專利名稱：：利用栗精胺提高抗體依賴性細(xì)胞毒性的方法利用栗精胺提高抗體依賴性細(xì)胞毒性的方法相關(guān)申請的交叉參考利用免疫藥物除去靶細(xì)胞群是許多征兆中的重要治療干細(xì)胞裂解、凋亡信號傳導(dǎo)通路的激活、存活所需的信號傳導(dǎo)通路的阻斷以及抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC),也被稱作Fc依賴性細(xì)胞毒性。ADCC是有效的機(jī)制，這被認(rèn)為對于許多免疫藥物的效力而言是重要的。00041ADCC激活的機(jī)制包括Fc受體結(jié)合免疫藥物分子，其中免疫藥物分子結(jié)合到靶細(xì)胞的表面。Fc受體與免疫藥物的結(jié)合可以被免疫球蛋白的恒定區(qū)中的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，例如CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。不同類型的恒定區(qū)可以結(jié)合不同的Fc受體。例子包括IgGlFc結(jié)構(gòu)域結(jié)合同源Fc受體CD16(FcyRIII)、CD32(FcyRII-Bl和畫B2)以及CD64(FcyRI)，IgAFc結(jié)構(gòu)域結(jié)合同源Fc受體CD89(FcaRI),IgE結(jié)構(gòu)域結(jié)合同源Fc受體FcsRl和CD23。在糖蛋白中，糖可以結(jié)合到三肽基序Asn-X-Thr/Ser中天冬酰胺的側(cè)鏈中酰胺氮原子。這種類型的糖基化，被命名為N-連接的糖基化，其是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中以多個(gè)單糖添加到磷酸長醇上形成14-殘基支鏈的糖復(fù)合物開始的。接著，這種糖復(fù)合物被通過寡糖轉(zhuǎn)移酶(OST)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上。在糖蛋白離開ER內(nèi)腔之前，從14-殘基寡糖去除三個(gè)葡萄糖分子。酶ER葡糖苷酶I、ER葡糖苷酶II和ER甘露糖香酶參與ER處理。00071隨后，肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基復(fù)合體，在此處N-連接的糖鏈被以許多不同的方式修飾。在高爾基體的順(cis)區(qū)室、中間(medial)區(qū)室中，原始的14-糖類N-連接的復(fù)合物可以通過被除去甘露糖(Man)殘基而修整，通過添加N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac)和/或巖藻糖(Fuc)殘基而延長。通常各種形式的N-連接糖具有共同的由3個(gè)甘露糖和2個(gè)N-胰腺氨基葡萄糖殘基構(gòu)成的五糖核心。最后，在高爾基反(trans)區(qū)域中，可以添加其他GlcNac殘基，隨后是半乳糖(Gal)和末端唾液酸(Sial)。在高爾基復(fù)合體中的糖處理被稱作"末端糖基化"以將其與ER中發(fā)生的"核心糖基化，，區(qū)分開?？梢栽谠S多形式和結(jié)構(gòu)上發(fā)生最終的復(fù)合物糖單元，其中某些具有2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)直鏈(被稱作雙觸角、三觸角或四觸角)。許多酶參與高爾基體處理，其包括高爾基甘露糖苷酶IA、IB和IC，GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶I,高爾基甘露糖苷酶II,GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶II，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶。某些提議的用于生產(chǎn)巖藻糖含量較低的免疫球蛋白的方法對于制造對于治療癥狀具有最佳ADCC活性的生物藥物具有顯著的缺陷。例如，使用除去巖藻糖殘基的酶(巖藻糖普酶)包括額外的昂貴的制造步驟，其具有潛在的顯著經(jīng)濟(jì)和藥物連貫性風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞系的分子改造以敲除參與合成巖藻糖基化糖蛋白的酶在目前的實(shí)踐中要求特殊的宿主林不能"可調(diào)地"生產(chǎn)ADCC能力不同的藥物以調(diào)節(jié)治療應(yīng)用的效力和安全性。未增強(qiáng)ADCC產(chǎn)品的比較的產(chǎn)生是昂貴且耗時(shí)的。使用RNAi或反義分子處理細(xì)胞系以降低(knockdown)這些關(guān)4建酶的水平可能具有意想不到的脫靶效應(yīng)，并如果真正在制造水平上執(zhí)行將是昂貴的。因此，一直存在需要有利的方法用于制備ADCC增強(qiáng)的免疫藥物以及這樣所產(chǎn)生的改善的免疫藥物用于治療用途。發(fā)明概述本發(fā)明提供了培養(yǎng)基和大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法用于改善免疫糖蛋白的性質(zhì)包括效應(yīng)子功能例如ADCC和/或糖基化特征例如巖藻糖含量的降低。本發(fā)明還提供了通過這些方法所產(chǎn)生的改善的免疫糖蛋白，以及這些免疫糖蛋白在治療疾病中的應(yīng)用。0012]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于提高宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫糖蛋白的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，其通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在含有濃度為大約25至大約800|tiM之間，或者在大約100至大約500)iM之間，或在大約100至大約400之間，或在大約100至大約300|iM之間的栗精胺(castanospermine)的培養(yǎng)基中。在示范性實(shí)施方式中，ADCC被提高至少2倍、3倍、4倍或5倍。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了提供了提高宿主細(xì)胞所產(chǎn)生免疫糖蛋白分子的CD16結(jié)合的方法，其通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在含有濃度為大約25至大約800pM之間，或者在大約100至大約500liiM之間，或在大約100至大約400]LiM之間，或在大約100至大約300IliM之間的栗精胺的培養(yǎng)基中。在示范性實(shí)施方式中，CD16結(jié)合被提高了至少50%、75%、100%、125%、150%、175%或200%。0014]在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞生長、活力和/或密度不受顯著影響(例如保持未處理的細(xì)胞的至少80%或更高)。培養(yǎng)基中免疫糖蛋白產(chǎn)生的水平可以為至少100|iig/mL、125ng/mL或150pg/mL。0015]在任意前述實(shí)施方式中，培養(yǎng)基可以是基本上無血清的并且可以包含第二糖修飾劑(carbohydratemodifier)?？梢酝ㄟ^改變應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)的糖修飾劑例如栗精胺的濃度或持續(xù)時(shí)間而調(diào)控對ADCC的相對影響，這提供了相對于通過改變糖基化而改善ADCC的傳統(tǒng)方法的額外優(yōu)勢。可以使用本領(lǐng)域中已知的檢驗(yàn)對ADCC活性進(jìn)行測量和表達(dá)，在示范性的實(shí)施方式中提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。00201糖基化和糖含量已知影響多種免疫球蛋白效應(yīng)子介導(dǎo)的功能包括ADCC、CDC和循環(huán)半衰期。