專利名稱：分離得到的o-脫甲基文拉法辛的羥基和n-氧化物代謝物和衍生物以及治療方法
專利說明分離得到的O-脫甲基文拉法辛的羥基和N-氧化物代謝物和衍生物以及治療方法
背景技術：
本申請要求于2006年10月25日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/854,063的優(yōu)選權，將其以全文引入文中作為參考。
文拉法辛化學名稱為1-[2-(二甲基氨基)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]環(huán)己醇，已表明其為一種有效的單胺類神經遞質攝取的抑制劑，一種與臨床抗抑郁藥活性有關的機制。由于其新穎的結構，文拉法辛具有與其它可獲得的抗抑郁藥不相關的作用機理，所述抗抑郁藥例如是三環(huán)類抗抑郁藥地昔帕明、去甲替林(nostriptyline)、普羅替林、丙米嗪、阿米替林(amitryptyline)、曲米帕明和多塞平。
據信，文拉法辛的作用機理與有效抑制單胺類神經遞質5-羥色胺和去甲腎上腺素的攝取有關。文拉法辛還以較低程度抑制多巴胺的重攝取，但對單胺氧化酶無抑制活性。文拉法辛在人體內的主要代謝產物，即O-脫甲基文拉法辛，具有相似的藥理性質。已預測文拉法辛抑制去甲腎上腺素和5-羥色胺(5-HT)攝取的能力具有與三環(huán)類抗抑郁藥相媲美甚至超過后者的效能。Montgomery，S.A.，文拉法辛抗抑郁藥物療法的新維度(VenlafaxineA New Dimension in Antidepressant Pharmacotherapy)，臨床精神病學雜志(J.Clin.Psychiatry)，54(3)119(1993)。
與經典的三環(huán)類抗抑郁藥物相比，實際上文拉法辛在體外與毒蕈堿受體、組胺能受體或腎上腺素能受體無親和力。這些受體上的藥理活性與使用三環(huán)類抗抑郁藥物時可見的各種抗膽堿能作用、鎮(zhèn)靜作用和心血管作用有關。
文拉法辛公開在美國專利號4,535,186(Husbands等人)中，以前已報道過其用作抗抑郁藥。
O-脫甲基文拉法辛(″DV″)化學上命名為1-[2-(二甲基氨基)-1-(4-苯酚)乙基]-環(huán)己醇，其為文拉法辛的主要代謝產物，并已顯示抑制去甲腎上腺素和5-羥色胺攝取。Klamerus，K.J.等人，“文拉法辛和其活性O-脫甲基代謝產物的藥代動力學的復合參數介紹(Introduction of the CompositeParameter to the Pharmacokinetics of Venlafaxine and its ActiveO-Desmethyl Metabolite)”，臨床藥理雜志(J.Clin.Pharmacol)，32716-724(1992)。一種特別有用的具有獨特性質的新的鹽形式的O-脫甲基文拉法辛，O-脫甲基文拉法辛琥珀酸鹽(″DVS″)，公開在美國專利號6,673,838(Hadfield等人)中。
以前，對由文拉法辛和O-脫甲基文拉法辛形成的代謝產物(不論是以其游離堿或鹽的形式)只存在有限的理解。因此，雖然關于文拉法辛的代謝產物的一些信息是已知的，參見Howell，S.R.等人，“14C-文拉法辛在小鼠、大鼠、狗、獼猴和人體內的代謝分布(Metabolic Disposition of14C-Venlafaxine in Mouse，Rat，Dog，Rhesus Monkey and Man)”，Xenobiotica 23(4)349-359(1993)，但是現(xiàn)有技術缺少對所有代謝產物和其活性的完全了解?，F(xiàn)在本發(fā)明人對產生的代謝物和其最后用途具有更加深入的理解。


發(fā)明內容
本發(fā)明提供新的分離得到的被鑒定為DV的代謝物或衍生物的化合物、它們的相應藥物組合物和治療方法。
特別是，本發(fā)明包括分離得到的下式的羥基-DV代謝物或衍生物以及其藥學上可接受的鹽，
其中如虛線框所示羥基連接在環(huán)己基環(huán)上的一個2-位(鄰位)或3-位(間位)碳上。在一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為2-羥基-DV代謝物。在另一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為3-羥基-DV代謝物。
本發(fā)明還包括分離得到的下式的羥基-DV葡糖苷酸代謝物或衍生物以及其藥學上可接受的鹽，
其中，如虛線框所示羥基連接在環(huán)己基環(huán)上的一個2-位(鄰位)或3-位(間位)或4-位(對位)碳上。在一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為2-羥基-DV葡糖苷酸代謝物。在另一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為3-羥基-DV葡糖苷酸代謝物。在另一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為4-羥基-DV葡糖苷酸代謝物。
本發(fā)明還包括分離得到的下式的N-氧化物DV代謝物或衍生物和其藥學上可接受的鹽，
本發(fā)明還包括分離得到的下式的芐基羥基-DV代謝物或衍生物和其藥學上可接受的鹽，
其中羥基連接在芐基的一個2-位或3-位碳上。在一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為2-芐基羥基-DV。在另一個實施方案中，分離得到的DV代謝物為3-芐基羥基-DV。
同樣，本發(fā)明包括藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明的任何代謝物或衍生物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明包括治療至少一種哺乳動物中的中樞神經系統(tǒng)障礙的方法，該方法包括對需要這種治療的哺乳動物提供有效量的本發(fā)明化合物。
附圖簡述

