專利名稱：細胞毒性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞毒性組合物，其是以基因重組的IgG抗體為有效成分，所述本發(fā) 明IgG抗體比天然來源抗體或者從CHO培養(yǎng)細胞制得的抗體具有更高的補體依賴性細胞毒 (CDC)活性。
背景技術(shù)：
抗體是被稱作免疫球蛋白的糖蛋白，在屬于淋巴細胞的B細胞中產(chǎn)生。作為抗體 的特性，可以識別特定的分子結(jié)構(gòu)(抗原)，且具有很高的結(jié)合能力，從而將入侵生物組織 的細菌和病毒等非自體蛋白排除，在對感染的防御中發(fā)揮重要作用(非專利文獻1)。
由來自單一抗體產(chǎn)生細胞的克隆制備得到具有均一的性質(zhì)的抗體(單克隆抗體) 成為了可能，以作為癌細胞和免疫疾病產(chǎn)生原因的特定抗原為靶標(biāo)的抗體藥物得到了實用 化。制備單克隆抗體時，通常采用的方法是從小鼠細胞獲得針對抗原的抗體，但對于人體給 藥，為了防止排斥反應(yīng)，有必要將恒定區(qū)等變?yōu)槿丝贵w的氨基酸序列。
抗體藥物由于具有很高的特異性，可以成為癌癥和自體免疫疾病的有效藥物(非 專利文獻幻，但是其缺點在于制造成本高，導(dǎo)致醫(yī)療費用增高。所以期待對其制造方法進 行改善，轉(zhuǎn)基因(基因重組)雞等動物工廠是研究低成本生產(chǎn)抗體的一個方案(專利文獻 1)。
此外，伴隨著實用化的抗體藥品臨床知識日漸豐富，發(fā)現(xiàn)其效果并非充分，有必要 研制出效果更好的抗體。為了提高抗體的藥效而研究增強其活性，不僅有利于提高藥效，而 且可以降低給藥量，從而有助于降低成本。
為了制造具有更高活性的抗體，通過基因重組技術(shù)改變抗體的糖鏈和氨基酸，從 胃胃 ι^δ Φ7(衣1 '! ! (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity :ADCC) 活性和補體依賴性細胞毒(complement-d印endent cytotoxicity :CDC)活性的方法進行 研究(專利文獻2)。已經(jīng)知道，通過除去結(jié)合于抗體Fc區(qū)域的N-糖苷鍵復(fù)合物糖鏈中的 巖藻糖，可提高ADCC活性的效果。此外還知道，在轉(zhuǎn)基因雞的卵清中產(chǎn)生的抗體，通過導(dǎo) 入基因的表達，其N-糖苷鍵復(fù)合物糖鏈中的巖藻糖含量低，所以ADCC活性高(非專利文獻 3)。
按照這樣的方法，通過人工改變糖鏈，可以提高ADCC活性，但是提高⑶C活性的實 用的方法還未知。如上所述，如果抗體Fc區(qū)域的N-糖苷鍵復(fù)合物糖鏈中不含有巖藻糖，可 以預(yù)測其ADCC活性高，但是在這種情況下，其CDC活性未必高。IgG抗體中存在子類，作為 抗體藥品，多采用藥效高，且可選擇性地與蛋白質(zhì)A結(jié)合從而容易被純化的IgGl。但是IgG3 抗體的⑶C活性較高，公知可以通過將IgGl抗體的一部分Fc區(qū)域替換為IgG3抗體的氨基 酸，人工制造出CDC活性提高的抗體藥物。但是這種在IgG子類間變換結(jié)構(gòu)的嵌合抗體在 天然中并不存在，可能會出現(xiàn)預(yù)期不到的副作用(抗原性)，所以期望在不改變抗體Fc區(qū)域 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的條件下提高CDC活性的技術(shù)。
⑶C活性對于高效率地排除靶細胞發(fā)揮重大作用，所以該活性高的IgG抗體，期待在抗癌或者被用作改善過敏反應(yīng)以及特異反應(yīng)性等自體免疫疾病的抗體藥品時具有良好 效果。CDC活性在非霍奇金淋巴瘤治療用抗體利妥昔單抗(rituximab)的抗癌作用機制中 發(fā)揮著很大的作用(非專利文獻4)，因此，在不改變天然氨基酸結(jié)構(gòu)的前提下以更低成本 制造具有高⑶C活性的IgG抗體技術(shù)，對于現(xiàn)代生活中高罹患率的癌癥患者和自體免疫疾 病患者而言是一個福音。
現(xiàn)有技術(shù)文獻
專利文獻
專利文獻1 :W02004/016081
專利文獻2 :W02007/011041
非專利文獻
非專禾丨J文獻 1 :Monoclonal Antibodies Principles and Applications, ffiley-Liss, Inc. (1995)
非專利文獻2 :Nature Reviews Cancer, 1,119(2001)
非專利文獻3 :Nature Biotechnology, 28,1038 (2005)
非專利文獻4 =Biochemi. Soc. Trans, 25 :705 (1997)發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
有必要提供在不改變天然蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的條件下，CDC活性和ADCC活性等與 治療效果有關(guān)機能提高的抗體組合物及其低成本制造方法。