本文所描述的數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的方法令人吃驚地能夠提供表現(xiàn)出改善的ADCC而不影響CDC或半衰期的免疫糖蛋白。因此，在示范性的實(shí)施方式中，免疫糖蛋白分子組合物的ADCC得到提高，但其他免疫球蛋白型效應(yīng)子功能例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和/或延長的循環(huán)半衰期仍類似或未被顯著影響(例如提高或降低低于2倍，或提高或降低低于50%、40%、30%、20%或10%)?？梢詫⒚庖咛堑鞍追肿咏M合物的Fc受體結(jié)合測定為糖修飾劑處理的免疫糖蛋白分子對比未處理的免疫糖蛋白分子結(jié)合CD16的相對比例。下面在實(shí)施例中描述了示范性檢驗(yàn)。在示范性實(shí)施方式中Fc受體結(jié)合提高了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。才艮據(jù)本發(fā)明使用糖+多飾劑例如栗精胺處理的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫糖蛋白組合物將以比未經(jīng)此處理的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫糖蛋白組合物在FcR結(jié)合檢驗(yàn)中高的親和力結(jié)合CD16(高和低親和力形式即在氨基酸158處為V或F)和/或CD32a或b和/或CD64。本文顯示，F(xiàn)c受體結(jié)合親和力的這種提高與ADCC活性的提高相關(guān)。00221本發(fā)明還提供了用于改變免疫糖蛋白的糖含量/糖基化特征和/或降低巖藻糖含量的方法，其通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在體積為至少750mL、1L、2L、3L、4L、5L、IOL、15L、20L或更多含有糖修飾劑例如栗精胺的培養(yǎng)基中，其中糖修飾劑的濃度能夠降低免疫糖蛋白組合物的總巖藻糖含量和/或改變其糖基化特征。在培養(yǎng)基中糖修飾劑例如栗精胺的示范性終濃度為低于800(iM,或低于750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10jxM。00231可以通過改變應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)的糖修飾劑例如栗精胺的濃度或持續(xù)時(shí)間而調(diào)控對巖藻糖含量的相對影響。組合物的總巖藻糖含量可以被表達(dá)為未巖藻糖基化免疫糖蛋白與組合物中免疫糖蛋白總數(shù)目的相對百分比。示范性的組合物含有至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多未巖藻糖基化的分子。根據(jù)本發(fā)明糖修飾劑例如栗精胺處理的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫糖蛋白的巖藻糖含量相對于未經(jīng)此處理的宿主細(xì)胞會降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或IO倍或更多。0024在任何前述方法中，宿主細(xì)胞在暴露到糖修飾劑例如栗精胺的過程中可以表現(xiàn)出高生長水平。例如，產(chǎn)生免疫糖蛋白的CHO細(xì)胞的示范性群體倍增時(shí)間為大約14小時(shí)；期望根據(jù)本發(fā)明的糖修飾劑的濃度(例如有效提高ADCC的濃度)不會降低該倍增時(shí)間。理想地，糖修飾劑例如栗精胺的有效濃度在加入糖修飾劑后的72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)不會降低細(xì)胞生長超過10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%。00251在任一前述方法中，宿主細(xì)胞可以在暴露到糖修飾劑例如栗精胺的過程中表現(xiàn)出高蛋白質(zhì)產(chǎn)量水平。例如，在存在有效量糖修飾劑例如栗精胺時(shí)蛋白質(zhì)產(chǎn)量水平可以為大約50pg/mL或更高，或大約75、100、125或150(ig/mL或更高。優(yōu)選，宿主細(xì)胞表現(xiàn)出高生長水平和高蛋白質(zhì)產(chǎn)量水平。術(shù)語"免疫糖蛋白"是指糖基化多肽，其結(jié)合靶分子并含有來自免疫球蛋白恒定區(qū)的充分的氨基酸序列以提供效應(yīng)子功能優(yōu)選ADCC和/或CDC。示范性分子將含有來自免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的序列，或者來自一種或更多種免疫球蛋白的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明預(yù)期進(jìn)行生產(chǎn)的免疫糖蛋白的具體子集包括單鏈蛋白質(zhì)，其任選地通過鉸鏈和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而二聚化。該單鏈蛋白質(zhì)的子集不包括典型的免疫球蛋白的四聚體構(gòu)型(因?yàn)椴淮嬖谳p鏈)，但包括Fc-配體或Fc-可溶受體融合物。單鏈蛋白質(zhì)的具體例子包括SMIP產(chǎn)物。SMIP產(chǎn)品和其生產(chǎn)方法之前已經(jīng)被描述在共有的美國專利申請no.10/627,556和美國專利公開2003/133939,2003/0118592和2005/0136049中，均被通過參考整體并入本文。具有效應(yīng)子功能的多價(jià)結(jié)合蛋白被描述在2007年6月12日提交的國際專利申請No.PCT/US07〃1052(要求2006年6月12日提交的U.S.S.N.60/813,261以及2006年10月20日提交的60/853,287的優(yōu)先權(quán))中。SMIP是新型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白，其具有下列特征同源結(jié)構(gòu)例如抗原、相應(yīng)受體等的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；IgGl、IgA或IgE鉸鏈區(qū)多肽或突變IgGl鉸鏈區(qū)多肽具有0、1或2個(gè)半胱氨酸殘基；以及免疫球蛋白CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子具有1或2個(gè)半胱氨酸殘基。在相關(guān)的實(shí)施方式中，預(yù)期，如果結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子包含2個(gè)半胱氨酸殘基，則第一個(gè)半胱氨酸(典型地包括在重鏈和輕鏈可變區(qū)之間)不被缺失或氨基酸置換。SMIP產(chǎn)物能夠ADCC和/或CDC,但它們形成二硫鍵連接的多聚體的能力可能被破壞。示范性的SMIP產(chǎn)物可以具有一個(gè)或更多個(gè)結(jié)合區(qū)，例如來自免疫球蛋白的可變輕鏈和/或可變重鏈結(jié)合區(qū)的免疫球蛋白超家族的結(jié)合區(qū)。在示范性實(shí)施方式中，這些區(qū)域被接頭肽分開，其中接頭肽可以是本領(lǐng)域中已知的任何接頭肽以能夠與結(jié)構(gòu)域或區(qū)連接兼容。示范性的接頭是基于Gly4Ser接頭基序的接頭，例如(Gly4Ser)n,其中n=3-5?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明產(chǎn)生的示范性SMIP產(chǎn)品包括結(jié)合CD20或CD37的產(chǎn)品。結(jié)合CD20或CD37以及包括特異性結(jié)合序列和/或氨基酸修飾的SMIP產(chǎn)品被描述在共有的、同樣未決的美國專利申請no.10/627,556和11/493,132中，均被通過參考整體并入本文中。