內(nèi)，從而獲得能夠表達(dá)上述嵌合抗原受體的CAR-T細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)純化和體外大規(guī) 模擴(kuò)增后，再將上述CAR-T細(xì)胞輸回患者體內(nèi)行使殺滅腫瘤細(xì)胞的功能。CAR-T療法的優(yōu)勢(shì) 在于:第一、其與腫瘤抗原的結(jié)合不需要依賴(lài)于HLA的呈遞，有效避免了腫瘤細(xì)胞HLA表達(dá)下 調(diào)這一免疫逃逸機(jī)制;第二、由于CAR-T治療的基本原理是按照抗體針對(duì)抗原或一個(gè)特殊靶 點(diǎn)的特異性結(jié)合，CAR結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)腫瘤相關(guān)胞外抗原結(jié)合域，因此CAR-T治療是一種專(zhuān) 一性的靶向治療，相比較而言，相對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞免疫治療諸如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 (CIK，Cytokine Induced Killer Cell)和NK自然殺傷細(xì)胞（NK，Natural Killer Cell)多 半都屬于非靶向特異的；第三、CAR-T療法能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量具有腫瘤殺傷效力的T 細(xì)胞。因此，CAR-T療法對(duì)腫瘤的治愈具備重要臨床應(yīng)用前景。
[0003] 在醫(yī)學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)CAR-T細(xì)胞毒性的指示或表征是一個(gè)不可避免的重 要問(wèn)題，如果不能更好地解決這一問(wèn)題，CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展都將受到嚴(yán) 重制約。然而，目前遍采用的方法是使用CAR-T殺傷離體培養(yǎng)的靶細(xì)胞，通過(guò)間接測(cè)定方法 來(lái)檢測(cè)其作用效果，從而得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論;在目前常用的CAR-T細(xì)胞毒性測(cè)定方法中，在CAR-T 細(xì)胞和靶細(xì)胞混合后，通常需要超過(guò)兩天的培養(yǎng)期（如MTT比色法等），因此所需檢測(cè)時(shí)間相 對(duì)較長(zhǎng)。缺乏直接和高效的CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)方法成為了CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用 的一大障礙。
[0004] 綜上所述，開(kāi)發(fā)一種直接高效的CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)工具和相應(yīng)檢測(cè)方法，是CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用過(guò)程中亟待解決的重要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有CAR-T細(xì)胞治療研發(fā)中缺乏直接高效的細(xì)胞毒性檢測(cè)方 法的不足，提供一種CAR-T細(xì)胞毒性指示載體。該指示載體為重組慢病毒載體，且含有CAR-T 可識(shí)別的腫瘤相關(guān)靶抗原基因和熒光素酶基因，使用此載體包裝慢病毒，篩選到CAR-T細(xì)胞 毒性指示細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞裂解后釋放出熒光素酶，熒光素酶活力值和指示細(xì) 胞數(shù)目相關(guān)。當(dāng)CAR-T細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞混合后，指示細(xì)胞表達(dá)的腫瘤相關(guān)靶 抗原能夠靶向引導(dǎo)CAR-T進(jìn)行結(jié)合，并裂解指示細(xì)胞，釋放熒光素酶。由于裂解細(xì)胞位于上 清中，未裂解細(xì)胞位于沉淀中，因此通過(guò)檢測(cè)上清和沉淀中的熒光素酶活力值，可得推算裂 解和未裂解細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算裂解細(xì)胞比例，指示CAR-T細(xì)胞毒性。
[0006] -個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，所述的CAR-T細(xì)胞毒性指 示載體為一種重組慢病毒載體，所述的重組慢病毒載體由原始慢病毒載體和插入序列組 成。
[0007] 所述的原始慢病毒載體可以為 Plent-EFla-Blasticidin-CMV、Plent-EFla-Pur〇-CMV 或 Plent-EFla-Neo-CMV，優(yōu)選為 Plent-EFla-Puro-CMV 或 Plent-EFla-Neo-CMV，進(jìn)一步 優(yōu)選為 Plent-EFla-Puro-CMV0
[0008] 所述的插入序列從5'端到3'端依次為腫瘤相關(guān)靶抗原編碼基因、2A肽編碼基因和 熒光素酶編碼基因。
[0009] 所述的腫瘤相關(guān)靶抗原優(yōu)選為CD分子。所述的CD分子可以為CD3、CD20、CD19、 CD22、CD33、CD70 或 CDl 23，優(yōu)選為 CDl 9、CD20 或 CDl 23，進(jìn)一步優(yōu)選為 CDl 9。