解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入了編碼IgG抗體基因的轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)生的卵中蓄積的IgG抗 體，比CHO細胞來源的IgG抗體具有更高的CDC活性，從而完成了本發(fā)明。
換言之，本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)完成的，其包含以下發(fā)明。
(1). 一種細胞毒性組合物，其以抗體為有效成分，所述抗體是從導(dǎo)入了編碼IgG 抗體的基因的轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)出的卵中得到的。
(2).上述(1)中所述的細胞毒性組合物，其以從卵清得到的抗體為有效成分。
(3).上述⑴或O)中所述的細胞毒性組合物，其中，IgG抗體的恒定區(qū)是人源 IgG 類。
(4).上述⑴ (3)中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，轉(zhuǎn)基因鳥類是轉(zhuǎn)基 因家禽鳥類。
(5).上述⑴ (4)中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，抗體的N-糖苷鍵 復(fù)合物糖鏈中的巖藻糖含量為CHO細胞來源抗體的五分之一以下。
(6).上述⑴ (5)中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，抗體的CDC活性是 用CHO細胞產(chǎn)生的抗體的五倍以上。
(J).上述⑴ (6)中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，IgG抗體是識別在 癌細胞中特異性表達的抗原的抗體。
(8). 一種癌癥疾病的改善或治療劑，其含有上述(1) (7)中任意一項所述的細 胞毒性組合物。
(9).上述⑴ (6)中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，IgG抗體是中和或 抑制與自體抗原發(fā)生反應(yīng)的效應(yīng)器細胞的抗體。
(10). 一種自體免疫疾病的改善或治療劑，其含有上述⑴ (6)或者(9)中任意 一項所述的細胞毒性組合物。
發(fā)明效果
本發(fā)明的細胞毒性組合物以從導(dǎo)入了編碼IgG抗體的基因的轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)出的 卵中所產(chǎn)生的抗體為有效成分。該IgG抗體的CDC活性比CHO細胞來源的IgG抗體的CDC 活性更高，而且蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)相對于天然型未發(fā)生改變，可提供副作用少、療效高的抗體 藥物。另外，公知在轉(zhuǎn)基因雞的卵清中產(chǎn)生的抗體N-糖苷鍵復(fù)合物糖鏈中的巖藻糖含量較 少，由此也期待其ADCC活性高。⑶C活性和ADCC活性兩者都高，可以將靶細胞有效地破壞、 殺死或者失活。
進一步地，通過使用轉(zhuǎn)基因鳥類，在其卵中制造該IgG抗體，所以低成本制造該抗 體成為可能。
附圖簡要說明
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圖1]所示是關(guān)于本發(fā)明實施例9中，轉(zhuǎn)基因雞來源和CHO細胞來源的完全人源 抗TNF抗體對于表達TNF抗原的T細胞的致死活性(CDC活性)的示意圖。TG卵清抗體是 指由轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)的卵清中純化得到的完全人源抗TNF抗體。CHO抗體是指在CHO細胞中 制造的完全人源抗TNF抗體?？v軸表示FACS測定的靶細胞的死亡率。
發(fā)明的具體實施方式
本發(fā)明的細胞毒性組合物，是以從導(dǎo)入了編碼IgG抗體的基因的轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)出 的卵中得到的抗體為有效成分，通過該抗體的CDC活性、或者CDC活性和ADCC活性兩種活 性，可以對涉及某種疾病、疾患等的細胞加以破壞、殺死或者滅活的組合物。
關(guān)于用于制造轉(zhuǎn)基因鳥類的基因?qū)敕?，并無特殊限定，可以列舉病毒載體法、精 子載體法和使用PGC(原始生殖細胞)的方法。
考慮到安全性，本發(fā)明使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)選缺失復(fù)制能力。作為復(fù)制能力 的缺失方法，優(yōu)選的是通過使編碼序列或者表達必需序列的至少一部分或者全部缺失，或 者通過引入取代、嵌入變異而導(dǎo)致不能表達，使得病毒粒子復(fù)制所必需的內(nèi)核中包含的蛋 白質(zhì)(群特異性抗原，gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶(聚合酶，pol)和包膜糖蛋白(包膜(envelope) ,env) 中的任意一個或者其組合不被表達。
就逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而言，由于每個病毒可以嵌入的基因長度有限，所以優(yōu)選缺失 變異，從安全性和增加嵌入片段長度的觀點來看，優(yōu)選缺失gag、pol和env中的兩個或更多 個。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)選在病毒粒子中含有作為包裝標(biāo)記發(fā)揮作用的病毒組裝信號(Phi)。 gag區(qū)域的一部分有時作為病毒的包裝信號發(fā)揮作用，所以從提高病毒效價的觀點來看，病 毒載體優(yōu)選含有至少一部分不能被表達的gag區(qū)域。(J. Virol.，1987，61 (5)，1639-46)。
作為逆轉(zhuǎn)錄病毒，并無特殊限定，可以列舉莫羅尼小鼠白血病病毒、莫羅尼小鼠肉 瘤病毒以及鳥白血病病毒(ALV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)來源的病毒等。為了感染鳥類胚 胎，優(yōu)選使用小鼠肝細胞病毒(MSCV)和小鼠胚性肝細胞病毒(MESV)等對胚細胞和肝細胞 感染性較高的病毒。為了讓該病毒載體高效率地感染鳥類細胞，優(yōu)選人為地將包膜蛋白變 為牛水皰口炎病毒來源的VSV-G包膜蛋白質(zhì)，但是并不限于該病毒的類型。5
標(biāo)記基因是指編碼下述蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)用作鑒定和分離正確導(dǎo)入了基因 的細胞的標(biāo)記。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中也可以含有標(biāo)記基因。作為標(biāo)記基因，并無特殊限定，可 以列舉綠色熒光蛋白(GFP)和青色熒光蛋白(CFP)、熒光素酶等熒光蛋白質(zhì)基因，新霉素抗 性(NecZ)、潮霉素抗性(Hyg1O、嘌呤霉素抗性(Pure/)等抗藥性基因，其他還有胸苷激酶、二 氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、β -內(nèi)酰胺酶、β-半乳糖苷酶 等的基因。標(biāo)記基因優(yōu)選帶有啟動子基因和表達必需的要素。
外源性基因含有抗體蛋白質(zhì)的編碼序列，編碼序列的邊界由5，末端起始密碼子以 及起始密碼子對應(yīng)的3’末端終止密碼子決定。5’末端起始密碼子近傍優(yōu)選含有Kozak的 共有序列。編碼序列的上游優(yōu)選存在核糖體結(jié)合部位。為了在鳥類細胞內(nèi)表達，外源性基 因優(yōu)選含有至少一部分或者全部適當(dāng)?shù)膯幼踊?。所述啟動子基因，是指DNA或者RNA 上這樣的區(qū)域，其決定基因的轉(zhuǎn)錄起始部位，并直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的頻度。
抗體分子包含根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)相應(yīng)變化的結(jié)合區(qū)和變化較少的恒定區(qū)，根據(jù)恒定區(qū) 結(jié)構(gòu)不同，可以分為幾個種類(類別)。哺乳動物根據(jù)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)差異有IgG、IgE、IgA、IgM、 IgD五個種類，其生理活性也各不相同。IgA，IgG可以進一步分為亞類。
就抗體藥物而言，使用血中壽命長且效果好的IgGl類抗體，因此本發(fā)明中向轉(zhuǎn)基 因鳥類中導(dǎo)入的抗體基因優(yōu)選為IgGl類抗體的結(jié)構(gòu)基因。此外，從在轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)出卵 中的蓄積效率的觀點來看，IgGl類抗體也是優(yōu)異的。另外，由于在卵中的蓄積良好，具有人 IgG類恒定區(qū)的抗體的基因、具有人IgGl、鵪鶉IgG2、雞IgG2或小鼠IgG2亞類恒定區(qū)的抗 體的基因等外源性抗體結(jié)構(gòu)基因是優(yōu)選的。
作為其他優(yōu)選的抗體結(jié)構(gòu)基因，可以列舉種間嵌合抗體的結(jié)構(gòu)基因。在此所述種 間嵌合抗體，是指由2種以上不同生物物種的遺傳性狀構(gòu)成的同一 IgG亞類間的雜合抗體。 現(xiàn)有的通過小鼠雜交瘤細胞制造的醫(yī)療用抗體，由于是小鼠來源，所以存在給予人體內(nèi)時 導(dǎo)致免疫系統(tǒng)排斥反應(yīng)的問題。為了消除這個缺點，例如通過重組方法將小鼠(嚙齒目) 抗體Fc部分等人源化，從而可以大幅度降低排斥反應(yīng)的風(fēng)險。
作為上述種間嵌合抗體，可以列舉抗人CD2抗體、抗CD20受體抗體、抗TNF抗體 等，還有已經(jīng)作為藥品上市者。近年來，所有的氨基酸序列均來源于人抗體的完全人源抗體 作為藥品已經(jīng)實用化，這些完全人源抗體可以優(yōu)選作為本發(fā)明制造的抗體。