、白介素15與Fc區(qū)的融合蛋白[J.Immunol.,160,5742(1998)]、因子VII與Fc區(qū)的融合蛋白[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，12180(2001)]、白介素與Fc區(qū)的融合蛋白[J.Immunol.,154,5590(1995)]、白介素2與Fc區(qū)的融合蛋白[J.Immunol.,146,915(1991)]、CD40與Fc區(qū)的融合蛋白[Surgery,132，149(2002)]、Flt-3(fms-類酪氨酸激酶)與抗體Fc區(qū)的融合蛋白[Acta.Haemato.,95,218(1996)]、OX40與抗體Fc區(qū)的融合蛋白[J.Leu.Biol.,72,522(2002)]、其他CD分子[例如CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD106(VCAM醫(yī)l)、CD137]、粘附分子[例如ALCAM(活性白細(xì)胞細(xì)胞粘附分子)、鈣粘蛋白、ICAM(細(xì)胞間粘附分子)-l、ICAM-2、ICAM-3]、細(xì)胞因子受體[例如白介素-4R、白介素-5R、白介素-6R、白介素-9R、白介素-10R、白介素-12R、白介素-13Ral、白介素-13Ra2、白介素-15R、白介素-21R]、趨化因子、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的信號分子[例如B:7-H1、DR6(死亡受體6),PD-1(程序死亡-l)、TRAILRl]、共刺激分子[例如B7-l、B7-2、B7-H2、ICOS(可誘導(dǎo)共刺激劑)]、生長因子[例如ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR]、分化誘導(dǎo)因子(例如B7-H3)、激活因子(例如NKG2D)、信號轉(zhuǎn)移分子(例如gpl30)。00331免疫糖蛋白的其他實(shí)施例包括抗體。本文的術(shù)語"抗體"被定義為包括全組裝抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(雙特異性抗體、能夠結(jié)合抗原的抗體片段(例如Fab'、F，(ab)2、Fv、單鏈抗體、二聚抗體(diabody))和包含前述的重組肽只要它們表現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。預(yù)期原始分子和/或片段的多聚體或集合體包括化學(xué)衍生抗體。預(yù)期任何同種型類別或亞類的抗體包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同的同種型具有不同的效應(yīng)子功能；例如IgGl和IgG3同種型具有抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。"免疫球蛋白"或"原始抗體，，是四聚體糖蛋白，其由兩對相同的多肽鏈(兩條"輕鏈"和兩條"重鏈")構(gòu)成。每條鏈的氨基末端部分包括大約100~IIO或更多個(gè)氨基酸的"可變區(qū)"("V"),其主要負(fù)責(zé)抗原識別。在該可變區(qū)中，"高變區(qū)"或"互補(bǔ)性決定區(qū)"(CDR)由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3),以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3)構(gòu)成(正如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)]所描述的)，和/或那些來自高變環(huán)的殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3))和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)(正如[Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)]所描述的))。0035]每條鏈的羧基末端部分含有恒定區(qū)。輕鏈在恒定區(qū)中具有單個(gè)結(jié)構(gòu)域。因此，輕鏈具有一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。重鏈在恒定區(qū)中具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域。IgG、IgA和IgD抗體的重鏈具有3個(gè)被稱為CH1、CH2和CH3的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，IgM和IgE抗體的重鏈具有四個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2、CH3和CH4。因此，重鏈具有一個(gè)可變區(qū)和3個(gè)或4個(gè)恒定區(qū)。、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)[Ward等人，Nature341:544-546,1989]、互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)[Bird等人，Science242:423-426,1988,和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988,任選包括多肽接頭和任選多特異性Gruber等人，J.Immunol.152:5368(1994)]、單鏈抗體片段、二聚抗體[EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)]、三聚抗體(triabody)、四聚抗體(tetrabody)、微型抗體[Olafsen,等人，ProteinEngDesSel.2004Apr;17(4):315-23]、線性抗體(linearantibody)[Zapata等人，ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995)];螯合重組抗體[Neri等人，JMolBiol.246:367-73,1995],三鏈抗體(tnbody)或雙鏈抗體(bibody)[Schoonjans等人,JImmunol.165:7050-57，2000;Willems等人，JCh薩atogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci.786:161-76,2003]、細(xì)胞抗體(intrabody)[Biocca,等人，EMBOJ.9:101—108,1990;Colby等人，ProcNatlAcadSciUSA.101:17616-21,2004]、納米抗體(nanobody)[Cortez-Retamozo等人，CancerResearch64:2853-57，2004]、抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝化抗[Desmyter等人，J.Biol.Chem.276:26285-90,2001;Ewert等人，Biochemistry41:3628-36，2002;美國專利公開No.20050136049和20050037421]、含VHH的抗體、沖莫擬抗體(mimetibody)[美國專利公開No.20050095700和20060127404;WO04/002424A2;WO05/081687A2]、或其變體或衍生物，以及含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，其足以提供與多肽的特異性抗原結(jié)合，例如CDR序列，只要抗體保持期望的抗原結(jié)合活性。術(shù)語"衍生物"在結(jié)合抗體使用時(shí)是指通過綴合到治療或診斷劑、標(biāo)記(例如用放射性核或各種酶)、共價(jià)聚合物結(jié)合例如聚乙二醇化(利用聚乙二醇衍生)和通過化學(xué)合成非天然氨基酸的插入或置換而共價(jià)修飾的抗體。本發(fā)明的衍生物將保持本發(fā)明未衍生化的分子的結(jié)合性質(zhì)》癌癥靶向抗體與細(xì)胞毒性劑例如放射性同位素(例如1131、1125、Y90和Rel86)、化學(xué)治療劑或毒素的綴合可以增強(qiáng)破壞癌細(xì)胞。