圖1圖示說明了鑒定為DVS代謝物的新的分離得到的化合物。圖1(A)圖示說明4個獨特的羥基-DV化合物。在環(huán)己醇環(huán)上的-OH基團可以在虛框內所示的任一位置。圖1(B)圖示說明4個獨特的羥基-DV葡糖苷酸。在環(huán)己醇環(huán)上的-OH基團可以在虛框內所示的任一位置。圖1(C)圖示說明N-氧化物DV化合物。圖1(D)圖示說明芐基羥基-DV化合物。在芐基環(huán)上的-OH基團可以在虛框內所示的任一位置。
圖2顯示了合成2-羥基DV化合物的方法。
圖3提供了合成2-羥基-DV葡糖苷酸的方法。
圖4圖示說明合成N-氧化物DV化合物的方法。
圖5圖示說明合成芐基羥基DV的方法。
圖6提供了對大鼠單獨口服給藥DVS(20mg/kg)后具有代表性的放射色譜圖。圖6(A)顯示給藥后1小時雄性血漿。圖6(B)顯示給藥后0-8小時收集的雄性尿液。圖6(C)顯示給藥后8-24小時收集的雄性糞便。
圖7圖示說明了DVS的提出的裂解圖和m/z 264的產物離子譜圖。
圖8顯示了大鼠中M6的提出的裂解圖和m/z 280的產物離子譜圖。在整個說明書和附圖中，跟有數字的字母“M”是指本文所述的代謝產物。
圖9提供了大鼠中M7的提出的裂解圖和m/z 440的產物離子譜圖。
圖10顯示了大鼠中M10的提出的裂解圖和m/z 250的產物離子譜圖。
圖11顯示了合成的N，O-二脫甲基文拉法辛的提出的裂解圖和[m+h]+(m/z 250)的產物離子譜圖。
圖12提供了大鼠中M13的提出的裂解圖和m/z 426的產物離子譜圖。
圖13提供了大鼠中N-氧化物DV的提出的裂解圖和m/z 280的產物離子譜圖。
圖14顯示了對狗單獨口服給藥DVS(30mg/kg)后具有代表性的放射色譜代謝物輪廓圖(profile)。(a)給藥后1小時血漿，(b)給藥后8-24小時收集的尿液，和(c)給藥后0-24小時收集的糞便。
圖15提供了狗中的M6的提出的裂解圖和m/z 280的產物離子譜圖。
圖16顯示了狗中的M7的提出的裂解圖和m/z 440的產物離子譜圖。
圖17顯示了狗中的M9的提出的裂解圖和m/z 280的產物離子譜圖。
圖18提供了狗中的M10的提出的裂解圖和m/z 250的產物離子譜圖。
圖19顯示了狗中的M12的提出的裂解圖和m/z 456的產物離子譜圖。
圖20顯示了狗中的M13的提出的裂解圖和m/z 426的產物離子譜圖。
圖21提供了狗中的M14的提出的裂解圖和m/z 236的產物離子譜圖。
圖22顯示了合成的N，N，O-三脫甲基文拉法辛的提出的裂解圖和[m+h]+(m/z 236)的產物質譜圖。
圖23顯示了狗中N-氧化物DV的提出的裂解圖和m/z 280的產物離子譜圖。
發(fā)明詳述 I.本發(fā)明的化合物 A.分離得到的DV代謝物和衍生物 本發(fā)明涉及新鑒定的預期具有有益性質的DV代謝物和衍生物。所述化合物中的一些為天然代謝物(在體內和其模型中由酶反應和其他反應產生的那些)，其他的為預期具有基本相似的活性的相關結構(衍生物)。圖1顯示了這些化合物的結構。
如圖1(A)所示，(2或3)-羥基-DV化合物是羥基基團在2位或3位碳之一的位置處連接在環(huán)己基環(huán)上的羥基化的DV衍生物。2位或3位碳為圖1(A)虛線框內的碳。在2位或3位碳上總共有八個可能的連接位置(每個碳2個)，然而，由于對稱性，環(huán)上2位和2位碳的集合(sets)可得到4個不同的化合物。因此，羥基基團可以連接在2位碳的兩個位置中的任一位置或3位碳的兩個位置中的任一位置。
在環(huán)己基環(huán)的2-、3-、4-位中的任一位置上羥基化的DV代謝物可以經葡萄苷酸化形成環(huán)己基羥基-DV葡糖苷酸，如圖1(B)所示。羥基基團可以連接在虛線框內的任意一個碳上。
圖1(C)顯示N-氧化物DV，一種在二甲基氨基基團的氮上連有氧的DVS衍生物。
圖1(D)顯示芐基羥基DV，一種帶有連接在芐基環(huán)上的2-位或3-位碳上的羥基基團的DVS代謝物或衍生物。
本申請?zhí)峁┝孙@示每個化合物結構的附圖；作為DV代謝物的化合物的信息；每個化合物的分離和/或合成以及預期的活性。
1.從大鼠體內試驗鑒定的化合物 單獨口服給藥20mg/kg(按游離堿的量測定)后，在大鼠中研究DVS的代謝。在大鼠體內，DVS被廣泛而快速地代謝，主要代謝為O-脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(DV葡糖苷酸)。在所有被分析的血漿和尿液樣品中，DV葡糖苷酸為主要的藥物-相關的化合物。
用LC/MS以及在一些樣品中用放射色譜法檢測到M1-M6六個不同的羥基-代謝物。在這些代謝物中，羥基連接在環(huán)己醇環(huán)的2-、3-和4-位上，得到6個不同的化合物，即M1-M6。在大鼠中沒有觀察到這些羥基DV代謝物的葡糖苷酸類。經LC/MS在大鼠血漿、尿液和糞便中觀察到N-氧化物DV。還觀察到其他的代謝物。
2.從狗體內試驗鑒定的化合物 單獨口服給藥30mg/kg(游離堿)后，在比格狗中研究DVS的代謝。在狗體內，DVS被廣泛而快速地代謝。DV葡糖苷酸為用血漿和尿液樣品的放射色譜圖檢測到的最大量的代謝物。
在血漿、尿液和糞便中經LC/MS觀察到化合物M1-M6。在尿液中(經放射色譜法和LC/MS)觀察到化合物M11和M12。在血漿(經LC/MS)、尿液(經LC/MS)和糞便(經放射色譜法和LC/MS)中觀察到N-氧化物DV化合物。還觀察到其他的代謝物。
總之，DVS在狗體內被快速而廣泛地代謝為許多代謝物。檢測到的量最多的代謝物為DV O-葡糖苷酸。該研究中觀察到的代謝物與口服給藥后在大鼠血漿、尿液和糞便中觀察到的代謝物相類似，且在比格狗中觀察到更多數量的代謝物。
B.活性 本發(fā)明的化合物作為DVS的代謝物或衍生物被檢測到，并被認為具有與文拉法辛和DVS相似類型的活性。由于在產生活性前葡糖苷酸在體內被裂解，因此認為羥基-DV葡糖苷酸作為前藥起作用。葡糖苷酸的裂解可以經由β-葡糖醛酸糖苷酶(其在胃腸道里是特別有活性的)的作用進行，或在酸性條件(例如胃中的酸性條件)下進行。羥基-DV和N-氧化物DV化合物預期以它們的當前形式起作用?？梢杂帽炯夹g領域熟知的受體測定結合研究和體內代謝和效力研究測定本發(fā)明的化合物的具體生物活性。見實施例5。
C.合成 1.游離堿化合物的合成 本發(fā)明化合物可以由本領域的技術人員采用下面所述的方法、以及有機合成領域中已知的合成方法或這些方法的變通方法來制備。通常，參見綜合有機合成(Comprehensive Organic Synthesis)，“現(xiàn)代有機化學中的選擇性、策略&效率(Selectivity，Strategy & Efficiency in Modern OrganicChemistry)”，I.Fleming主編，Pergamon出版社，紐約(1991)；綜合有機化學(Comprehensive Organic Chemistry)，“有機化合物的合成和反應(TheSynthesis and Reactions of Organic Compounds)”，J.F.Stoddard主編，Pergamon出版社，紐約(1979)。合適的方法包括但不限于下面所羅列的方法。
圖2提供一種合成本發(fā)明的2-羥基DV化合物的方法。本合成的第一步中，用芐基保護4-(脫甲基氨基甲酰基甲基)苯酚。溴芐保護基團非常適合用于合成本發(fā)明化合物的方法中，因為其在最終步驟中易于除掉。但是，也可以使用其他保護基團。
在第二步中，在適當的使用二異丙基氨基鋰作為反應試劑的條件下，加入經保護的2-羥基環(huán)己酮(在羥基處保護)的酸性溶液。適當的保護基團為本領域已知的，包括芐基-、三甲基硅烷基-和叔丁基-二甲基硅烷基-基團。
在第三步中，用氫化鋁鋰除去酮基?；蛘撸梢杂门饸浠c除去酮基。最后一步除去保護基團。采用適當的保護的3-取代的環(huán)己酮，可以用相似的方法來合成3-羥基DV化合物。此外，通過使用適當的保護的4-取代的環(huán)己酮，可以用該方法制備4-羥基DV化合物。
圖3提供一種合成羥基DV葡糖苷酸的方法。在該方法中，如圖所示，將適當的羥基-DV化合物偶聯(lián)至葡糖苷酸的三氯亞胺酯。
圖4提供一種合成N-氧化物DV化合物的方法。在該方法中，N-氧化物DV通過用3-氯過氧苯甲酸(MCPBA)氧化O-脫甲基文拉法辛來制備。
芐基羥基DV化合物可以根據Yardley，JP等人，“2-苯基-2-(1-羥基環(huán)烷基)乙胺衍生物合成和抗抑郁活性(2-Phenyl-2-(1-hydroxycycloalkyl)ethylamine DerivativesSynthesis andAntidepressant Activity)”，藥物化學雜志(Journal of Medicinal Chemistry)33(10)2899-905(1990)中所列的方法制備。在本發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)下(這些化合物是需要的)，本領域的技術人員能夠改變用于制備Yardley所述的其他結構的合成流程以合成2-芐基羥基DV化合物和3-羥基DV化合物。例如，以(3，4-雙-芐氧基-苯基)-乙酸為原料，可以如圖5所示制備3-取代的芐基羥基DV。如另一個實例，(2，4-雙-芐氧基-苯基)-乙酸可以用來制備2-取代的芐基羥基DV化合物?；蛘?，根據Yardley的方法，可以用(2，4-雙-芐氧基-苯基)-乙腈和(3，4-雙-芐氧基-苯基)-乙腈來制備相應的2-和3-取代的芐基羥基DV化合物。
2.鹽的合成 本發(fā)明化合物的游離堿和鹽形式均可能是有用的。本發(fā)明的堿性化合物的藥學上可接受的酸加成鹽可以如下常規(guī)地形成使游離堿與等量的能形成無毒的鹽的任何酸反應。示例性酸是無機或有機的，包括鹽酸、氫溴酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、硫酸、磷酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、草酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、乙烯磺酸、葡糖酸、谷氨酸、羥乙磺酸、乳酸、蘋果酸、苦杏仁酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、撲酸、泛酸、對-甲苯磺酸和類似的酸。對于腸胃外給藥，可以使用水溶性的鹽，盡管游離堿或藥學上可接受的鹽都適用于本發(fā)明化合物的口服或腸胃外給藥。