作為本發(fā)明的細胞毒性組合物的使用領(lǐng)域，考慮將其用作藥品。作為抗腫瘤劑和 癌癥疾患的改善或者治療劑，優(yōu)選含有可以識別在癌細胞中特異性表達的抗原，用于破壞 癌細胞的抗癌用途的抗體作為有效成分。癌細胞與正常細胞的結(jié)構(gòu)差異很少，所以難以特 異地除去，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其細胞表面存在特異性表達的抗原蛋白質(zhì)，所以通過抗體識別進 行診斷和治療已成為可能。
此外，作為本發(fā)明的細胞毒性組合物的有效成分，優(yōu)選治療自體免疫疾患的抗體， 該抗體中和或抑制與自體抗原反應(yīng)的效應(yīng)器細胞。在這種情況下，本發(fā)明的細胞毒性組合 物可以用作抗風(fēng)濕藥等自體免疫疾病的改善或治療劑。
這類抗體不僅需要能識別靶細胞，還需要使靶細胞的機能失活，此時發(fā)揮重要作 用的是上述的抗體依賴性細胞毒(ADCC)活性和補體依賴性細胞毒(CDC)活性。所述補體 依賴性細胞毒活性，是指與靶細胞結(jié)合后的抗體將補體系統(tǒng)活化，通過補體所具有的酶，有 效地溶解靶細胞的作用。根據(jù)近年來對抗體藥品的研究，已知補體依賴性細胞毒活性在抗癌作用的呈現(xiàn)中發(fā)揮了重大功效。
比CHO細胞中制造的IgG抗體等具有更高的補體依賴性細胞毒活性的單克隆抗 體，可以有效地破壞作為靶細胞的癌細胞，從而使給藥量降低，減小副作用，并提高患者的 QOL成為可能，此外，由于抑制了制造成本，所以可以減輕患者的負(fù)擔(dān)。當(dāng)抗體組合物的CDC 活性與CHO細胞中產(chǎn)生的抗體組合物相比是后者的5倍以上時，適用于本申請發(fā)明的細胞 毒性組合物。此外，抗體組合物的⑶C活性與CHO細胞中產(chǎn)生的抗體組合物相比是其10倍 以上時，更加適用于本發(fā)明的細胞毒性組合物。
抗體組合物的N-糖苷鍵復(fù)合物糖鏈的巖藻糖含量是CHO細胞來源抗體的五分之 一以下時適合使用，在十分之一以下時更加適合使用。
為了控制導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)基因的表達，使用組織特異性啟動子基因等。所述組織特異 性啟動子基因，是指在鳥類的特定組織或細胞中具有特別強活性的啟動子基因。通過使用 組織特異性啟動子基因，具有可以減少或者排除靶蛋白的表達對鳥類的發(fā)育和生存產(chǎn)生不 良影響的可能性的優(yōu)點。作為組織特異性啟動子基因，并無特殊限定，可以使用輸卵管特異 性啟動子基因。輸卵管組織在性成熟后較為活躍，所以多在性成熟后對其進行強烈誘導(dǎo)。
作為輸卵管特異性啟動子基因，可以列舉鳥類來源的卵清蛋白、卵運鐵蛋白、卵類 粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2球蛋白、G3球蛋白、卵(類粘蛋白)抑制劑、卵糖蛋白、卵黃素 蛋白、卵巨球蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、抗生物素蛋白的啟動子基因等。使用這些輸卵 管特異性啟動子基因時，靶蛋白能夠在卵清中高表達是特別優(yōu)選的。
其他的啟動子有組織非特異性啟動子。組織非特異性啟動子基因指不是組織特異 性啟動子基因的啟動子基因。組織非特異性啟動子基因并無特殊限定，是指在鳥類的幾乎 全部體細胞中均具有活性的啟動子基因。這種情況下，靶蛋白在血中也有表達，所以具有在 雛鳥階段可以檢出是否表達靶蛋白的優(yōu)點。組織非特異性啟動子基因并無特殊限定，可以 列舉β肌動蛋白啟動子基因、EFl α啟動子基因、胸苷激酶啟動子基因和猿病毒40 (SV40) 啟動子基因、巨細胞病毒(CMV)啟動子基因、呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子基因等。另外， 也可以使用四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子基因等組織非特異性誘導(dǎo)型啟動子基因。
外源性基因也可以含有轉(zhuǎn)錄增強子和/或調(diào)節(jié)元件。轉(zhuǎn)錄增強子是DNA或者RNA 上的區(qū)域，其為促進從啟動子基因轉(zhuǎn)錄的序列，但不能單獨地引起轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄增強子與不同 于固有機能啟動子的啟動子基因相連時大多也能發(fā)揮機能，所以并不限定其與啟動子基因 的組合。作為轉(zhuǎn)錄增強子，并無特殊限定，可以列舉SV40、CMV、胸苷激酶增強子、類固醇應(yīng) 答元件和溶菌酶增強子等。調(diào)節(jié)元件是有助于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄后的RNA穩(wěn)定化，而單獨 不會引起轉(zhuǎn)錄的DNA或者RNA上的區(qū)域。作為調(diào)節(jié)元件并無特殊限定，可以列舉WPRE ( 土 撥鼠肝炎病毒來源的調(diào)節(jié)元件、美國專利6136597號公報)等。