100431對于靶分子是"特異性"的免疫糖蛋白以高于任何其他靶的親和力結(jié)合該靶。本發(fā)明的免疫糖蛋白與它們的靶可以具有至少大約104M"或可替換地105M"、106M"、107M"、108M-1、109M-1或101QM"的Ka的親和力?？梢允褂脗鹘y(tǒng)技術(shù)容易測定這些親和力，例如通過使用BIAcore儀器或通過使用放射標(biāo)記耙抗原的放射免疫檢驗(yàn)?？梢酝ㄟ^例如Scatchard等人，AnnN.Y.Acad.Sci.,51:660(1949)的方法對親和力數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。耱發(fā)謬游0044]"糖修飾劑"是小分子有機(jī)化合物，優(yōu)選分子量<1000道爾頓，其抑制參與對作為結(jié)合到多肽的糖一部分的糖進(jìn)行添加、除去或修飾的酶。糖基化是非常復(fù)雜的過程，其發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中("核心糖基化")和高爾基體中("末端糖基化")。0045糖基化酶的其他基于多肽或基于多核苷酸的抑制劑包括抑制早期糖修飾劑活性的RNAi或反義根據(jù)本發(fā)明都是有用的，但被排除在"糖修飾劑"的定義之外。后續(xù)糖基化步驟包括高爾基體甘露糖苷酶II、GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶II、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖激酶。示范性的糖修飾劑包括任意下列的。栗精胺被認(rèn)為是葡糖苷酶I和II抑制劑。去氧巖藻糖野尻霉素(Deoxyfuconojinmycin)是巖藻糖苷酶抑制劑。6-曱基-四氫-吡喃-2H-2,3,4-三醇已經(jīng)被報(bào)道在體內(nèi)抑制L-巖藻糖的磷酸化，即GDP-L-巖藻糖生物合成的第一步。6,8a-二表-栗精胺被報(bào)道為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。l-N-亞應(yīng)基糖A和B(也分別被稱作l-丁基-5-曱基-哌啶-3,4-二醇鹽酸鹽和5-甲基-哌啶-3,4-二醇鹽酸鹽)已經(jīng)被報(bào)道為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。去氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojinmycin)(DMJ)是ER甘露糖苷酶I抑制劑。Kifunensine(Kf)是ER甘露糖苷酶I抑制劑。苦馬豆素(Swainsonine)(Sw)是ER甘露糖普酶II抑制劑。莫能菌素(Monensin)(Mn)是ER和高爾基體之間細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑，其干擾核心寡糖的延長。盡管被廣泛用于治療性蛋白的生產(chǎn)的CHO細(xì)胞是優(yōu)選的，但本領(lǐng)域中所有已知產(chǎn)生糖基化蛋白的宿主細(xì)胞都可以被使用包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。酵母細(xì)胞的例子包括畢赤酵母(尸/c/na)、例如尸./"Wor^和酵母菌屬(Sacc/z^owycM)例如釀酒酵母(S.cerev/wae)以及粟酒裂殖酵母(iSc/z/ms^cc/z"r函;A^/歸6e)、克魯維酵母(《/t(yverow;KCM)Zacto、脆壁克魯維酵母(/rag"&)、保加利亞克魯維酵母(AT.6w/g^7cw)、魏氏克魯維酵母(K.wickeram")、AT.而/"/、AT.t/myo//n'/ar謂^w"Wo/eraw和馬克斯克魯維酵母(f.mao:/am^);耶氏克魯維酵母(《.少07Tow/a);里氏木霉(7>7'c/o<ie，"),粗糙脈孢菌(Afewmsp0n3cra^")、施旺酵母(iSc/z而wm'omyces)Sc/z而"m'0m7c"occ油"fa/Zs、脈孑包菌(A^wroy/ora)、青霉菌(尸em'cz'〃/wm)、7b(y/oc/aof/wm、曲霉菌(J^erg〃/M)、構(gòu)巢曲霉(Amt/w/^w)、黑曲霉(Amgw),漢遜酵母屬(/7a"化"w/a),假絲酵母(Owt^^)、克勒克酵母(A7oec/bra)、擬酵母(7bn^/o戸w)和紅酵母屬(i^WWon^)。示范性昆蟲細(xì)胞包括苜著尺獲(Autographacalifornica)禾口草J4夜蟲我(Spodo/^ena/rwg/penia)和果蠅(Z>wo//7")。示范性哺乳動物細(xì)胞包括各種CHO、BHK、HEK-293、NS0、YB2/3、SP2/0和人細(xì)胞例如PER-C6或HT1080以及VERO、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、Jurkat、Saos、PC-12、HCT116、L929、Ltk-、WI38、CV1、TM4、W138、HepG2、MMT、白血病細(xì)胞系、胚胎干細(xì)胞或受精卯細(xì)胞。00591可以在任何培養(yǎng)體系中并根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法培養(yǎng)細(xì)胞，包括T型燒瓶、旋轉(zhuǎn)器和振蕩器燒瓶、滾筒瓶和攪拌罐生物反應(yīng)器。著壁依賴性細(xì)胞可以被培養(yǎng)在被保持在攪拌罐生物反應(yīng)器中的微載體上例如高分子球體?？商鎿Q的，細(xì)胞可以以單細(xì)胞懸浮液的形式生長?？梢砸苑峙椒尤肱囵B(yǎng)基，例如如果以單批次一次性將培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中或者以定期加入小批次培養(yǎng)基的分批給料方法加入到細(xì)胞中?？梢栽谂囵B(yǎng)的最后收獲培養(yǎng)基，或者在培養(yǎng)過程中多次收獲培養(yǎng)基。連續(xù)灌注生產(chǎn)工藝也是本領(lǐng)域中公知的，并且包括連續(xù)將新培養(yǎng)基給料到培養(yǎng)物種，同時(shí)從反應(yīng)器中連續(xù)回收相同體積。灌注培養(yǎng)通常達(dá)到比分批培養(yǎng)高的細(xì)胞密度，并且能夠利用重復(fù)收獲而維持?jǐn)?shù)星期或數(shù)月。0060本發(fā)明的免疫糖蛋白可以用作治療劑用于治療靶分子所接到的疾病，或者例如作為細(xì)胞溶解劑以殺死具有所表達(dá)靶分子或與細(xì)胞表面結(jié)合的靶分子的癌細(xì)胞。0061]"治療"或"治療"是指治療性治療或預(yù)防性治療。治療性治療可以改善接受治療的個(gè)體中疾病的至少一種癥狀，或者可以延遲個(gè)體中發(fā)展中疾病的惡化，或者防止其他相關(guān)疾病的發(fā)生。通過評估疾病狀態(tài)領(lǐng)域公知的臨床標(biāo)準(zhǔn)的評估對改善的應(yīng)答進(jìn)行評定。在一個(gè)實(shí)施方式中，給藥是在需要在癌癥或受影響組織的位點(diǎn)進(jìn)行的，所述癌癥或受影響組織需要通過直接注射到位點(diǎn)中或者通過可以在內(nèi)部釋放制劑的持續(xù)遞送機(jī)制而進(jìn)行治療。例如，在本發(fā)明植入到癌癥附近的制劑中可以包括生物可降解微球或膠嚢或能夠持續(xù)遞送組合物(例如可溶多肽、抗體或小分子)的其他生物可降解高分子構(gòu)造。0066]還可以在多個(gè)位點(diǎn)將治療組合物遞送給患者?？梢酝瑫r(shí)僅是多份給藥，或者在持續(xù)的時(shí)間段內(nèi)給藥。優(yōu)選注射含水溶液。含水組合物可以凈皮凍干用于儲存，并在使用之前在適當(dāng)載體中復(fù)原(reconstitute)。這種技術(shù)已經(jīng)顯示對于傳統(tǒng)免疫球蛋白是有效的。能夠采用任何適當(dāng)?shù)膬龈珊蛷?fù)原技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解凍干和復(fù)原能夠引起不同程度的活性損失并且可能需要調(diào)節(jié)使用水平以進(jìn)行補(bǔ)償。