3.立體化學 除非另外說明，本發(fā)明化合物以對映異構體形式存在，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的外消旋混合物以及立體異構純的形式(R-對映體和S-對映體)。
D.分離 或者，本發(fā)明化合物可以通過本領域已知的技術從含有該化合物的血漿、尿液或糞便樣品中或者從含有該化合物的體外系統(tǒng)中分離得到。特別是，化合物可采用制備型的HPLC(制備HPLC)在致使個體代謝物的分離的條件下分離得到，所述條件例如是采用兩種流動相A和B的線性梯度，其中流動相A可以為10mM的乙酸銨，pH 5.5，流動相B可以為乙腈，在能致使分離的流速下，如實施例1-2中所述。
如此分離得到的化合物可以是純的形式或可以是基本上純的形式，也就是將它們從自然環(huán)境中移出?；旧霞兊幕衔锇?9％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％純的化合物。
E.藥物劑型 包含本發(fā)明化合物的藥物組合物代表本發(fā)明的另一個方面?；钚猿煞挚梢曰旌显谌魏纬Ｓ玫目诜┬椭?，所述口服劑型包括片劑、膠囊劑和液體制劑(例如酏劑和混懸劑)，其包含各種著色劑、矯味劑、穩(wěn)定劑和掩蓋味道的物質。對于混合口服劑型來說，活性成分可以與各種普通片劑材料(例如淀粉、碳酸鈣、乳糖、蔗糖和磷酸二鈣)混合以助于壓片和裝入膠囊。硬脂酸鎂，作為一種添加劑，當需要時提供有用的潤滑作用?；钚猿煞挚梢栽谒帉W上可接受的無菌液體載體例如無菌水、無菌有機溶劑或兩者的混合物中溶解或混懸。液體載體可以是適合注射劑的載體。當活性成分是充分可溶解的時，它能夠溶解在作為載體的生理鹽水中；如果活性成分在生理鹽水中溶解性太差，通常可將它溶解在適當的有機溶劑例如丙二醇或聚乙二醇水溶液中。含有10％-75％重量的丙二醇的丙二醇水溶液是普遍適用的。在其他情況下，其他組合物可以通過將微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纖維素鈉的水溶液中或分散在適當的油(例如花生油)中來制得。液體藥物組合物(其為無菌溶液劑或混懸劑)可以用于肌肉內注射、腹膜內注射或皮下注射。
本發(fā)明的化合物可以根據常規(guī)藥物配制技術與藥物載體或賦形劑(例如藥學上可接受的載體和賦形劑)混合形成藥物組合物或劑型。適當的藥學上可接受的載體和賦形劑包括但不限于Remington’s藥劑學科學和實踐(The Science and Practice of Pharmacy)(Gennaro，A.R.主編，第19版，1995，Mack Pub.Co.)所描述的那些。術語“藥學上可接受的”是指當給藥至動物例如哺乳動物(例如人類)時生理學上可耐受且通常不會產生過敏或類似的不良反應(例如嘈雜、頭暈等)的添加劑或組合物。對于口服液體藥物組合物而言，藥物載體和賦形劑可以包括但不限于水、二醇類、油、醇、矯味劑、防腐劑、著色劑等等。口服固體藥物組合物可以包含但不限于淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、制粒劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑。藥物組合物和劑型還可以包含如上面所討論的文拉法辛、O-脫甲基文拉法辛或其鹽。
劑型包括但不限于片劑、含片、錠劑、分散劑、混懸劑、栓劑、軟膏劑、泥敷劑、糊劑、散劑、乳劑、溶液劑、膠囊(包括膠囊化的球形體劑)和貼劑。劑型也可包括速釋制劑以及適于控釋、持續(xù)釋放、延長釋放或延緩釋放的制劑。片劑和球形體劑可以按照要求用標準的含水或非水技術包衣。
藥物組合物可以在單位劑型中，例如作為片劑或膠囊劑。在此類形式中，將組合物細分為含有適當量的活性成分的單位劑量；單位劑型可以是包裝的組合物，例如，包裝的散劑或小瓶劑或安瓿劑。單位劑型可以為膠囊劑、扁囊劑或片劑本身，或者可以是包裝形式的適當數量的任何上述制劑。在單位劑量組合物中的活性成分的量可以根據具體需要和活性成分的活性來改變或調節(jié)。
II.治療方法 A.可治療的疾病 本發(fā)明的方法包括對需要這種治療的哺乳動物給藥有效量的一種或多種本發(fā)明化合物。
本發(fā)明的化合物被認為具有與文拉法辛和O-脫甲基文拉法辛相似類型的活性。羥基-DV葡糖苷酸可以充當前藥，在體內失去葡糖苷酸片段形成相應的羥基-DV化合物。葡糖苷酸的裂解可以通過在胃腸道中特別有活性的β-葡糖醛酸糖苷酶作用下或者在酸性條件(例如胃中的酸性條件)下進行。預期其余化合物以它們的當前形式發(fā)揮活性。
如在當代藥理學綜述(Reviews in Contemporary Pharmacology)，卷9(5)，293-302頁(1998)中所述，O-脫甲基-文拉法辛具有如表1所示的藥理學性質。
表1.O-脫甲基文拉法辛的藥理學性質 作用(體內) 利血平誘導的低溫過低的逆轉 (最小效應mg& g i.p.)3 作用(體外) 抑制胺的再攝取 (IC50；uM) 去甲腎上腺素 1.16 5-羥色胺 0.18 多巴胺13.4 對各種神經受體的親和力 (在1uM下的抑制作用％) D26 s膽堿能 7 腎上腺素能a 0 組胺Hi0 阿片 7 因此，本發(fā)明的化合物、組合物和方法可以用來治療患有或易患至少一種中樞神經系統(tǒng)障礙的患者，中樞神經系統(tǒng)障礙包括但不限于抑郁(包括但不限于嚴重抑郁性障礙、雙相情感障礙和心境惡劣)、纖維肌痛、焦慮、驚恐性障礙、廣場恐怖癥、創(chuàng)傷后應激障礙、月經前焦慮障礙(也被稱為經前期綜合癥)、注意力缺陷障礙(有或無活動過度)、強迫癥(包括拔毛癖)、社交焦慮障礙、廣泛性焦慮癥、自閉癥、精神分裂癥、肥胖癥、神經性厭食癥、神經性貪食癥、抽動穢語綜合征(Gilles de la Tourette Syndrome)、血管舒張潮紅(vasomotor flushing)、可卡因和酒精成癮、性功能障礙(包括早泄)、邊緣型人格障礙、慢性疲勞綜合癥、失禁(包括大便失禁、充溢性尿失禁、被動性失禁、反射性失禁、應激性尿失禁、欲望性尿失禁、用力性尿失禁和尿失禁)、疼痛(包括但不限于偏頭痛、慢性背痛、幻肢痛、中樞性痛、神經性疼痛例如糖尿病性神經病和皰疹后神經病)、夏伊-德雷格(Shy Drager syndrome)綜合癥、雷諾氏(Raynaud’s)綜合癥、帕金森病、癲癇等。本發(fā)明的化合物和組合物也可用于預防抑郁癥的復發(fā)或再發(fā)，包括對以前患有抑郁癥現(xiàn)在正處于緩解階段的病人的持續(xù)性治療；治療認知缺損；誘導患有老年癡呆、阿爾茨海默病、記憶喪失、健忘和健忘綜合癥的病人的認知增強作用和/或提高情緒；用于停止吸煙或使用其他煙草的方案。此外，本發(fā)明的化合物和組合物還可用于治療抑郁和非抑郁的女性人類的下丘腦性閉經。
B.給藥和劑量 本發(fā)明提供治療、預防、抑制或緩解哺乳動物(包括人)的每種上面所列的疾病的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明化合物給藥至需要這種治療的哺乳動物。有效量是足以預防、抑制或緩解上面所提病癥的一種或多種癥狀的量。
用于治療、預防、抑制或緩解每種上述病癥的劑量可以隨著待治療病癥的嚴重性和給藥途徑而改變。劑量和劑量頻率也可根據個體人類患者的年齡、體重、響應和既往病史而改變。一般來說，對本文所描述的病癥的推薦日劑量范圍為每日10-1000mg本發(fā)明化合物。其他適當的劑量包括每日50-800mg、每日75-600mg、每日100-500mg、每日150-300mg和每日200mg。具體劑量包括上面所列的所有端點劑量。劑量是就游離堿而不是任何特定的藥學上可接受的鹽進行描述的。在處理病人時，治療可以從較低的劑量開始，如果需要再增加劑量。對非人類患者的劑量可以由本領域技術人員根據上述進行調節(jié)。
也可以以與文拉法辛、O-脫甲基文拉法辛、DVS或它們的其他藥學上可接受的鹽組合的方式提供本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物也可與其他已知的有精神病學方面活性的化合物(例如其他抗抑郁藥或抗焦慮藥)、激素治療、疼痛藥物和其他治療一起被提供。
可以采用任何適當的給藥方式向患者提供有效量的相關化合物。例如，可以采用口服的、粘膜的(例如鼻、舌下、口腔、直腸或陰道的)、腸胃外的(例如靜脈的或肌內的)、經皮的和皮下的途徑。
下列實施例用來說明本發(fā)明，但并不意味著限制本發(fā)明。
實施例 實施例1.單獨口服給藥后Sprague Dawley大鼠中[14C]DVS的代謝 如下面所述對雄性和雌性大鼠單獨口服管飼給藥后，在尿液、糞便和血漿中在[14C]DVS的代謝輪廓圖中檢測到六種羥基DV化合物和N-氧化物DV化合物以及其他化合物。
放射性標記的[14C]DVS(批次#CFQ13003，[環(huán)己基-1-14C]DVS)由安瑪西亞生物科學(Amersham Biosciences)(Buckinghamshire，英國)提供。從惠氏研發(fā)機構(Wyeth Research)，Rouses Point，NY得到未標記的DVS(批次RB1636；游離堿65.2％)。DVS的平均分子量為381.5，其中O-脫甲基文拉法辛占重量的69.0％。經采用放射性檢測的HPLC測定，[14C]DVS(原料藥)的比活性為144μCi/mg(對于游離堿為209μCi/mg)，游離堿的放射純度為99.3％。
用于制備口服給藥溶液的水從EM Science(Gibbstown，NJ)得到。甲基纖維素和聚山梨酯80分別從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)和Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)獲得。用于在尿液和血漿樣品、糞便的勻漿提取物和給藥溶液等分試樣中計算放射性的液體閃爍液(scintillation cocktail)為Ultima GoldTM(Perkin Elmer，Wellesley，MA)。
將配備有Oximate-80機器自動進樣器(Perkin Elmer)的307型Tri-Carb樣品氧化器用于血液和糞便樣品的氧化。Perma