此外，外源性基因可以含有上述以外的非翻譯區(qū)域。
利用包裝細胞或者輔助病毒等制備的假型病毒載體，按照通常的顯微注射法 (Bosselman, R. A等、Science 243，533 (1989))，導(dǎo)入至初期胚胎、血管內(nèi)及心臟內(nèi)。除此之 外，還可以考慮脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法等基因?qū)敕?，但考慮到操作性和高導(dǎo)入效率，優(yōu) 選顯微注射法。
外源性基因并無特殊限定，不但可以是鳥類以外的基因，也可以包括鳥類基因。即 使是制造轉(zhuǎn)基因所用的個體具有的序列，但由于是在個體本來所具有的全部基因的基礎(chǔ)上另外引入基因，所以稱作外源性基因。
復(fù)制能力缺失型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所感染的胚胎優(yōu)選是從孵化開始經(jīng)過M小時以 上的胚胎。更優(yōu)選從孵化開始32小時以后且72小時以前的胚胎。更優(yōu)選48小時以后且 64小時以前的胚胎。感染部位即導(dǎo)入病毒液的部位優(yōu)選心臟內(nèi)或者血管內(nèi)。在制造基因?qū)?入效率高的GO轉(zhuǎn)基因嵌合體鳥類時，優(yōu)選在可以觀察到心臟跳動的初期階段(從心臟開始 跳動起6小時以內(nèi))導(dǎo)入基因。這是出于下面兩點考慮基因隨血流運至全身，而且細胞數(shù) 目不多。
顯微注射是在顯微鏡下使用前端細小的微小玻璃管等向特定部位直接導(dǎo)入病毒 液的方法。在本研究中向心臟或血管等特定部位導(dǎo)入病毒液，所以其優(yōu)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和 電穿孔法等其他基因?qū)敕ā?br> 作為本發(fā)明中所使用的鳥類并無特殊限定，優(yōu)選可以作為家養(yǎng)動物利用的家禽鳥 類。作為家禽鳥類，可以列舉雞、火雞、野鴨、鴕鳥、鵪鶉、鴨子等。其中雞較為容易得到，作 為產(chǎn)卵禽的產(chǎn)量高，卵大，且大量飼養(yǎng)方法已經(jīng)確立，因此是特別優(yōu)選的。
將生殖細胞中保有外源性基因的GO轉(zhuǎn)基因嵌合體鳥類與野生型鳥類或者GO轉(zhuǎn)基 因嵌合體鳥類或者其后代交配，可以通過篩選孵化后的雛鳥，得到Gl轉(zhuǎn)基因鳥類。就GO轉(zhuǎn) 基因嵌合體鳥類而言，其全部細胞均導(dǎo)入外源性基因的效率較低，在大多數(shù)情況下均為導(dǎo) 入了外源性基因的細胞與野生型細胞這兩種不同基因型的細胞共存的嵌合體狀態(tài)。另一方 面，對于Gl轉(zhuǎn)基因鳥類而言，優(yōu)選所有的體細胞均一地保有導(dǎo)入的基因。體細胞或生殖細 胞中基因的導(dǎo)入，可以使用PCR法等對血液、體細胞、精子或卵子來源的DNA或RNA進行檢 測來加以確認(rèn)。此外，也可以依據(jù)靶蛋白的表達來判斷?？梢酝ㄟ^ELISA法、電泳法、靶蛋 白的活性測定等考察靶蛋白的表達。
G2代以后的轉(zhuǎn)基因鳥類可以通過使Gl轉(zhuǎn)基因鳥類交配得到。交配型可以通過Gl 轉(zhuǎn)基因雄性和野生型雌性、Gl轉(zhuǎn)基因雌性和野生型雄性、Gl轉(zhuǎn)基因雄性和雌性等得到，也 可以將后代與其親代進行回交。其中，對于Gl雄性和野生型雌性的交配型，1只Gl雄性可 以與多個野生型雌性交配，所以從效率上說是優(yōu)選的。
本發(fā)明的靶蛋白生產(chǎn)方法以從上述的轉(zhuǎn)基因鳥類中回收靶蛋白為特征。具體而 言，其特征在于從制得的轉(zhuǎn)基因鳥類的血液和/或卵中提取并純化因子。
純化的特征在于，使用純水或者平衡鹽類溶液將轉(zhuǎn)基因鳥類的卵特別是卵清成分 稀釋，將所得的溶液通過柱法或過濾法進行純化。稀釋可以降低卵清的粘度，為了使柱法能 夠順利進行，期望高倍稀釋從而降低粘度，但另一方面體積增加導(dǎo)致回收困難，因此優(yōu)選稀 釋2倍至10倍，更優(yōu)選5倍至6倍。
為了從卵清溶液中回收目標(biāo)抗體組合物，可以通過單獨使用或者組合使用蛋白A 柱法、鹽析法、吸附柱色譜法、離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、抗體柱法純化，但并 不僅限定于上述方法。作為吸附柱色譜法，有Blue kpharose色譜法、肝素色譜法等，作為 離子交換柱法，有陰離子交換色譜法等。
實施例
以下，以抗TNF抗體為例，演示與CHO細胞來源的IgG抗體相比，由轉(zhuǎn)基因鳥類卵 中制得的IgG抗體具有很高的CDC活性。但是，本發(fā)明并不限定于所述實施例。
關(guān)于基因操作，若無特殊說明，按照代表性方法進行(J. Samnrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis ；Molecular Cloning, A Laboratry Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory)。關(guān)于細胞培養(yǎng)，若無特殊說明，按照代表性方法進行。記載有商品名的情況 下，若沒有特殊記載，按照附錄的說明書指示進行。