10068在所有情況中，該形式必須是無菌的，并且必須是流動的達(dá)到容易發(fā)生注射的程度。可以例如通過使用包覆例如軟磷脂，通過維持在分散液時(shí)所需的粒徑以及通過使用表面活性劑而維持恰當(dāng)?shù)牧鲃有?。其在制造和儲藏條件下必須是穩(wěn)定的，并且能夠被保持抵抗微生物的污染行為例如細(xì)菌和真菌?？梢酝ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌及例如對羥苯甲酸、氯代丁醇、石炭酸、山梨酸、硫柳汞等實(shí)現(xiàn)對微生物行為的防止。在許多情況中，期望包括等滲劑例如糖或氯化鈉。10069)此外，預(yù)期在本發(fā)明中使用的組合物的親水和疏水性質(zhì)被很好地平衡，這樣增強(qiáng)了它們在體外特別是體內(nèi)應(yīng)用的實(shí)用性，而其他缺少該平衡的組合物是基本上實(shí)用性較低的。具體的，被預(yù)期在允許在體內(nèi)吸收和生物利用度，同時(shí)還具有在脂類中的溶解度，這允許化合物穿過細(xì)胞膜到達(dá)假定的作用位點(diǎn)。圖1描繪根據(jù)細(xì)胞/ml的細(xì)胞計(jì)數(shù)所顯示的，生長在具有各種濃度栗精胺的細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)TRU-016的CHO細(xì)胞的細(xì)胞生長。0074圖2描繪根據(jù)活細(xì)胞百分比所顯示的，生長在具有各種濃度栗精胺的細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)TRU-016的CHO細(xì)胞的細(xì)胞活力。0075圖3描繪在存在各種濃度的栗精胺時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-015的CD16結(jié)合，并且顯示了幾何平均熒光強(qiáng)度對比栗精胺濃度。00761圖4描繪根據(jù)幾何平均熒光強(qiáng)度所顯示的，在存在各種濃度6,8a-二表栗精胺、苦馬豆素或去氧甘露糖野尻霉素(DMJ)時(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016的CD16結(jié)合。00771圖5描繪根據(jù)平均熒光強(qiáng)度所顯示的，在存在不同濃度kifunensme所培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016的CD16結(jié)合。100781圖描繪6根據(jù)平均熒光強(qiáng)度所顯示的，在存在不同濃度栗精胺時(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)A-純化的TRU-016的CD16結(jié)合。圖7和8分別描繪使用高親和力和低親和力供體PBMC測量的TRU-015的ADCC，以及所加入TRU-015對比特異性殺死百分比的圖表。圖9描繪在存在不同濃度栗精胺時(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞素所產(chǎn)生的TRU-016的ADCC以及特異性殺死百分比對比所加入TRU-016濃度的圖表。圖10描繪在存在各種糖修飾劑時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016的ADCC，以及特異性殺死百分比對比所加入TRU-016濃度的圖表。0082圖11描繪在給藥在存在各種糖修飾劑時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016的小鼠中的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)。圖12描繪給藥使用各種糖修飾劑處理的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016的小鼠血清中的TRU-016的CD16結(jié)合。|00841圖13描繪植入腫瘤細(xì)胞以及給藥使用各種糖修飾劑處理的細(xì)胞或未處理細(xì)胞所產(chǎn)生TRU-016的小鼠在第8天的相對肺瘤體積。圖14描繪植入腫瘤細(xì)胞以及給藥使用各種糖修飾劑處理的細(xì)胞或未處理細(xì)胞所產(chǎn)生TRU-016的小鼠的存活百分比。0086]圖15描繪在存在栗精胺時(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-015的CDC以及碘化丙錠陽性(死細(xì)胞)百分比對比TRU-015測試蛋白濃度的圖表。0087圖16描繪在存在各種糖修飾劑時(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016的CDC,以及碘化丙錠陽性(死細(xì)胞)百分比對比TRU-016測試蛋白濃度的圖表。圖17描繪在栗精胺濃度范圍內(nèi)，TRU-016的相對特異性蛋白產(chǎn)量。00891圖18描繪在栗精胺濃度范圍內(nèi)，TRU-016同時(shí)結(jié)合CD37與FcyRIIIa(CD16)的檢驗(yàn)結(jié)果。0090]圖19描繪對于栗精胺濃度范圍，TRU-016與表達(dá)CD37的細(xì)胞的劑量應(yīng)答結(jié)合曲線。CD37-特異性SMIP^皮描述在共有的美國專利申請No.10/627,556和美國專利7^開No.2003/133939,2003/0118592以及2005/0136049中，均通過參考將其整體并入本文。如下所述產(chǎn)生示范性SMIP、TRU-016。20093!TRU-016[G28-lscFvVH1IS(SSC-P)HWCH2WCH3〗是重組單鏈蛋白質(zhì)，其結(jié)合CD37抗原。TRU-016的核普酸和氨基酸序列被列于SEQIDNO:1和2中。結(jié)合結(jié)構(gòu)域基于在前述段落的專利公開中所已經(jīng)公開的G28-l抗體序列，通過參考將其并入本文。將結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)連接到效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域人IgGl的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。TRU-016以溶液中的二聚體存在。00941通過重組DNA技術(shù)在中國倉鼠卵巢(CHO)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系中產(chǎn)生TRU-016。通過蛋白質(zhì)A親和層析從CHO培養(yǎng)物上清純化TRU-016SMIP。使用dPBS，以5.0ml/分鐘(150cm/小時(shí))對50mLr蛋白質(zhì)AFF瓊脂糖凝月交柱(GEHealthcarerProteinASepharoseFF，Catalog#17-0974-04)平衡1.5倍柱體積(CV)。以1.7ml/分鐘的流速使用AKTAExplorer100Air(GEhealthcareAKTAExplorer100Air,Catalog#18-1403-00)將培養(yǎng)物上清上樣到r蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠FF柱，捕獲重組TRU-016。使用dPBS，接著1.0MNaCl、20mM磷酸鈉pH6.0、接著使用25mMNaCl，25mMNaOAc,pH5.0對柱清洗5倍柱體積(CV)。這些清洗步驟從r蛋白質(zhì)A柱除去了非特異性結(jié)合的CHO宿主細(xì)月包蛋白質(zhì)，這有助于在洗脫后產(chǎn)品沉淀。將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行GPC尺寸排阻層析法(SEC)以達(dá)到對來自較高分子量聚集體的TRU-016(二聚體)的進(jìn)一步純化。使用dPBS,以12.6ml/分鐘(38cm/小時(shí))對含有1LSuperdex200FF瓊脂糖凝膠的XK50/100柱(GEhealthcareXK50/100孔層析柱Catalog#18-8753-01)平tfl.5倍柱體積(CV)。將最大體積54ml(3%CV)的樣品應(yīng)用到柱。