E+液體閃爍液(Perkin Elmer)、

E(Perkin Elmer)二氧化碳吸收劑和HPLC級別的水用于捕獲由樣品在氧化器中氧化所產生的放射性二氧化碳。將糞便勻漿和血液樣品轉移至氧化-錐體中封上蓋子(Perkin Elmer)，以進行氧化。
采用Sprague Dawley大鼠(12只雄性和6只雌性)，給藥時雄性重量在0.311-0.345kg之間，雌性在0.263-0.311kg之間。使動物可隨意接觸食物和水。為了方便報告，指定動物編號，雄性大鼠為001M至012M，雌性大鼠為001F至006F。從上次時間點起，每種性別三只動物，單獨籠養(yǎng)在代謝籠里，以收集尿液和糞便。其余的動物單獨籠養(yǎng)在標準籠里。
口服給藥溶液通過混合86.4mL的3.0mg/mL(2.0mg/mL，游離堿)未標記的DVS溶液與3.6mL的4.3mg/mL(3.0mg/mL游離堿)[14C]DVS溶液來制備。在含有0.25％聚山梨酯80和0.5％甲基纖維素的水中制備溶液。經采用放射性檢測法的HPLC測定[14C]DVS(原料藥和給藥溶液)的放射化學純度、比活性和濃度。取給藥前、給藥中和給藥后的給藥溶液等分試樣，以測定給藥溶液的比活性和放射性濃度。
每只動物的目標劑量為經口服管飼給藥30mg/kg(游離堿；3.0mg/mL，10mL/kg，250μCi/kg)[14C]O-脫甲基文拉法辛。
在適當的時間點(雄性大鼠為1、4、8和24小時，雌性大鼠為1和8小時，對于每種性別每個時間點N＝3)通過心臟穿刺收集全血(大約5mL)至肝素化管中。將全血的三份等分試樣(200μL)放置在氧化-錐體中，稱重，并風干。將這些樣品氧化。剩余的血液在5000xg和4℃下離心10分鐘(Model Legend RT離心機，Sorvall)。將所得血漿轉移至新試管中，分析三份等分試樣(100μL)的放射性含量。剩余的血漿在-70℃下保存直到代謝分析。
來自每種性別三只動物的尿液和糞便分別收集在干冰上。對雄性大鼠來說收集0-8小時和8-24小時的，對雌性大鼠來說收集0-8小時的。糞便樣品在大約5體積(v/w)的水中進行勻化處理。將勻漿的大約0.4克等分試樣置于氧化-錐體中，稱重，并風干。然后將這些樣品氧化。將剩余的尿液樣品和糞便勻漿在-70℃下保存直到代謝分析。
用

E(6mL)作為捕獲劑、Perma

E+(10mL)作為閃爍劑，在307型Tri-Carb樣品氧化器中氧化血液樣品和糞便勻漿。通過14C-Spec-Chec(Perkin Elmer)(一種已知的放射性標準物質)的氧化來測定氧化效率，測定為98.7％。從每一樣品讀數中減除背景讀數(對照血液或糞便樣品的平均)。加入10mL Ultima GoldTM閃爍液后直接分析尿液和血漿的等分試樣。
采用具有Ultima GoldTM或甲苯標準曲線的Tri-Carb型3100TR液體閃爍計數器(Perkin Elmer)來進行所有的放射性測定。通過使用已知放射性的外標物質將每分鐘計數(CPM)轉化為每分鐘衰變數(DPM)。通過外部放射性標準物質的轉換的譜指數(tSIE)來測定每種標準物質的淬滅。檢測的下限規(guī)定為2倍背景。
血漿代謝物樣品 用給藥后1、4和8小時收集的血漿樣品來分析代謝物輪廓圖。將0.5mL血漿的等分試樣與等體積的乙腈混合，置于冰上大約10分鐘，然后在Sorvall Super 21離心機中在3500rpm和4℃下離心10分鐘。將上清液轉移至干凈的試管中。分析上清液的放射性。在Turbo Vap(Zymark，Hopinkton，MA)中、氮氣流下濃縮上清液以除去乙腈。通過HPLC分析含水殘留物的一份等分試樣，用于繪制代謝物輪廓圖。還用LC/MS來分析所選擇的樣品，以鑒定放射性的峰。
測定大鼠血漿中[14C]DVS的穩(wěn)定性。將[14C]DVS(0.01mg/mL，終濃度)加入對照大鼠血漿中，在設定為37℃的振搖水浴中孵育。在0、1、4、8和24小時時取出等分試樣(0.5mL)。如上面所述那樣提取樣品，并用HPLC分析法測定放射性純度。
尿液代謝物樣品 將所有的尿液樣品進行代謝物輪廓圖分析。將0.5mL尿液的等分試樣在Sorvall Super 21離心機中以3500rpm和4℃下離心10分鐘。將上清液轉移至新試管中，分析放射性含量，并用HPLC繪制輪廓圖。還用LC/MS分析所選擇的樣品，以鑒定放射性峰。
測定在大鼠尿液中的[14C]DVS的穩(wěn)定性。將[14C]DVS(0.13mg/mL，終濃度)加入至對照大鼠尿液，并在設置為37℃的振搖水浴中孵育。在0、1、4、8和24小時取出等分試樣(0.5mL)。如上面所述提取樣品，并用HPLC分析法測定放射性純度。
糞便代謝物樣品 對在給藥后8至24小時之間從雄性大鼠收集的糞便勻漿進行代謝物輪廓圖分析。將糞便勻漿的大約1克的等分試樣在Sorvall Super 21離心機中以3500rpm和4℃下離心10分鐘。將上清液轉移至干凈的試管中。將殘留物用1mL的水∶乙腈(1∶1，v∶v)重新混懸，如上面所述離心。將所得的上清液與原來的上清液混合，殘留物用1ml乙腈再混懸。如上面所述離心混懸液，合并上清液，分析放射性。然后將上清液在Turbo Vap中、氮氣流下濃縮除去乙腈。用HPLC分析含水殘留物的一等分試樣，以繪制輪廓圖。還用LC/MS分析所選擇的樣品，以鑒定放射性峰。
樣品分析 用Waters Alliance 2690型HPLC系統(tǒng)(Waters Corp.，Milford，MA)來進行色譜分析。其配備內置的自動進樣器，并用2487型可調式UV檢測器(設定225nm監(jiān)測)和具有250μL LQTR流動池的FloOneβ525型放射性流動檢測器(Perkin Elmer)在線檢測。Ultima Flow M閃爍液的流速為1mL/min，使得閃爍液和流動相的混合比為5∶1。代謝物峰的分離是在Phenomenex Luna C18(2)柱，150×2.0mm，5μm(Phenomenex，Torrance，CA)上采用兩種流動相A和B的線性梯度來實現(xiàn)的。流動相A為10mM的乙酸銨，pH 6.0，流動相B為乙腈。流速為0.2mL/min。流動相如表2所示那樣遞送。


LC/MS分析采用包括自動進樣器和二極管陣列UV檢測器的AgilentModel 1100 HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Wilmington，DE)。UV檢測器設定為監(jiān)測200-400nm。分離通過5μm Phenomenex Luna C18(2)柱，150×2mm(Phenomenex)來實現(xiàn)。柱溫為25℃。流動相和梯度程序如下所示。
用于代謝物鑒定的質譜儀為Micromass Q-TOF-2四極飛行時間混合質譜儀(Micromass，Inc.，Beverly，MA)。質譜儀配備電噴離子化(ESI)接口，并在正離子化模式下操作。質譜儀的設置如表3所列。

采用FloOne分析軟件(3.65版本，Packard BioScience，Boston，MA)收集數據和分析放射峰。用計算機程序Microsoft

97來計算平均值和標準偏差。MassLynx software(3.5版本)用來分析LC/MS數據。
結果 用采用放射性檢測的HPLC來測定[14C]DVS(原料化合物)的放射化學純度和比活性，分別為99.3％和209μCi/mg(游離堿)。在給藥溶液中[14C]O-脫甲基文拉法辛的濃度、放射純度和比活性分別為2.05mg/mL、97.8％和11.7μCi/mg。給藥溶液的給藥前、給藥中和給藥后等分試樣具有相似的濃度和純度。[14C]DVS的平均給藥劑量為19.9±0.24mg/kg(游離堿)。這個劑量與30mg/kg(游離堿)的目標劑量有偏差是因為用于劑量配制的初始稱量沒有考慮到DVS是O-脫甲基文拉法辛(游離堿)的琥珀酸鹽。
[14C]DVS在對照大鼠尿液和血漿中的穩(wěn)定性 [14C]DVS在對照大鼠尿液和對照大鼠血漿中在37℃下都可穩(wěn)定高達24小時。[14C]DVS在大鼠血漿中的放射純度在所有的時間點都大于98.9％，而在大鼠尿液中放射純度在所有的時間點都大于99.5％。
血液與血漿分配 血液和血漿中的放射性濃度和血液與血漿分配如表4所示。血液或血漿中檢測到的放射性濃度在雄性和雌性大鼠之間沒有顯著的區(qū)別。在給藥后1、4、8和24小時雄性大鼠的總放射性的平均血漿濃度分別為11.0、1.48、0.89和0.07μg當量/mL。對雌性大鼠來說，在給藥后1和8小時總放射性的平均血漿濃度分別為9.90和0.92μg當量/mL。在1、4和8小時時間點，兩種性別的大鼠中血液與血漿的放射性比率為0.59-0.67，在24小時時間點時雄性大鼠中的該比率為0.99。
表4.對大鼠單獨口服給藥[14C]DVS(20mg/kg)后全血和血漿放射性濃度和放射性的分配
血漿代謝物輪廓圖 血漿中放射性的平均提取效率為98.7±13.0％(數據未顯示)。給藥后1小時從雄性大鼠收集的大鼠血漿的代表性的放射色譜圖如圖6(A)所示。在給藥后1和4小時，DV葡糖苷酸(如表4所列的M7)為放射色譜法所檢測到的主要的峰。在給藥后1和4小時，雄性大鼠血漿中放射性的88.7和93.6％分別與DV葡糖苷酸峰有關。雌性大鼠中，給藥后1小時，DV葡糖苷酸占血漿放射性的86.6％。8和24小時樣品沒有足以被放射色譜法檢測到的放射性。當檢測時，在血漿樣品中僅有的其它主要放射色譜峰為未變化的DVS，占血漿中放射性的2.6-10％。在一些血漿樣品中檢測到的其它較少的代謝物包括在環(huán)己烷環(huán)上羥基化的代謝物(M1-M6，羥基DV化合物)。個別地，在每個時間點M1-M6占血漿中的放射性的少于2％。
在大鼠血漿中另外的較少的代謝物(沒有出現(xiàn)在放射色譜圖中)被LC/MS檢測到和鑒定(表5)。這些代謝物包括N-氧化物DV、N，O-二脫甲基文拉法辛(M10)、N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(M13)。