(實施例1)完全人源抗TNF抗體表達質(zhì)粒pMSCV/GΔ ALIH (HUMIRA (R))的構(gòu)建
JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING，Vol. 98，No. 4，298-303，2004 中公 開 了 抗人 CD2 抗體 pMSCV/G Δ ALIH (CD2)。
基于公開的序列信息，化學(xué)合成了完全人源抗TNF抗體(阿達木單抗 (Adalimumab) ； HUMIRA (R)的全堿基序列。將其替換 pMSCV/G Δ ALIH (CD2)的 CD2 序列，得 至Ij pMSCV/G Δ ALIH (HUMIRA (R))。
(實施例2)使用pMSCV/GΔ ALIH (HUMIRA (R))和pVSV-G制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
下文若無特殊說明，培養(yǎng)基使用含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、 50單位/ml的青霉素以及鏈霉素的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, DMEM) (Gibco公司制造)。在37°C、C02 5%條件下進行培養(yǎng)。在純化逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體使用的質(zhì)粒DNA時，選用Endo Free Plasmid Maxi Kit (QIAGEN公司制造)。
為了通過實施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pMSCV/G Δ ALIH (HUMIRA (R))制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體，將帶有g(shù)ag、pol基因的包裝細胞GP293接種在膠原包被的直徑IOOmrn的培養(yǎng)皿中，使 其細胞數(shù)為5X IO6個/皿(70%鋪滿)(使得第二天達到90%鋪滿)。次日，除去培養(yǎng)基， 加入7. 2ml培養(yǎng)基和10 μ 1的25mM的氯喹(Sigma公司制造)，繼續(xù)培養(yǎng)1小時。將56 μ 1 的 Lipofectamine2000 溶液(Invitrogen 公司制造)懸浮于 1. 4ml 的 Opti-MEMI 培養(yǎng)基 (Gibco公司制造)中，室溫下靜置5分鐘。將12 μ g的pMSCV/G Δ ALIH (HUMIRA (R))和12 μ g 的pVSV-G懸浮于1. 4ml的Opti-MEMI培養(yǎng)基中?；旌螸ipofectamine 2000溶液和質(zhì)粒 DNA溶液，室溫下放置20分鐘。將其全部加入至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6小時。6小時后，除去培 養(yǎng)基，加入9ml的培養(yǎng)基和200μ 1的1MHEPES Buffer Solution (Gibco公司制造)，進一步 培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)上清液通過0. 45 μ m的醋酸纖維素濾膜(Advantec公司制造)，收集至離心 管中。使用超速離心機CS100GXL(日立工機公司制造)，以28，OOOrpm(50, 000g)離心分離 1. 5小時。除去上清液，向沉淀中加入20 μ 1的TNE緩沖液(50mM Tris-HCl (ρΗ7· 8)、130mM NaClUmM EDTA)在4°C條件下靜置一晚，充分懸浮后，使用小型高速離心機，以12，OOOrpm 離心分離1分鐘，將上清液通過0. 45 μ m的Durapore Ultrafree濾膜(Advantec公司制 造)，以該濾液作為病毒液。
(實施例3)病毒效價的測定
病毒液效價是根據(jù)向NIH3T3細胞(ATCC CRL-1658)中添加病毒液后感染的細胞 數(shù)目來定義的。將6孔培養(yǎng)板的各孔(底面積約為9. km2)中存在的5X104的NIH3T3細 胞中加入以IO2至IO6倍稀釋率稀釋的病毒溶液1ml，通過測定表達作為標(biāo)記的GFP (Green Fluorescent Proteins)基因的細胞比例，來測定病毒液的效價。稀釋IO6倍以后，呈現(xiàn)4 個集落時，病毒效價為4X106cfu/ml。
具體而言，在開始測定效價的前一天，向6孔培養(yǎng)板中接種5X IO4個/孔的NIH3T3 細胞并培養(yǎng)。第二天，用含有9 μ g/ml聚凝胺(polybrene)的培養(yǎng)基以900 μ 1/孔來更換 細胞培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基將病毒液稀釋至KT1 10_5，然后分別添加100 μ 1至各孔進行感染(聚凝胺的終濃度為8yl/ml)。培養(yǎng)4 6小時后，再加入Iml培養(yǎng)基。次日，更換培養(yǎng)基， 以后每3 4天更換一次培養(yǎng)基。感染約1周后，測定表達GFP的集落數(shù)，求出效價。