[0010] 所述的2A肽的功能是將腫瘤相關(guān)靶抗原編碼基因和熒光素酶編碼基因連接起來(lái)， 使二者通過(guò)同一個(gè)啟動(dòng)子CMV表達(dá)，但最終形成兩個(gè)不融合的蛋白，讓二者分開(kāi)行使各自功 能。所述的2A肽可以為T(mén)2A、F2A或P2A;優(yōu)選為F2A或P2A;進(jìn)一步優(yōu)選為P2A。
[0011] 所述的P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述的P2A編碼基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 所述的焚光素酶優(yōu)選為NanolucSlLucif erase，但并不局限于Nanoluc51 Lucif erase。
[0013] 所述的Nanoliic81Luciferase編碼基因如SEQ ID NO:3所示。
[0014] 另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞，其特征在于：所述的 CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞中含有上述CAR-T細(xì)胞毒性指示載體;所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示 細(xì)胞是使用本發(fā)明所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體裝慢病毒并篩選到的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞為含有上述CAR-T細(xì)胞 毒性指示載體的HEK293細(xì)胞。
[0016] 再一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 一種利用上述CAR-T細(xì)胞毒性指示載體或CAR-T細(xì)胞毒 性指示細(xì)胞進(jìn)行CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)的方法，其特征在于:所述的檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0017] (1)包裝CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，獲得病毒顆粒；
[0018] (2)使用步驟（1)獲得的病毒顆粒感染細(xì)胞，獲得CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn) 細(xì)胞；
[0019] (3)檢測(cè)步驟(2)得到的CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的熒光素酶活力值， 根據(jù)熒光素酶活力值和指示細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0020] (4)將待檢測(cè)的CAR-T細(xì)胞和步驟(2)得到的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞混合孵育后，分別收集上清 和沉淀，檢測(cè)上清和沉淀中的熒光素酶活力值，根據(jù)步驟(3)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別推算上清 和沉淀中的細(xì)胞數(shù)目，按下式計(jì)算裂解細(xì)胞比例，指示CAR-T細(xì)胞毒性；
[0021] 被裂解的細(xì)胞比例=上清細(xì)胞數(shù)/(上清細(xì)胞數(shù)+沉淀細(xì)胞數(shù)）。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體、CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì) 胞以及相應(yīng)的CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)方法更加直接、高效、快速、穩(wěn)定。本發(fā)明提供的CAR-T細(xì) 胞毒性指示載體使用慢病毒載體作為原始載體，可根據(jù)具體需要使用原核宿主進(jìn)行大規(guī)模 制備或使用真核細(xì)胞構(gòu)建指示細(xì)胞，工業(yè)化生產(chǎn)前景優(yōu)異。眾所周知，不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞 合成的腫瘤相關(guān)靶抗原的種類(lèi)和數(shù)量不同，本發(fā)明提供的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體可根據(jù) 具體需要裝載不同的腫瘤相關(guān)靶抗原編碼基因，用于檢測(cè)針對(duì)不同類(lèi)型腫瘤的CAR-T細(xì)胞 毒性，靈活性和特異性更加優(yōu)異。利用本發(fā)明提供的CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 只需三步即可獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)CAR-T細(xì)胞毒性情況的分析;在將CAR-T細(xì)胞和靶細(xì)胞 (即本發(fā)明提供的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)混合后，僅需10-18左右小時(shí)即可進(jìn)行測(cè)定，比常規(guī)方法的相應(yīng) 步驟所需時(shí)間縮短2倍以上;并且檢測(cè)穩(wěn)定性高，多次平行檢測(cè)結(jié)果間無(wú)明顯差異。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為實(shí)施例3中的CD19單克隆抗體免疫熒光染色結(jié)果。