尿液代謝物輪廓圖 尿是排泄的主要途徑，在給藥后首個8小時內在尿液樣品中回收的放射性劑量大于50％，在給藥后24小時內回收的為85％。在尿液中檢測的放射性濃度如表6所示，作為放射色譜分析后放射性的百分比分布。給藥后0-8小時間收集的大鼠尿液的代表性的放射色譜圖如圖6(B)所示。在所有被分析的樣品中檢測到的主要放射性峰為DV葡糖苷酸(M7)，其大約占各個時間點的所有尿液樣品中檢測到的放射峰的75％。未變化的[14C]DVS占尿液中檢測到的放射性的9％-20％。在尿液中用放射色譜法檢測到兩個少量的羥基-DV化合物。其中之一的M2是這些代謝物中量最大的，占尿中放射性的7.5％。
表6.對大鼠單獨口服給藥[14C]DVS(20MG/KG)后放射性的尿液濃度和百分比分布
a值用放射色譜法檢測到的總峰的百分數來表示。
通過LC/MS在尿液中檢測并鑒定了其它較少的代謝物(其在放射色譜圖中未出現(xiàn))(表5)。這些代謝物包括M3、M4、M5、M6、N-氧化物DV、N，O-二脫甲基文拉法辛(M10)、N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(M13)。
糞便代謝物輪廓圖 放射色譜分析前從8-24小時的糞便樣品的放射性的提取效率為74.8±1.9％(數據未顯示)。只有少量百分比的放射劑量(大約10％)在給藥24小時內從糞便中排出。少于0.1％的放射劑量在0-8小時的糞便樣品中排出。經放射色譜分析后來自個體大鼠的糞便中的回收率和放射性分布如表7所示。給藥后8-24小時收集的經提取的大鼠糞便的代表性的放射色譜圖如圖6(C)所示。放射色譜法檢測到的最大量的峰為N，O-二脫甲基文拉法辛(M10)，占糞便放射性的34％。糞便中大約21％的放射性為未變化的DVS。N-氧化物DV占糞便放射性的7％。羥基化的代謝物M1-M6總共大約占糞便放射性的38.6％，其個體代謝物鹵糞便中放射性的1.7-12.2％。只有通過LC/MS才能在糞便中觀察到少量的O-脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(M7)。
表7.對大鼠單獨口服給藥[14C]DVS(20MG/KG)，給藥后8-24小時收集的糞便中的放射性濃度和百分比分布
a值用放射色譜法檢測到的總峰的百分比表示。
b給藥后0-8小時從雄性和雌性大鼠收集到的分別含有0.017％和0.025％放射劑量的糞便樣品，不能用放射色譜法分析。
液相色譜/質譜標鑒定的代謝物 質譜是通過LC/MS和LC/MS/MS對大鼠血漿、尿液和糞便中的DVS和它的代謝物進行分析得到的。大鼠的DVS代謝物的結構鑒定如表5所總結。LC/MS數據顯示DVS代謝為葡糖苷酸(M7)、N，O-二脫甲基文拉法辛(M10)和羥基化產物(M1-M6)。這些代謝物、DVS、N-氧化物DV和較少的代謝物(M13)的質譜鑒定如下所討論。
DVS 測定DVS標準物質的質譜特征，用于跟代謝物作比較。在DVS的LC/MS譜圖中，在m/z 264處觀察到質子化的分子離子[M+H]+。圖7顯示由碰撞誘導解離(CID)得到的DVS的m/z 264的產物質譜圖和提出的裂解圖。分子離子失去H2O得到m/z 246的產物離子。進一步失去二甲基氨基得到m/z 201的產物離子。從DVS失去環(huán)己醇基團用m/z 164的產物離子表示。m/z 58的產物離子歸屬為(CH3)2NCH2+。另外，m/z 107、133、145、159和173的產物離子分別對應于DVS分子的甲基、丙基、丁基、戊基和己基-苯酚片斷。因此，這些離子可以用來檢測位于二甲基氨基、羥基芐基和環(huán)己醇基團的代謝位點。
代謝物M1、M2、M3、M4、M5和M6(羥基DV化合物) 代謝物M1至M6產生m/z 280的[M+H]+，比DVS大16Da，表明羥基化或N-氧化。圖8顯示了M6的m/z 280的產物譜圖。代謝物M1-M6的質譜數據是相似的。從分子離子失去H2O得到m/z 262的產物離子。代謝物的m/z 58、107和217的產物離子與DVS的m/z 58、107和201的產物離子相對照，表明環(huán)己烷環(huán)為代謝位點。因此，提出代謝物M1至M6是環(huán)己烷環(huán)為氧化位點的羥基DVS代謝物。
代謝物M7(O-脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸，DV葡糖苷酸) 在m/z 440處觀察到該代謝物的[M+H]+，表明分子量為439。圖9顯示了M7的m/z 440的產物譜圖。分子離子失去176Da得到m/z 280的離子，表明該代謝物為葡糖苷酸。也可觀測到DVS的m/z 246、201、159、145、133、107和58的產物離子。這些質譜數據沒有表明結合的位點。然而，DVS經過相同的失去H2O生成m/z 246的[MH-H2O]+(圖7)。這些H2O的丟失發(fā)生在環(huán)己醇基團上。這表明苯酚而不是環(huán)己醇為葡糖苷酸化位點。此外，苯酚基團為代謝上更可能進行結合的位點。因此，M7鑒定為DVS的O-葡糖苷酸，且苯酚基團為結合位點。
代謝物M10(N，O-二脫甲基文拉法辛) 在m/z 250處觀測到M10的[M+H]+。圖10顯示了M10的m/z 250的產物譜圖。m/z 250的分子離子失去H2O，得到m/z 232的產物離子。隨后從m/z 232失去甲胺生成m/z 201的特征的產物離子。這，以及缺少m/z 58的產物離子，表明DVS的二甲基氨基基團經N-脫甲基化已轉換為甲基氨基基團。M10的m/z 250的產物質譜圖與合成的N，O-二脫甲基文拉法辛的m/z 250的產物質譜圖相符合。圖11顯示了合成的N，O-二脫甲基文拉法辛的m/z 250的產物質譜圖。因此，M10鑒定為N，O-二脫甲基文拉法辛。
代謝物M13(N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸) 在m/z 426處觀測到該代謝物的[M+H]+，表明分子量為425。圖12顯示了M13的產物離子譜圖。從m/z 426失去176Da得到m/z 250的離子。從環(huán)己醇基團失去H2O得到m/z 408的基峰。從m/z 408的離子失去176Da得到M10的m/z 232的特征性產物離子。隨后從m/z 232失去甲胺生成產物m/z 201的離子。因此，提出M13為N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸，且苯酚基團為葡糖苷酸化位點。
N-氧化物DV 在m/z 280處觀測到該DVS相關成分的[M+H]+，這表明羥化或N-氧化。圖13顯示了該DVS相關化合物的m/z 280的產物質譜。從[M+H]+離子失去61Da得到m/z 219的產物離子。這相當于丟失二甲基羥胺，與N-氧化物相一致。因此，該代謝物被鑒定為DVS的N-氧化物。
實施例2單獨口服給藥后比格狗中[14C]O-脫甲基文拉法辛的代謝 如下所述，對雄性比格狗單獨口服管飼給藥后，在尿液、糞便和血漿中的[14C]DVS的代謝輪廓圖中檢測到(2或3)-羥基DV化合物、羥基DV葡糖苷酸、N-氧化物DV化合物以及其他化合物，和芐基羥基化合物。
材料和方法 放射標記的[14C]DVS(批次#CFQ13003，[環(huán)己基-1-14C]DVS)由阿瑪西亞生物科學(Amersham Biosciences)(Buckinghamshire，UK)提供。未標記的DVS(批次RB1636；游離堿65.2％)來自惠氏研究機構(Wyeth Research)，Rouses Point，NY。DVS的平均分子量為381.5，其中游離堿O-脫甲基文拉法辛，占重量的69.0％。采用放射檢測法經HPLC測定，[14C]DVS(原料藥)的比活性為144μCi/mg(對于游離堿為209μCi/mg)，游離堿的放射純度為99.3％。
用于制備口服給藥溶液的水從EM Science(Gibbstow，NJ)獲得。甲基纖維素和聚山梨酯80分別從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)和Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)得到。用來計算尿液和血漿樣品、糞便勻漿提取物和給藥溶液等分試樣中的放射性的液體閃爍液為UltimaGoldTM(Perkin Elmer，Wellesley，MA)。
將配備Oximate-80機器自動進樣器(Perkin Elmer)的307型Tri-Carb樣品氧化器用于血液和糞便樣品的氧化。Perma