(實施例4)完全人源抗TNF抗體表達穩(wěn)定的包裝細胞的選擇
在病毒感染的前一天，向M孔培養(yǎng)板中接種1. 5Χ IO4個/孔的GP293細胞并培 養(yǎng)。病毒感染當(dāng)天，更換為Iml/孔的含有10 μ g/ml聚凝胺的培養(yǎng)基。然后向其中感染上 文實施例2中制得的病毒液。然后，將細胞按照有限稀釋法克隆化。具體而言，次日，將細 胞稀釋至10個/ml。將稀釋后的細胞以100 μ 1的接種量分別接種至96孔培養(yǎng)板中(1個 孔中1個細胞)，選擇細胞增殖速度快、與GP293細胞形態(tài)接近的細胞，得到完全人源抗TNF 抗體表達穩(wěn)定的包裝細胞的克隆。
(實施例5)使用完全人源抗TNF抗體表達穩(wěn)定的包裝細胞和pVSV-G的逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體的制備
向直徑為IOOmm的膠原包被的培養(yǎng)皿中接種完全人源抗TNF抗體表達穩(wěn)定的包 裝細胞5X IO6個(70 %鋪滿)(使得第二天達到90%鋪滿)。第二天，除去培養(yǎng)基，加入 7. 2ml培養(yǎng)基和10 μ 1的25mM的氯喹(Gigma公司制造)，繼續(xù)培養(yǎng)1小時。將56 μ 1的 Lipofectamine 2000溶液懸浮于1. 4ml的Opti-MEMI培養(yǎng)基中，室溫下靜置5分鐘。將 12 μ g的pVSV-G懸浮于1. 4ml的Opti-MEMI培養(yǎng)基中。混合Lipofectamine 2000溶液和 質(zhì)粒DNA溶液，室溫下放置20分鐘。將其全部加入至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6小時。6小時后，除 去培養(yǎng)基，加入9ml的培養(yǎng)基和200 μ 1的IM HEPES Buffer Solution(Gibco公司制造)， 培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)上清液通過0. 45 μ m的醋酸纖維素濾膜，將濾液收集至離心管中。使用超 速離心機，以28，OOOrpm(50, OOOg)離心分離1. 5小時。除去上清液，向沉淀中加入20 μ 1 的TNF緩沖液，在4°C條件下靜置過夜，充分懸浮后，使用小型高速離心機，以12，OOOrpm離 心分離1分鐘，將上清液通過0. 45 μ m的Durapore Ultrafree濾膜(Advantec公司制造)， 將該濾液作為病毒液。按照上述方法，可以得到效價為108CfU/ml以上的病毒液。
(實施例6)通過向雞胚中顯微注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和人工孵化從而制備產(chǎn)生完 全人源抗TNF抗體的轉(zhuǎn)基因雞
顯微注射和人工孵化在無菌條件下進行。使用消毒液(SHOWA FURANKI公司制造) 和乙醇對雞受精卵(城山種雞場)的外側(cè)進行除菌。將P-008(B)型孵化機(SHOWA FURANKI 公司制造)設(shè)置為38°C、濕度50 60%的環(huán)境，將接通電源的時刻作為孵化開始時刻(0 小時)，以后每15分鐘將卵轉(zhuǎn)動90°進行孵化。
從孵化開始經(jīng)過約55小時后，孵化機的轉(zhuǎn)卵改為每30分鐘轉(zhuǎn)卵30°。將卵 從孵化機取出，使用帶有鉆石刀(刀尖徑20mm、軸徑2. 35mm)的小型車床(minirouter) (PR0XX0N公司制造)以直徑為3. 5cm的圓形切取其尖端部。以直徑為4. 5cm的圓形切取 雞雙黃卵(城山種雞場)的尖端部，將受精卵內(nèi)容物移至舍去內(nèi)容物的卵殼中，使用注射器 的內(nèi)筒使胚胎向上移動。在立體顯微鏡系統(tǒng)SZX12(奧林巴斯公司制造)下，向femto芯片 II (Eppendorf公司制造)中注入病毒液，使用!^emtoJet (Eppendorf公司制造)顯微注射約 2μ1的病毒溶液。將卵清制成糊，使用切割成約8X8cm2的保鮮膜(Saran wrap)(旭化成 公司制造)將該穴塞住，重新放入孵化機中繼續(xù)孵化。從孵化開始至第20天，使用20G的 注射針在保鮮膜上打開20個左右的孔穴，并以60CC/min的速度向孵化機中供氧。一旦雛鳥開始破卵，即將卵殼割碎，使其孵出。該人工孵化的孵化率是7 30%。
(實施例7)從轉(zhuǎn)基因雞卵中獲取IgG抗體
飼養(yǎng)誕生的雛雞使其成長。作為飼料，使用幼雛S X Mfety和ne0Safetyl7(豐 橋飼料公司制造)。從該轉(zhuǎn)基因雞的卵中提取IgG抗體是用卵清進行的。使用超聲波或物 理方法對卵清進行前處理使其整體均一化。使用蛋白A柱采用通常的柱純化法制備IgG抗 體。制備好的IgG抗體在測定之前，一直在-80°C條件下冷凍保存。解凍優(yōu)選在37°C迅速 進行，避免反復(fù)凍融。