[0024]圖2為實(shí)施例4步驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖3為實(shí)施例4中裂解細(xì)胞比例的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì) 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施 例的下述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改 對(duì)本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本 發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示 的這些實(shí)施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的更寬的范 圍。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材 料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0027] 除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。
[0028] 術(shù)語(yǔ)：
[0029] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"CD19-P2A-K_luc?Luciferase"指從5'端到3'端依次為CD19編 碼基因、P2A編碼基因和N an〇lwc?Luc if erase編碼基因的核苷酸序列，其中⑶19的編碼基因 的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，P2A編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示， 施勘lu#Luciferase編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；術(shù)語(yǔ)叩161^?1€[-?1^0-CMV-CD 19-P2A-_i_iue?Luciferase" 指插入了 CDl9-P2A-K.a:n_ie_Luciferase序列的 Plent-EFla-Puro-CMV慢病毒載體；術(shù)語(yǔ)"ddH20"指雙蒸水；術(shù)語(yǔ)"FBS"指胎牛血清；術(shù)語(yǔ) "ΡΕΓ指聚乙烯亞胺。
[0030] 本發(fā)明中，Plent-EFla-Puro-CMV載體、助感染試劑ADV-HR購(gòu)自維真生物科技有限 公司；限制性?xún)?nèi)切酶As i s I和MluI、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Axygen公司；發(fā)光檢測(cè)儀、Nano-Glo?焚光素酶檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Promega公司;K562細(xì)胞和 HEK293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；PMD2G質(zhì)粒和PSPAX2質(zhì)粒購(gòu)自 Invitrogen公司；裂解液為Nano-Glo?Luciferase Assay，購(gòu)自Promega公司。
[0031 ]核苷酸序列合成委托金斯瑞生物科技有限公司完成。
[0032]實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 (例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或 者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0033]實(shí)施例1構(gòu)建CAR-T細(xì)胞毒性指示載體
[0034] (1)合成⑶19-P2A-N.aii0luc?:Luciferase序列，并在上下游分別引入Asis I和MluI 酶切位點(diǎn)；
[0035] (2)酶切Plent-EFla-Puro-CMV載體和步驟（1)得到的含有Asis I和MluI酶切位點(diǎn) 的⑶19-P2ANanoluc*Luciferase序列，酶切體系如下： 成分 體積
[0036] -- CD19-P2A-Nanoiuek Lucift、n]se (CMiUgzsUL) IOuL 或 Plent-ETl(X-Pun)-CMV 載體 IOx Buffer 3μL ▲sis I 1μ^
[0037] -- MluI ΙμL ΜΗ2Ο 15 共計(jì)
[0038] 加樣加樣混勻后置于37°C酶切3h，反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切酶 切后的 CDl 9-P2A_Nano luc Luc if erase序列和 Plent-EF la-Puro-CMV載體，并用DNA 凝膠回 收試劑盒回收酶切后的CDl 9_P2A-Nanotoe? Luc if erase 序列和 Plent-EFla-Puro-CMV載體；