柱繼續(xù)以12.6ml/分鐘運(yùn)行，洗脫蛋白質(zhì)浮皮分級在40mL級分中。使用分析型HPLC對每種級分進(jìn)行分析產(chǎn)品質(zhì)量，并匯集>95%POI(未聚集的)TRU-016的洗脫級分。將所得到的匯集物以0.22pm進(jìn)行過濾除菌。接著濃縮材料，并使用20mM磷酸鈉和240mM蔗糖pH6.0進(jìn)^f亍配置。純化葡萄糖變體(glycovariant)的可替換方法如下。通過蛋白質(zhì)A親和層析從CHO培養(yǎng)上清純化TRU-016。使用dPBS,以1.0mL/分鐘對1mLMabSelect親和層析柱(GEHealthcareHitrapMabSelect,catalog#28-4082-53)平衡7倍柱體積(CV)。使用AktaExplorer100Air(GEHealthcare,AktaExplorer100Air,catalog#18-1403-00)以1.0mL/分鐘將培養(yǎng)上清上樣到MabSelect柱捕獲重組TRU-016。使用dPBS對柱清洗20CV,接著使用20mM磷酸鈉、1.0MNaClpH7.0清洗5CV,接著使用dPBS清洗3CV。0098使用10mMpH3.5從柱洗脫重組TRU-016,接著使用10mM檸檬酸鹽3.0解吸8CV。在解吸之后，使用dPBS對柱重新平衡5CV。在洗脫過程中，將按白紙收集到級分中，并根據(jù)所吸光度進(jìn)行匯集，并利用每5mL洗脫液添加大約400|liL0.55M2-(N-嗎啉)乙烷磺酸(MES)pH6.0而將所匯集的材料調(diào)至pH5。將該中和的洗脫液過濾除菌，并進(jìn)行活性檢驗(yàn)以及處理分析檢驗(yàn)。如下所述，對使用不同濃度的各種糖修飾劑培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016檢驗(yàn)CD16結(jié)合、ADCC、CDC、藥物動力學(xué)參數(shù)和體內(nèi)活性。[ooiio圖1和2是代表性的，并且顯示已最高達(dá)到1000pM濃度的糖修飾劑栗精胺的處理不會影響細(xì)胞計(jì)數(shù)或經(jīng)過所有取樣時(shí)間段(最高達(dá)到144小時(shí))的細(xì)胞活力百分比。實(shí)施例3結(jié)合FcR100111將根據(jù)實(shí)施例2產(chǎn)生的免疫糖蛋白體外檢驗(yàn)與Fq/受體的可溶性Ig-融合版本的結(jié)合，其中受體的胞外結(jié)構(gòu)域與鼠IgG2aFc融合。通過分別將Fcy受體I的胞外結(jié)構(gòu)域(GenbankAcc.No.BC032634)、IIa(GenbankAcc.No.NM—021642)、lib(GenbankAcc.No.BC031992)和III-V158(高親和力等位基因)(GenbankAcc.No.X07934)以及III-F158(低親和力等位基因)融合到具有在殘基238Pro變成Ser突變(MIgG2aP238S)的鼠IgG2aFc,產(chǎn)生可溶性受體材料。對于兩種形式的FeyRIII(CD16)，都將HE4導(dǎo)肽克隆到CD16氨基酸1~178中，接著融合到MlgG2aP238S。(小鼠Fc-凈爭異'l"生^t體，與人Fc有最小的交叉反應(yīng))孵育。通過單色流式細(xì)胞儀在FACsCalibur上使用CellQuest軟件(BectonDickinson)對細(xì)胞進(jìn)行分析。00115]如果在該檢驗(yàn)中使用來自實(shí)施例2的TRU-016上清液而不是純化的TRU-016蛋白，則可以通過使用稀釋的上清液以及TRU-016標(biāo)準(zhǔn)對WIL2-S細(xì)胞直接染色，而定量上清液中SMIP的濃度。通過使用1:50稀釋的FITC偶聯(lián)的F(Ab，)2山羊抗人(力[CaltagH10101]才全測TRU-016。測定與低親和力等位基因和高親和力等位基因的結(jié)合，以類似地比較ADCC活性。CD16結(jié)合的提高(低或高親和力等位基因)與ADCC活性的提高相關(guān)。圖3~6展示了代表性結(jié)果。0、30或100)ug/mL栗精胺所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞而產(chǎn)生的TRU-015純化的蛋白質(zhì)測試CD16結(jié)合(低親和力等位基因)。圖3展示了幾何平均熒光強(qiáng)度的代表性結(jié)果，并且顯示CD16結(jié)合在提高培養(yǎng)基中栗精胺濃度時(shí)CD16結(jié)合的劑量依賴性結(jié)合。對培養(yǎng)基中含濃度為50或250pM的6,8a-二表栗精胺、或濃度為50或250pM的苦馬豆素、或濃度為50或250(iM的的去氧甘露糖野尻霉素(DMJ)所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞而產(chǎn)生的TRU-016上清液測試CD16結(jié)合。圖4中顯示了平均熒光強(qiáng)度的代表性結(jié)果，并且顯示兩種濃度的DMJ都提高了CD16結(jié)合。盡管以這些濃度對6,8a-二表栗精胺或苦馬豆素沒有觀察到效果，但對純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步測試以確定效果。100120對培養(yǎng)基中含有濃度為0、0.5、1、3、5或10|uM的kifunensme所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016上清液測試CD]628結(jié)合。圖5中展示了平均熒光強(qiáng)度的代表性結(jié)果，并且顯示kifunensine比DMJ在提高CD16結(jié)合方面有效得多，并且及時(shí)在最低濃度0.5pM下也大大提高了CD16結(jié)合。-自然釋放的cpm)/(最大釋放cpm-自然釋放cpm)x100計(jì)算特異性殺死百分比，并將數(shù)據(jù)根據(jù)特異性殺死百分比對比TRU-016濃度進(jìn)行作圖。001231圖7~10中展示了代表性結(jié)果。100124對培養(yǎng)基中含有O、2、5、10、30或100貼/mL栗精胺所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-015純化的蛋白質(zhì)測試4吏用PBMC從高親和力(V/V158)和低親和力(F/F158)CD16供體測量的ADCC。圖7和8中展示了特異性殺死百分比的代表性結(jié)果(分別為高親和力和低親和力供體)，并且顯示在培養(yǎng)基中提高濃度的栗精胺下，劑量依賴性的ADCC活性提高。00125對培養(yǎng)基中含有0、10、25、50、100或200iiM栗精胺所培養(yǎng)CHO細(xì)胞產(chǎn)生的TRU-016純化的蛋白質(zhì)測試ADCC。圖9中展示了特異性殺死百分比的代表性結(jié)果，并顯示在培養(yǎng)基中提高濃度的栗精胺下，劑量依賴性的ADCC活性提高。00126對培養(yǎng)基中含有200|iMDMJ、10pMkifenunsine或200栗精胺所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016純化的蛋白質(zhì)測試ADCC。圖10中展示了特異性殺死百分比的代表性結(jié)果，并且顯示所有這些濃度的糖修飾劑改善了CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫糖蛋白的ADCC。實(shí)施例5CDC活性對未處理的CHO細(xì)胞，或者使用30)Lig/ml栗精胺處理的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-015純化的蛋白質(zhì)測試CDC活性。結(jié)果展示在圖15中。00129對未處理CHO細(xì)胞或者培養(yǎng)基中含有200DMJ、10|iMkifenunsine或200栗精胺所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016純化的蛋白質(zhì)測試CDC活性。結(jié)果展示在圖16中。