(實施例8)使用ELISA法定量免疫球蛋白分子的濃度
為了測定實施例7中制備的卵清中IgG抗體的表達量，采用酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)法。抗體的產(chǎn)量通過測量中使用的標(biāo)準(zhǔn)品算出。
測定方法依照代表性的方法(Immunochemistry，8，871-874(1971))。
使用兔抗人IgG (Fe 特異性)抗體(Organon Teknika, Durham, NC, USA)作為第一 抗體，使用過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG抗體(Organon Teknika, Durham, NC, USA)作為第 二抗體。使用鄰苯二胺作為檢出底物而顯色，采用酶標(biāo)儀測定吸光度。使用人IgGl (Athens Research and Technology, Athens, GA, USA)作為定量時的標(biāo)準(zhǔn)。
(實施例9)由實施例1 7制備的轉(zhuǎn)基因雞卵清來源的完全人源抗TNF抗體的 CDC活性和在CHO細胞中制備的完全人源抗體的CDC活性的比較。
以5X105/孔的濃度向M孔板中加入Iml表達TNF抗原的T細胞(Jurkat細 胞(ATCC No. TIB-152)或者 Raji 細胞(ATCC No. CCL-86))，再分別加入 10 % 人血清 RPMI 1640(日水公司制造)、0. 01,0. 1、1、10μ g/ml的抗體樣品，在37°C條件下培養(yǎng)3小時 后，使用PI (碘化丙錠)染色，采用FACS (熒光活化細胞分選)測定活細胞數(shù)目。按照下述 方法計算出靶細胞的死亡率。
靶細胞的死亡率=(全部細胞數(shù)目-活細胞數(shù)目)/全部細胞數(shù)目(％)
如圖1所示，與CHO細胞來源的完全人源抗TNF抗體相比，轉(zhuǎn)基因雞卵清來源的完 全人源抗TNF抗體在1/10的濃度下顯示了相同程度的靶細胞致死效果，由此可知其具有 10倍的⑶C活性。此外，作為CHO細胞來源的完全人源抗體，使用的是市售的阿達木單抗 (adalimumab 商品名 HUMIRA(R))。1權(quán)利要求
1.一種細胞毒性組合物，其以從轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)出的卵中得到的抗體為有效成分，所述 轉(zhuǎn)基因鳥類導(dǎo)入有編碼IgG抗體的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細胞毒性組合物，其以從卵清得到的抗體為有效成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的細胞毒性組合物，其中，IgG抗體的恒定區(qū)是人源IgG類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，轉(zhuǎn)基因鳥類是轉(zhuǎn)基因 家禽鳥類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，抗體的N-糖苷鍵復(fù) 合物糖鏈中的巖藻糖含量為CHO細胞來源抗體的五分之一以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，抗體的CDC活性是用 CHO細胞產(chǎn)生的抗體的五倍以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，IgG抗體是識別在癌 細胞中特異性表達的抗原的抗體。
8.—種癌癥疾病的改善或治療劑，其含有權(quán)利要求1 7中任意一項所述的細胞毒性 組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任意一項所述的細胞毒性組合物，其中，IgG抗體是中和或抑 制與自體抗原發(fā)生反應(yīng)的效應(yīng)器細胞的抗體。
10.一種自體免疫疾病的改善或治療劑，其含有權(quán)利要求1 6或者9中任意一項所述 的細胞毒性組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細胞毒性組合物，其以從轉(zhuǎn)基因鳥類產(chǎn)出的卵中得到的抗體為有效成分，所述轉(zhuǎn)基因鳥類導(dǎo)入有編碼IgG抗體的基因。該IgG抗體的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，其呈現(xiàn)出比CHO細胞來源的IgG抗體更高的CDC活性，可望具有高抗腫瘤效果且副作用少。此外，本發(fā)明提供含有該細胞毒性組合物的癌癥改善或治療劑，或者抗自體免疫疾病的治療劑。
文檔編號A61K39/395GK102036683SQ20098011859
公開日2011年4月27日 申請日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者山下敬 申請人:株式會社鐘化