[0039] (3)將Asis I和MluI酶切后的CD19-P2A-Nam)丨uc卩 Luciferase序列和Plent-EFla-Puro-CMV載體于22°C連接2小時(shí)，連接體系如下， 成分 體積 CDl9-P2A-Niinoluc'' Luciferase 6μL Plent-EFla-Puro-CMV 載體 2μL
[0040] ---- 1〇χΤ4 Butter ΙμL Τ4 DNA連接酶 IpL 共計(jì) WpL
[0041 ]連接產(chǎn)物采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，使用含有l(wèi)OOyg/mL氨芐青霉 素的LB平板上進(jìn)行涂布培養(yǎng)，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證序列準(zhǔn)確 性，得到 CAR-T 細(xì)胞毒性指示載體 Plent-EFla-Pur〇-CMV-CD19-P2A-NanolucELuciferase〇
[0042]實(shí)施例2包裝慢病毒
[0043] (1)將細(xì)胞生長(zhǎng)量為IOcm培養(yǎng)盤(pán)最大負(fù)載量的90%以上的HEK293T細(xì)胞按1:3的比 例傳至IOcm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)(每盤(pán)細(xì)胞數(shù)約為2.5X106)，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小 時(shí)；獲得待轉(zhuǎn)染細(xì)胞；1: 3的比例指1個(gè)10cm培養(yǎng)盤(pán)的細(xì)胞，平均傳代到三個(gè)同樣的培養(yǎng)盤(pán) 里；
[0044] (2)轉(zhuǎn)染前換液，對(duì)步驟(1)獲得的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞用電動(dòng)移液器更換5ml含10 %FBS的 DMEM培養(yǎng)基，獲得轉(zhuǎn)染前細(xì)胞；
[0045]按下表配制轉(zhuǎn)染試劑：
[0048] 將試劑1和2分別配置好，室溫放置5-10分鐘后；將試劑1和2混合均勻，室溫放置 15-30分鐘后，得到試劑3;將試劑3逐滴加入轉(zhuǎn)染前細(xì)胞中，操作保持穩(wěn)定，使轉(zhuǎn)染體系均勻 分布于IOcm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，然后置于37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，用電動(dòng)移液器更換 5ml含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基;48小時(shí)后，收取轉(zhuǎn)染體系上清培養(yǎng)基，將上清培養(yǎng)基過(guò)0.22μπι 濾膜后，超速離心濾液，棄上清，將沉淀重懸于Iml TBS緩沖液中，獲得慢病毒顆粒。
[0049] 實(shí)施例3制備CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞
[0050] 感染實(shí)驗(yàn)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行，簡(jiǎn)述感染步驟如下：
[0051] (1)慢病毒感染
[0052]在6孔板中，使用助感染試劑ADV-HR和實(shí)施例2所得的慢病毒顆粒感染Κ562細(xì)胞， 按照感染復(fù)數(shù)為MOI = IO計(jì)算慢病毒顆粒用量，感染過(guò)程中每隔一天用DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞 進(jìn)行換液，維持細(xì)胞濃度在0.5-2 X IO6AiL。
[0053] (2)抗性篩選
[0054]感染72小時(shí)后，開(kāi)始進(jìn)行抗性篩選：
[0055]使用濃度為2yg/mL的嘌呤霉素經(jīng)過(guò)14天篩選，獲得具有嘌呤霉素抗性的多克隆細(xì) 胞株，使用濃度為2yg/mL的嘌呤霉素進(jìn)一步篩選得到單克隆細(xì)胞株，對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行 CD19單克隆抗體免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定，染色結(jié)果如圖1所示，顯示單克隆細(xì)胞株CD19表 達(dá)陽(yáng)性率100%，將⑶19表達(dá)為陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)盤(pán)并凍存，得到CAR-T細(xì)胞毒性指示 細(xì)胞HEK-CD19-nan。Iuc。
[0056] 實(shí)施例4CAR-T細(xì)胞毒性的檢測(cè)