00130j這些結(jié)果顯示糖修飾的TRU-015或TRU-016的CDC與未處理CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白質(zhì)的CDC類似，這說明宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中存在糖修飾劑對宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫糖蛋白的CDC沒有顯著的影響。實(shí)施例6藥物動力學(xué)特征在基于FACS的結(jié)合檢驗(yàn)中使用CD37+Ramos人細(xì)胞系測定每種TRU-016測試樣品的血清濃度。將CD37+Ramos細(xì)胞(5x105個(gè)細(xì)胞/孔)連同待測試的血清樣品孵育在96孔平底板中。將加料(spiked)血清樣品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。將細(xì)胞在4。C下孵育1小時(shí)，之后加入檢測抗體。使用焚光素偶聯(lián)的山羊抗人IgGFc^片段特異性抗體檢測TRU-016測試蛋白與CD37+Ramos細(xì)胞的結(jié)合。將標(biāo)準(zhǔn)曲線用于構(gòu)建作為抗原濃度函數(shù)的結(jié)合曲線。簡言之，標(biāo)準(zhǔn)曲線包括各種抑制濃度的TRU-016測試蛋白，其被加料到1:2稀釋在FACS緩沖液中的正常小鼠血清中。對每個(gè)板運(yùn)行兩次標(biāo)準(zhǔn)曲線。將來自FACS分析的平均熒光強(qiáng)度(MFI)輸出到SoftmaxPro軟件，并用于計(jì)算TRU-016測試蛋白的血清濃度。藥物動力學(xué)研究的結(jié)果顯示在含有200|uMDMJ、10(iMkifenunsine或200栗精胺的培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的TRU-016(圖11中展示的)在被被給藥給小鼠時(shí)表現(xiàn)出了與未處理CHO小鼠所產(chǎn)生的TRU-016類似的藥物動力學(xué)特征，這說明宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中的糖修飾劑對半衰期或其他藥物動力學(xué)參數(shù)沒有顯著影響。|00l34j對從在給藥TRU-016之后48、72、96和192小時(shí)后從小鼠獲得的含有TRU-016的血清重復(fù)CD16檢驗(yàn)，顯示血清在所測試的所有時(shí)間點(diǎn)都保持了其提高的CD16結(jié)合活性。結(jié)果顯示在圖12中。實(shí)施例7糖修飾的免疫糖蛋白的體內(nèi)活性001351在第0天為棵鼠皮下給藥5x106個(gè)Ramos細(xì)胞，并在第0、2、4、6和8天靜脈注射200貼對照人IgG或經(jīng)200|uMDMJ、10kifenunsine或200)liM栗精胺處理的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的31TRU-016測試蛋白質(zhì)。典型地，小鼠在6天內(nèi)產(chǎn)生胂瘤，并在稍后死亡。使用數(shù)字測徑器和LabCat軟件每周測量腫瘤三次，并將腫瘤體積計(jì)算為V2[長度x(寬度)]2。每周測定體重一次。00136]當(dāng)胂瘤尺寸達(dá)到1500mm3(在周五達(dá)到1200mm3),處死小鼠。如果發(fā)生肺瘤潰瘍，腫瘤抑制動物的活動性，或者如果體重?fù)p失達(dá)到或超過20%也將小鼠處死。00137]在研究開始后的8天相對腫瘤體積的中間結(jié)果顯示在圖13中。在開始研究后關(guān)于存活百分比的屬于顯示在圖14中以及下表1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*每種糖修飾的TRU-016的數(shù)值都與hulgG處理的對照組顯著不同。進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)-瞼以測定栗精胺濃度對細(xì)胞活力、密度和TRU-016的特異性蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。在開始試-驗(yàn)之前，在37。C和5%二氧化石灰下在潮濕的培養(yǎng)箱中，將轉(zhuǎn)染TRU-016的CHO細(xì)胞培養(yǎng)在搖瓶的Ex-Cell302CHO無血清培養(yǎng)基(SAFCBiosciences)中，所述培養(yǎng)基^皮補(bǔ)充了1x非必需氨基酸(MediaTech)、1x丙酮酸鈉(MediaTech)、4mML-谷氨酰胺(MediaTech)、500nM氨曱喋呤(MPBiomedicals)和1mg/L重組胰島素(Recombulin-GIBCO/InvitrogenCorp.)。通過將栗精胺在無菌、過濾/去離子水(MediaTech)中稀釋而制備200mM儲液濃度的栗精胺(AlexisBiochemicals),并使用0.2HTTuffryn膜(PallCorpomtion)過濾通過13mmAcrodisc。將儲液等分到無菌的O-環(huán)狀(O-ringed)0.5mL微型離心管(Fisherbrand,FisherScientific)中，并在-20。C冷凍。在開始實(shí)驗(yàn)前大約1小時(shí)，在室溫下將所需要的份數(shù)冷凍，并通過渦旋(vortexing)充分混合每瓶的內(nèi)含物。001411對于每次實(shí)驗(yàn)，將對數(shù)期的細(xì)胞接種在上述培養(yǎng)基中，達(dá)到在250mL搖瓶中總體積為60mL密度為200,000個(gè)細(xì)胞/mL,并以待測試的濃度加入CS。800pM、400|tiM、200pM、100[aM、50^M、25|nM和0的CS濃度均在兩份燒瓶中進(jìn)行測試。在潮濕的恒溫箱中在37。C和5%二氧化碳下對所有培養(yǎng)物進(jìn)行孵育，酶至少每隔一天監(jiān)控活細(xì)胞密度和整體細(xì)胞活力。在下列抬1全中測試實(shí)施例8中所產(chǎn)生的TRU-016,其同時(shí)評估了TRU-016結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合表達(dá)CD37的耙細(xì)胞的能力，以及TRU-016SMIP的Fc部分結(jié)合人CD16和鼠IgGFc融合蛋白的能力。將適當(dāng)數(shù)目的Daudi細(xì)胞(350,000/孔乘以孔的數(shù)目)并在15°C下一250xg離心5分鐘。除去上清。通過使用FACSBuffer稀釋來自USB(USBUS19943)1:4的4%儲液制備1%的冷低聚甲醛。通過將2%FBS(Gibco)加入到Dulbecco，sPBS(Invitrogen)(v/v)中并使用0.22nm過濾器無菌過濾而制備FACS緩沖液。在4。C下保存和使用FACS緩沖液。將細(xì)胞重懸浮在1。/。低聚甲醛中(體積等于50jiL/孔乘以孔的數(shù)目)，并鋪在圓底96孔板中。在4。C下孵育細(xì)胞30分鐘。在孵育后，通過向每孔加入150jiLFACS緩沖液，250xg離心3分鐘并除去上清而對細(xì)胞進(jìn)行清洗。將細(xì)胞重懸浮在50pLFACS緩沖液中。將TRU-016稀釋在FACS緩沖液中，濃度范圍在飽和到背景水平之間(24(ig/mL—0.011|ng/mL),加入到適當(dāng)?shù)目字校?0)liL/孑L,并將細(xì)胞在4°C下孵育25分鐘。將CD16:MuIgGFc融合蛋白稀釋在FACS緩沖液中達(dá)到飽和水平(20ng/ml)并加入進(jìn)行檢驗(yàn)。OpL/孔)，在4。C下額外孵育30分鐘以與已經(jīng);故結(jié)合到細(xì)胞表面的TRU-016形成復(fù)合物。通過在15。C下250xg離心3分鐘，除去上清，接著使用200iliL/孔FACS緩沖液清洗3次而從孔除去所有未結(jié)合的試劑。接著將細(xì)胞與熒光團(tuán)(R-藻紅蛋白，Jackson115-116-071)標(biāo)簽F(ab，)2抗體，對Fc特異性的抗體(并選擇為對人Fc的反應(yīng)性最低)孵育。該抗體將結(jié)合CD16:MuIgGFc融合蛋白的MuIgGFc部分。將抗體以1:200稀釋在FACS緩沖液中，并向每孔加入100pL。在4。