E+液體閃爍液(Perkin Elmer)、

E(Perkin Elmer)二氧化碳吸收劑和HPLC級別的水用于捕獲樣品在氧化器中氧化所產生的放射性二氧化碳。糞便勻漿和血液樣品轉移至氧化-錐體中，并封上蓋子(Perkin Elmer)，以進行氧化。
動物 使用給藥時重量為14.4-16.2kg的雄性比格狗(n＝4)(來自內部群落)。為了方便報告，指定動物編號為5至8。劑量準備、動物給藥和樣品收集在惠氏研究機構(Wyeth Research)，Pearl River，NY進行。
劑量準備、給藥和分析 口服給藥溶液通過在270mL溶媒(0.25％聚山梨酯80、0.5％甲基纖維素的水溶液)中混懸19.0mg[14C]DVS和4168.3mg未標記的DVS來制備。用放射性檢測法經HPLC測定[14C]DVS(原料藥和給藥溶液)的放射化學純度、比活性和濃度。在給藥前、給藥中和給藥后取兩份給藥溶液的等分試樣，用于測定給藥溶液的比活性和放射性濃度。
每只動物的目標劑量為經口服管飼給藥30mg/kg(游離堿；10mg/mL，3mL/kg，30μCi/kg)[14C]DVS。選擇這個目標劑量是因為它是在先前藥代動力學研究中使用的劑量。另外，皮下給藥該劑量顯著增加雄性SpragueDawley大鼠腦中的去甲腎上腺素水平。
血液收集和分析 對在給藥后1、4、8和24小時(每個時間點N＝4)收集至肝素化試管中的全血(大約10mL)進行分析。將1mL血液轉移至新試管中用來測定放射性濃度。在4℃下在血液收集的兩小時內離心得到血漿。將血漿和全血在干冰上運送至惠氏研究機構生物轉化部門(Wyeth Research，Biotransformation Division)(Collegeville，PA)，進行分析。將全血的三份等分試樣(200μL)放置在氧化-錐體中，并風干。然后將這些樣品氧化，測定放射性含量。分析血漿樣品的三份等分試樣(100μL)的放射性含量。剩余的血漿在-70℃下保存直到代謝物分析。
對每只狗，分別地收集尿液和糞便，尿液在干冰上收集，糞便在室溫下收集。收集0-8和8-24小時的尿液，收集0-24小時的糞便。尿液和糞便樣品在干冰上運送到惠氏研究機構生物轉化部門(Collegeville，PA)，以進行分析。糞便樣品在大約5體積(v/w)的水中進行勻漿。將勻漿的大約0.2克等分試樣置于氧化-錐體中，稱重，并風干。然后將這些樣品氧化，并測定放射性含量。剩余的尿液樣品和糞便勻漿在-70℃下保存直到代謝物分析。
用

E(6mL)作為捕獲劑、Perma

E+(10mL)作為閃爍劑，在307型Tri-Carb樣品氧化器中氧化血液樣品和糞便勻漿。從每一樣品讀數中減除背景讀數(對照血液或糞便樣品的平均)。加入10mLUltima GoldTM閃爍液后直接分析尿液和血漿的等分試樣。
采用具有Ultima GoldTM或甲苯標準曲線的Tri-Carb型3100TR液體閃爍計數器(Packard BioScience，Boston，MA)來進行所有的放射性測定。通過使用已知放射性的外標物質將每分鐘計數(CPM)轉化為每分鐘衰變數(DPM)。通過外部放射性標準物質的轉換的譜指數(tSIE)來測定每種標準物質的淬滅。檢測的下限規(guī)定為2倍背景。
血漿代謝物樣品 用給藥后1和4小時收集的血漿樣品來分析代謝物輪廓圖。1mL血漿的等分試樣與等體積的乙腈混合，置于冰上至少10分鐘，然后在Eppendorf5415C型離心機中以14000rpm離心10分鐘。將上清液轉移至干凈的試管中。分析上清液的放射性。在Turbo Vap(Zymark，Hopinkton，MA)中、氮氣流下濃縮上清液，以除去乙腈。用HPLC來分析含水殘留物的一等分試樣，以描繪輪廓圖。還用LC/MS來分析所選擇的樣品，以鑒定放射性的峰。
測定狗血漿中[14C]DVS的穩(wěn)定性。將[14C]DVS(0.012mg/mL，終濃度)加入到對照狗血漿中，在設定為37℃的振搖水浴中孵育。在0、1、4、8和24小時時取出兩份等分試樣(1mL)。如上面所述提取樣品，并用HPLC分析法測定放射性純度。
尿液代謝物樣品 分析給藥后8-24小時收集的尿液樣品的代謝物輪廓圖。將尿液的等分試樣在Eppendorf 5415C型離心機中以14000rpm離心10分鐘。將上清液轉移至新試管中，分析放射性含量，并用HPLC分析代謝物輪廓圖。還用LC/MS分析所選擇的樣品，以鑒定放射性峰。
測定在狗尿液中的[14C]DVS的穩(wěn)定性。將[14C]DVS(0.025mg/mL，終濃度)加入至對照狗尿液中，在設置為37℃的振搖水浴中孵育。在0、1、4、8和24小時各取出等分試樣(1mL)。如上面所述提取樣品，并用HPLC分析法測定放射性純度。
糞便代謝物樣品 將給藥后直至24小時收集的糞便勻漿進行代謝物輪廓圖分析。將大約2克糞便的等分試樣轉移至新試管中，加入等體積的乙腈(v/w)，渦旋該試管。然后將樣品在Eppendorf 5415C型離心機中以14000rpm離心10分鐘。將上清液轉移至干凈的試管中。將殘留物用1ml乙腈再混懸，如上面所述離心。將所得上清液與原來的上清液合并，分析放射性。然后將上清液在Turbo Vap中、氮氣流下濃縮，以除去乙腈。用HPLC來分析含水殘留物的一等分試樣，描繪輪廓圖。還用LC/MS分析所選擇的樣品，以鑒定放射性峰。
樣品分析 用Waters Alliance 2690型HPLC系統(tǒng)(Waters Corp.，Milford，MA)來進行色譜分析。并用2487型可調式UV檢測器(設定225nm監(jiān)測)和具有250μL LQTR流動池的FloOneβ515型放射性流動檢測器(PerkinElmer)在線檢測。Ultima Flow M閃爍液的流速為3mL/min，使得閃爍液和流動相的混合比為3∶1。代謝物峰的分離是在Phenomenex Luna C18(2)柱，250×4.6mm，5μm(Phenomenex，Torrance，CA)上、采用兩種流動相A和B的線性梯度來實現(xiàn)的。流動相A為10mM的乙酸銨，pH 5.5，流動相B為乙腈。流速為1mL/min。流動相如表8所示那樣遞送。

LC/MS分析采用包括自動進樣器和二極管陣列UV檢測器的AgilentModel 1100 HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Wilmington，DE)。UV檢測器設定為監(jiān)測200-400nm。分離是通過5μm Phenomenex Luna C18(2)柱，150×2mm(Phenomenex)來實現(xiàn)的。柱溫為25℃。流動相和梯度程序如表2所列。對于所選擇的LC/MS分析，采用配備固體閃爍粒流動池的β-RAM3型放射性流動檢測器(IN/US Systems Inc.，Tampa，F(xiàn)L)獲得放射色譜圖。
用來代謝物鑒定的質譜儀為Micromass Q-TOF-2四極飛行時間混合質譜儀(Micromass，Inc.，Beverly，MA)和Finnigan LCQ Deca離子阱質譜儀(ThermoFinnigan，San Jose，CA)。質譜儀配備電噴霧離子化(ESI)接口，并在正離子化模式下操作。質譜儀的設置如表9和表10所列。


為了確證DVS的葡糖苷酸化的位置，用狗的肝微粒體進行孵育。這些孵育比較了DVS和文拉法辛的葡糖苷酸化。簡單來說，用狗的肝微粒體(1mg/mL)和MgCl2(10mM)在0.1M磷酸鈉/鉀緩沖液中孵育文拉法辛或DVS(100μM)。在設置為37℃的振搖水浴中預孵育2分鐘。加入UDPGA(終濃度為1mM)開始反應。另外一組文拉法辛的孵育通過UDPGA和NADPH生成系統(tǒng)來進行。總孵育體積為500μL，孵育時間為30min。通過加入500μL乙腈中止反應，如上面所述進行處理。用LC/MS分析樣品。
采用FloOne分析軟件(3.65版本，Packard BioScience)對放射峰進行積分。用計算機程序Microsoft