[0057] (1)按照10、100、1000、10000和100000的細(xì)胞數(shù)目取實(shí)施例3所得的指示細(xì)胞HEK- CD19-nanoluc，分別于IOOyL裂解液中裂解30分鐘，使用Nano-Glo?熒光素酶檢測(cè)試劑盒和 發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)各個(gè)裂解液中的熒光素酶活力值，測(cè)定結(jié)果如下表所示，以指示細(xì)胞數(shù)目 對(duì)熒光素酶活力值作圖，得到如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0059] (2)將待測(cè)CART-19效應(yīng)細(xì)胞與實(shí)施例3所得的指示細(xì)胞HEK-CD19-nanoluc按照細(xì) 胞數(shù)目比CART-19:HEK-CD19-nanoluc分別為10:1、2:1、和1:2混合，孵育18小時(shí)后，2000代€ 離心5min，分別收集上清和沉淀，使用Nano-Glo?熒光素酶檢測(cè)試劑盒和發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)上 清和沉淀中的熒光素酶活力值，利用步驟(1)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算上清和沉淀中的細(xì)胞數(shù) 目，按照下式計(jì)算被裂解的細(xì)胞比例，裂解細(xì)胞比例結(jié)果如圖3所示。
[0060] 被裂解的細(xì)胞比例=上清細(xì)胞數(shù)/(上清細(xì)胞數(shù)+沉淀細(xì)胞數(shù)）。
[0061] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，其特征在于:所述的指示載體為一種重組慢病毒載 體，所述的重組慢病毒載體由原始慢病毒載體和插入序列組成。2. 如權(quán)利要求1所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，其特征在于:所述的原始慢病毒載體 為Plent-EFla-Blasticidin-CMV、Plent-EFla-Pur〇-CMV或Plent-EFla-Ne〇-CMV 〇3. 如權(quán)利要求1所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，其特征在于:所述的插入序列從5'端 到3'端依次為腫瘤相關(guān)靶抗原編碼基因、2A肽編碼基因和熒光素酶編碼基因。4. 如權(quán)利要求3所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，其特征在于:所述的腫瘤相關(guān)靶抗原 為⑶分子;所述的⑶分子為⑶3、⑶20、⑶19、⑶22、⑶33或⑶70;優(yōu)選為⑶19、⑶20或⑶123。5. 如權(quán)利要求3所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，其特征在于:所述的2A肽為T(mén)2A、F2A或 P2A;優(yōu)選為F2A或P2A。6. -種CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞，其特征在于:所述的指示細(xì)胞中含有權(quán)利要求1-5任 意一項(xiàng)所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體。7. -種CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒包含權(quán)利要求1-5任意 一項(xiàng)所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體。8. -種CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒包含權(quán)利要求6所述的 CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞。9. 權(quán)利要求6所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞在制備CAR-T細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑中的應(yīng) 用。10. -種利用權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的CAR-T細(xì)胞毒性指示載體進(jìn)行CAR-T細(xì)胞毒 性檢測(cè)的方法，其特征在于:所述的檢測(cè)方法包括以下步驟： (1) 包裝CAR-T細(xì)胞毒性指示載體，獲得病毒顆粒； (2) 使用步驟(1)獲得的病毒顆粒感染細(xì)胞，獲得CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞； (3) 檢測(cè)步驟(2)得到的CAR-T細(xì)胞毒性指示細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的熒光素酶活力值，根據(jù) 熒光素酶活力值和指示細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4) 將待檢測(cè)的CAR-T細(xì)胞和步驟(2)得到的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞混合孵育后，分別收集上清和沉 淀，檢測(cè)上清和沉淀中的熒光素酶活力值，根據(jù)步驟(3)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別推算上清和沉 淀中的細(xì)胞數(shù)目，按下式計(jì)算裂解細(xì)胞比例，指示CAR-T細(xì)胞毒性； 被裂解的細(xì)胞比例=上清細(xì)胞數(shù)/(上清細(xì)胞數(shù)+沉淀細(xì)胞數(shù)）。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK106086078SQ201610537806
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月8日
【發(fā)明人】孫秀蓮, 李欣
【申請(qǐng)人】宜明細(xì)胞生物科技有限公司