C下黑暗中孵育板45分鐘。通過向每孔加入150pLFACS緩沖液并在15。C下250xg離心3分鐘以及除去上清而除去所有未結(jié)合R-PE。隨后利用200|uL/wellFACS緩35沖液，在15。C下250xg離心3分鐘以及除去上清而進(jìn)行第二次清洗。使用200nL/孔1%低聚甲醛重懸浮細(xì)胞并在4。C下儲存過夜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在圖18中，并顯示相對于最高達(dá)到400pM的CS濃度的的劑量依賴性結(jié)合應(yīng)答，在400iliM結(jié)合似乎變平。00151]為了證明CS處理的TRU-016與CD16增強(qiáng)的結(jié)合并不是部分由于增強(qiáng)的分子與CD37的結(jié)合，除了在檢驗(yàn)板中加入并孵育經(jīng)處理或未處理的TRU-016樣品，并通過在15。C下250xg離心3分鐘除去上清接著使用200pL/孔FACS緩沖液清洗3次而除去未結(jié)合的TRU-016之外，重復(fù)上述檢驗(yàn)。接著，將細(xì)胞與偶聯(lián)FITC的山羊抗人IgGFc特異性抗體(CaltagH10501)孵育。該抗體將與結(jié)合到細(xì)胞的TRU-016的人IgG鏈結(jié)合。將抗體在FACS緩沖液中1:50稀釋，并將100)aL加入到每個(gè)孔中。將板在4。C下黑暗中孵育45分鐘。通過向每個(gè)孔中加入IOOiliLFACS緩沖液，在15。C下250xg離心3分鐘，接著除去上清而除去所有未結(jié)合的FITC標(biāo)記的抗體。隨后，使用200|iL/孔FACS緩沖液進(jìn)行第二次清洗。使用200)uL/孔2%低聚甲醛重懸浮細(xì)胞，并保存在4°C下過夜。在BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀系統(tǒng)上測量每個(gè)樣品所結(jié)合的焚光，并使用CellQuestPro軟件(BectonDickinson,ver5.2)進(jìn)行分析。對每個(gè)樣品的GeoMean焚光強(qiáng)度相對于TRU-016濃度進(jìn)行作圖。產(chǎn)生劑量應(yīng)答并使用SoftMaxPro軟件(MolecularDevices,ver5.0.1)擬合4-參數(shù)邏輯(4-PL)曲線。將TRU-016的滴度用于形成測試和未處理對照和CS處理樣品的劑量應(yīng)答曲線進(jìn)行比較。(樣品值-自然發(fā)生值)/(最大值-自然發(fā)生值)*100%自然發(fā)生值=僅從靶細(xì)胞釋放的51Cr量最大釋放=從經(jīng)去污劑裂解劑處理的靶釋放的51Cr量背景對照=從靶細(xì)胞+效應(yīng)子細(xì)胞(無TRU-016)釋放的51Cr量[00157產(chǎn)生劑量應(yīng)答并使用SoftMaxPro軟件(MolecularDevices,ver5.0.1)擬合4-參數(shù)邏輯(4-PL)曲線。將TRU-016的滴度用于形成測試和參照材料的劑量應(yīng)答曲線進(jìn)行比較。將經(jīng)處理物品的EC50值與未處理對照(無CS)進(jìn)行比較以測定ADCC活性的提高百分比。下表總結(jié)了圖20中所展示的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示經(jīng)過100pM-800HM終濃度范圍內(nèi)的CS處理的TRU-016的ADCC活性，相對于未處理TRU-016被顯著提高。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>比例1:X^耙與效應(yīng)子比例(從全血新分離的PBMC)對于CD等位基因供體是純合高親和力(高)、純合低親和力(低)或雜合的。[001581盡管根據(jù)上述示范性實(shí)施方式已經(jīng)對本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚可以對本文所描述的組合物和/或方法或者方法中的步驟或步驟的順序進(jìn)行變化，而不離開本發(fā)明38的概念、主旨和范圍。更具體的，明顯的是某些化學(xué)和生理相關(guān)的試劑可以置換本文所描述的試劑，而能達(dá)到相同或相似的結(jié)果。所有這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的類似置換和修飾被認(rèn)為在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的主旨、范圍和概念中。[00159J本文中所引用的參考文獻(xiàn)全部具體地通過參照并入本權(quán)利要求1.提高宿主細(xì)胞所產(chǎn)生免疫糖蛋白分子的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，該方法包括下列步驟在體積為至少1升的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基包含栗精胺，其濃度在大約25至大約800μM之間，這提高了所述宿主細(xì)胞所產(chǎn)生免疫糖蛋白分子的ADCC。2.權(quán)利要求l的方法，其中ADCC被提高至少2倍。3.權(quán)利要求l的方法，其中ADCC被提高至少5倍。4.提高宿主細(xì)胞所產(chǎn)生免疫糖蛋白分子的CD16結(jié)合的方法，其包括下列步驟在體積為至少1升的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基包含栗精胺，其濃度在大約25至大約800^vl之間，這提高了所述宿主細(xì)胞所產(chǎn)生免疫糖蛋白分子的CD16結(jié)合。5.權(quán)利要求4的方法，其中CD16結(jié)合被提高至少50%。6.權(quán)利要求4的方法，其中CD16結(jié)合被提高至少2倍(200%)。7.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基中免疫糖蛋白產(chǎn)量的水平為至少100(ag/mL。8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其中栗精胺以大約100至400(iM之間的濃度存在。9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基基本上無血清。10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中在補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。11.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中在連續(xù)進(jìn)料培養(yǎng)物中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。12.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基包含笫二糖修飾劑。13.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的方法所產(chǎn)生的免疫糖蛋白以及無菌可藥用的載體或稀釋劑。14.殺死或抑制癌癥細(xì)胞生長的方法，其包括為個(gè)體給藥權(quán)利要求13的組合物的步驟，其中所述癌癥細(xì)胞在其表面表達(dá)被所述免疫糖蛋白分子結(jié)合的分子。15.耗盡細(xì)胞的方法，其包括為個(gè)體給藥權(quán)利要求13的組合物，其中所被耗盡的細(xì)胞在其表面表達(dá)被所述免疫糖蛋白分子結(jié)合的分子全文摘要提供了具有改善的ADCC和改變的糖基化特征的免疫糖蛋白，包括抗體。由在包含栗精胺的培養(yǎng)基中生長的宿主細(xì)胞產(chǎn)生了免疫球蛋白。文檔編號C07K16/00GK101646688SQ200780039452公開日2010年2月10日申請日期2007年10月24日優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日發(fā)明者E·S·埃斯普林,P·A·湯普森,P·R·鮑姆申請人:特魯比昂藥品公司