97來計算平均值和標準偏差。用MassLynx software(3.5版本)來分析LC/MS數據。
結果 經采用放射性檢測的HPLC來測定[14C]DVS(原料(bulk)化合物)的放射化學純度和比活性，其分別為99.3％和209μCi/mg(游離堿)。在給藥溶液中[14C]O-脫甲基文拉法辛的濃度、放射純度和比活性分別為10.3mg/mL、98.3％和1.03μCi/mg。給藥溶液的給藥前、給藥中和給藥后的等分試樣具有相似的濃度和純度(數據未給出)。[14C]DVS的平均給藥劑量為31.0±0.18mg/kg(游離堿)。
[14C]DVS在對照狗尿液和對照狗血漿中在37℃下穩(wěn)定可達24小時。在直到24小時并包括24小時的任何時間點用放射色譜法未檢測到明顯的降解產物。
通過一種已知放射性的標準物質14C-Spec-Chec(Perkin Elmer)的氧化來測定氧化效率，測定為99.1％。每個時間點的血液和血漿中的放射性濃度以及血液與血漿的分配如表11所示。在給藥后1、4、8和24小時，雄性狗中的總放射性的平均血漿濃度分別為13.3、16.9、7.43和0.81μg當量/mL。在每個時間點血液與血漿的放射性比率在0.51-0.64之間。
表11.對狗單獨口服給藥[14C]DVS(30mg/kg)后，全血和血漿的放射性濃度和放射性分配
血漿代謝物輪廓圖 血漿的放射性的平均提取效率為87.6±10.1％(數據未顯示)。給藥后1小時收集的狗血漿的代表性的放射色譜圖如圖14(A)所示。DV葡糖苷酸(M7)為檢測到的主峰。在給藥后1和4小時，血漿中檢測到的放射性的77.5和96.4％與M7峰相關。對于放射色譜分析而言，8和24小時樣品沒有足夠的放射性。在血漿中檢測到的僅有的其它放射性成分為未變化的DVS。
在狗的血漿中經LC/MS鑒定了九個其它的較少量的代謝物(表12)。這些代謝物包括六個在環(huán)己醇環(huán)上羥基化的代謝物(M1-M6，羥基DV化合物)、N，O-二脫甲基文拉法辛(M10)、N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(M13)和N-氧化物DV。

尿液代謝物輪廓圖 尿是排泄的主要途徑，在給藥后24小時內尿液樣品中回收的放射性劑量平均為75％。在尿液中檢測的放射性濃度如表13所示，其為經放射色譜分析后放射性的百分比分布。給藥后8-24小時收集的狗尿液的代表性的放射色譜圖如圖14(B)所示。在所有被分析的尿液樣品中檢測到的主要的放射性的峰為O-脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(M7，DV葡糖苷酸)，大約占尿液中檢測到的放射峰的85％。N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸(M13)大約占尿中檢測到的藥物-相關峰的4％。未變化的[14C]DVS占尿液中檢測到的放射性的4-8％。代謝物M11和M12(在環(huán)己烷環(huán)上羥基化的代謝物的葡糖苷酸軛合物，“羥基DV葡糖苷酸”)分別平均占尿中檢測到的放射性的2和4％。M11峰含有3個共-洗脫的代謝物(M11a、M11b和M11c)，每一個經LC/MS鑒定為在環(huán)己烷環(huán)上羥基化的代謝物的葡糖苷酸軛合物。
表13.對狗單獨口服給藥DVS(30mg/kg)后，8-24小時收集的尿液中的放射性的濃度和百分比分布
a值用經放射色譜法檢測到的總峰的百分比來表示，2次分析的平均值 b劑量的％的值包括0-8和8-24小時時間點，但0-8小時收集物含有小于0.1％的劑量。
尿液的LC/MS分析鑒定了10個其它較少量的代謝物。這些較少量的代謝物包括M1-M6、在芐基基團上羥基化的代謝物(M9)、N，O-二脫甲基文拉法辛(M10)、N，N，O-三脫甲基文拉法辛(M14)和N-氧化物DV(表12)。
糞便代謝物輪廓圖 在放射色譜分析前，0-24小時糞便樣品的放射性的提取效率為76.8±6.2％(數據未顯示)。放射色譜分析后，糞便中的回收率和放射性分布如表14所示。只有少量百分比的放射劑量(大約3％)在給藥24小時內在糞便中排出。給藥后0-24小時收集的經提取的狗糞便的代表性的放射色譜圖如圖14(C)所示。在每張色譜圖中，檢測到四個放射峰，而且未變化的DVS為主峰，平均占糞便中放射性的76％。量第二大的放射峰為M10，大約占糞便中排泄的放射性的12％。N-氧化物DV和N，N，O-三脫甲基文拉法辛(M14)也出現(xiàn)在糞便提取物的放射色譜圖中，分別占大約7％和5％。
表14.對狗單獨口服給藥[14C]DVS(30mg/kg)后，0-24小時收集的糞便中的放射性濃度和百分比分布

a7號狗在給藥后24小時無糞便樣品，所以收集延續(xù)到48小時。
b值用放射色譜法檢測到的總峰的百分比表示，2次分析的平均值。
在糞便提取物中，用LC/MS鑒定了8個其它的較少量的代謝物(用放射色譜法未檢測到的)。這些代謝物包括M1-M6、M7和M9(表12)。
通過液相色譜/質譜法的代謝物鑒定 質譜是通過LC/MS和LC/MS/MS對狗的血漿、尿液和糞便中的DVS和它的代謝物進行分析得到的。狗中的DVS代謝物的結構鑒定總結在表12中。LC/MS數據顯示DVS代謝為葡糖苷酸(M7)、N-脫甲基DVS(M10)、和單氧化產物。DVS和14種代謝物的質譜鑒定如下面所討論。
DVS 測定DVS標準物質的質譜特征，用來與代謝物作比較。在DVS的LC/MS中，在m/z 264處觀察到質子化的分子離子[M+H]+。圖7顯示了由碰撞誘導解離(CID)得到的DVS的m/z 264的產物質譜和提出的裂解圖。分子離子失去H2O得到m/z 246的產物離子。進一步失去二甲基氨基得到m/z 201的產物離子。從DVS失去環(huán)己醇基團被m/z 164的產物離子表示。m/z 58的產物離子歸屬為(CH3)2NCH2+。另外，m/z 107、133、145、159和173的產物離子分別對應于DVS分子的甲基、丙基、丁基、戊基和己基-苯酚部分。因此，這些離子可以用來檢測位于二甲基氨基、羥基芐基和環(huán)己醇基團的代謝位點。
代謝物M1、M2、M3、M4、M5和M6(羥基DV化合物)產生m/z 280的[M+H]+，其比DVS大16Da，表明羥基化或N-氧化。圖15顯示M6的m/z 280的產物譜圖。代謝物M1-M6的質譜數據是相似的。從分子離子失去H2O得到m/z 262的產物離子。代謝物的m/z 58、107和217的產物離子與DVS的m/z 58、107和201的產物離子相對照，表明環(huán)己烷環(huán)為代謝位點。因此，提出代謝物M1至M6為羥基DVS代謝物，且環(huán)己烷環(huán)為氧化位點。
代謝物M7(O-脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸，DV葡糖苷酸)。在m/z 440處觀察到該代謝物的[M+H]+，表明分子量為439。圖16顯示了M7的m/z440的產物譜圖。從分子離子失去176Da生成m/z 264的產物離子，這表明該代謝物為DVS的葡糖苷酸。質譜數據沒有表明結合的位點。用狗肝微粒體和DVS或文拉法辛進行的孵育測定葡糖苷酸化的位點。在只有UDPGA存在時，觀察到DVS的葡糖苷酸化，而未觀察到文拉法辛的。在UDPGA和NADPH同時存在時，只觀察到文拉法辛的葡糖苷酸化。從文拉法辛形成的葡糖苷酸具有與M7相同的[M+H]+和保留時間，這是O-脫甲基化然后酚羥基基團葡糖苷酸化的結果。DVS和文拉法辛之間僅有的結構區(qū)別在于在文拉法辛上DVS的酚羥基基團被甲基化。這表明DVS相關的化合物的葡糖苷酸化需要酚基團。因此，提出M7為DV的O-葡糖苷酸，且酚基團為結合位點。
代謝物M9 代謝物M9產生m/z 280的[M+H]+，其比DVS大16Da，表明羥基化或N-氧化。圖17顯示了M9的m/z的產物譜圖。m/z 123、149和161的產物離子分別比相應的DVS的m/z 107、133和145的產物離子大16Da，表明在芐基基團上羥基化。因此，M9為羥基DV，且芐基基團為氧化位點。
代謝物M10 在m/z 250處觀測到M10的[M+H]+。圖18顯示了M10的m/z 250的產物譜圖。從m/z 250的分子離子失去H2O，得到特征性的m/z 232的產物離子。隨后從m/z 232失去甲胺生成m/z 201的產物離子。這，和缺少m/z 58的產物離子，表明DV的二甲基氨基基團經N-脫甲基化已轉化為甲基氨基基團。另外，M10的m/z 250的產物質譜圖與合成的N，O-二脫甲基文拉法辛的m/z 250的產物質譜圖相符合。因此，M10被鑒定為N，O-二脫甲基文拉法辛。
代謝物M11a、M11b、M11c和M12(羥基DV葡糖苷酸) 在m/z 456處觀察到M11a、M11b、M11c和M12的[M+H]+，表明分子量為455。圖19顯示了M12的m/z 456的產物圖譜。M11a、M11b、M11c和M12的質譜數據是相似的。從分子離子失去176Da得到m/z 280的離子，其為羥基DV代謝物的[M+H]+。質譜數據沒有表明結合的位點。基于對代謝物M7所討論的使用DVS和文拉法辛的體外葡糖苷酸化實驗的結果，提出酚基團為結合位點。代謝物的m/z 58、107和217的產物離子與DVS的m/z 58、107和201的產物離子相比較，表明在環(huán)己烷環(huán)上羥基化。因此，提出M11a、M11b、M11c和M12為羥基DV代謝物的O-葡糖苷酸。
代謝物M13(N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸)。在m/z 426處觀測到該代謝物的[M+H]+，表明分子量為425。圖20顯示了M13的產物離子譜圖。從m/z 426失去176Da得到m/z 250的離子。從環(huán)己醇部分失去H2O得到m/z 408的基峰。從m/z 408的離子失去176Da得到M10的特征性的m/z 232的產物離子。隨后從m/z 232失去甲胺生成m/z 201的產物離子。因此，提出M13為N，O-二脫甲基文拉法辛O-葡糖苷酸，且苯酚基團為葡糖苷酸化位點。
代謝物M14產生m/z 236的[M+H]+。圖21顯示了M14的m/z 236的產物譜圖。從分子離子失去H2O和NH3得到m/z 201的產物離子。這和m/z 58的產物離子的缺失一起表明N-二脫甲基化。也觀察到DVS的m/z107、133、145、159和173的產物離子。M14的m/z 236的產物質譜圖與合成的N，N，O-三脫甲基文拉法辛的質譜圖相匹配，如圖22所示。因此，M14被鑒定為N，N，O-三脫甲基文拉法辛。
N-氧化物DV 在m/z 280處觀測到該DVS相關成分的[M+H]+，表明羥基化或N-氧化。圖23顯示了該DVS相關化合物的m/z 280的產物質譜圖。從[M+H]+離子失去61Da得到m/z 219的產物離子。這相應于與N-氧化物相一致的二甲基羥基胺的丟失。因此，該代謝物被鑒定為N-氧化物DV。
實施例3 2-羥基-DV化合物的合成 本發(fā)明的2-羥基-DV化合物可以采用下面方法制備。將4-(二甲基氨基甲?；谆?苯酚的二甲基甲酰胺(DMF)溶液用K2CO3處理，接著用芐基溴處理。將混合物在室溫下攪拌，接著在60℃下加熱1小時。濃縮混合物，除去DMF，用EtOAc稀釋，用水洗滌。加入干燥的MgSO4，過濾混合物，濃縮至少量。加入己烷，析出縮酮中間體產物。經過濾收集固體，并干燥。
用酸(如HCl)處理2-芐氧基-環(huán)己酮的100ml THF/50ml MeOH溶液，然后在室溫下攪拌。用飽和K2CO3淬滅反應，用EtOAc萃取，濃縮成油狀。使產物從熱的EtOAc/己烷中結晶，得到如圖2所示的酮中間體。
在-78℃下，將所述酮的THF溶液加入至氫化鋁鋰(LAH)粒的THF混懸液中。將混合物升溫至室溫，攪拌至少3小時。先用MeOH再用10％NaOH淬滅反應，攪拌至少3小時。經過濾移去固體，接著洗滌(例如用THF)，濃縮，得到固體。將所得固體從EtOAc/己烷中重結晶，得到相應的芐基醚。
兩個芐基保護基團可以如下除去與Pd/C一起在100mL乙醇中攪拌并加壓氫化過夜。通過過濾接著用乙醇洗滌純化固體。濃縮固體，從EtOAc/己烷中結晶得到終產物。
實施例4 2-羥基DV葡糖苷酸化合物的合成 2-羥基DV葡糖苷酸化合物可以如下合成。在5min內向2-羥基DV(1.0g，3.6mmol)和2.05g(4.3mmol)三氯亞胺酯的二氯甲烷(15ml)溶液中滴加加入BF3OET2(0.54mL，4.4mmol)。在氮氣氣氛下將反應物攪拌過夜。然后將反應混合物倒入到NaHCO3溶液(飽和)中，用二氯甲烷萃取。分出有機層，干燥并真空濃縮。使粗殘留物通過短硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇洗脫。濃縮濾液得到保護的2-羥基DVO-葡糖苷酸(見圖3)。
將保護的2-羥基DV葡糖苷酸(三乙?；柞?(1.0g，1.7mmol)用二噁烷-MeOH-H2O(2∶1∶1)的混合物8ml溶解，加入LiOH(0.4g，17mmol)，將所得的溶液加熱至60℃，加熱1小時。然后冷卻反應混合物，用乙酸稀釋。在真空中濃縮混合物，可以用二氯甲烷-甲醇在硅膠上純化殘留物，得到2-羥基DV葡糖苷酸。
實施例5.N-氧化物的合成 N-氧化物通過下面的化學合成策略來制備。為了制備圖4所示的N-氧化物DVI將ODV(1.0g，3.8mmol)置于氯仿(45mL)中，冷卻至0℃。然后向反應混合物中滴加加入MCPBA(0.786g，4.56mmol)的氯仿(15mL)溶液。將反應物在氮氣氣氛下攪拌過夜。在這段時間內允許溫度升至室溫。然后將反應混合物倒在用氯仿預填裝的堿性氧化鋁柱上(40g)。反應混合物被吸附在氧化鋁柱上，然后使氯仿(150mL)通過柱子(無壓力)。接著使甲醇∶氯仿(1∶3)混合物通過柱子，洗脫出預期產物。濃縮含產物的流分，將所得的固體溶解在氯仿中，并通過硅藻土襯墊。濃縮濾液得到預期的N-氧化物(1.26g，＞100％)，為白色固體。Mp.171-173℃。1H NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)0.68-1.64(m，10H)，2.95(s，3H)，3.14(s，3H)，3.19(d，J＝5.7Hz，1H)，3.54(d，J＝12.7Hz，1H)，3.89(dd，J＝7.5Hz和7.3Hz，1H)，6.67(d，J＝8.4Hz，2H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，9.51(s，1H)；(M+H)+280；(M-H)-278；元素分析，C16H25NO3計算值C，68.79；H，9.02；N，5.01；實測值C，57.64；H，7.36；N，3.73；分析HPLC(5-95％乙腈/水)；在210nM下98.4％；在230nM下99.3％。
圖4所示的N-氧化物DV II [(S)-4-[2-二甲基氨基-1-(1-羥基-環(huán)己基)-乙基]-苯酚的N-氧化物]如化合物I那樣制備。化合物為白色固體(1.03g，97.3％)。Mp.175-176℃。1H NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)0.68-1.64(m，10H)，2.95(s，3H)，3.14(s，3H)，3.19(d，J＝5.7Hz，1H)，3.54(d，J＝12.7Hz，1H)，3.89(dd，J＝7.5Hz和7.3Hz，1H)，6.67(d，J＝8.4Hz，2H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，9.51(s，1H)；(M+H)+280；(M-H)-278；元素分析，C16H25NO3計算值C，68.79；H，9.02；N，5.01；實測值C，60.62；H，7.84；N，4.02；分析HPLC(5-95％乙腈/水)；在210nM下98.0％，在230nM下99.0％；旋光，-15.49(經氯仿雜質校正)。
(R)-4-[2-二甲基氨基-1-(1-羥基-環(huán)己基)-乙基]-苯酚的N-氧化物(III)如化合物I和II那樣制備(見圖4)。該N-氧化物DV為白色粉末(0.88g，82.9％)。Mp.181-182℃；1H NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)0.68-1.64(m，10H)，2.95(s，3H)，3.14(s，3H)，3.19(d，J＝5.7Hz，1H)，3.54(d，J＝12.7Hz，1H)，3.89(dd，J＝7.5Hz和7.3Hz，1H)，6.67(d，J＝8.4Hz，2H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，9.51(s，1H)；(M+H)+280；(M-H)-278；元素分析，C16H25NO3計算值C，68.79；H，9.02；N，5.01；實測值C，67.10；H，8.92；N，4.77；旋光，+19.07(經氯仿雜質校正)。
實施例6測定活性的受體結合研究 本發(fā)明化合物的生物活性可通過受體分析結合研究來測定。這些研究已描述在下列出版物中，也可獲取自Novascreen，Hanover，Maryland?？梢允褂玫氖荏w結合實驗包括但不限于腎上腺素能α-2A(人)結合實驗(D.B.Bylund等人，J Pharmacol & Exp Ther，245(2)600-607(1988)；JA Totaro等人，生命科學(Life Sciences)，44459-467(1989))；多巴胺轉運蛋白結合實驗(Madras等人，分子藥理(Mol.Pharmacol.)，36518-524；JJ Javitch等人，分子藥理，2635-44(1984))；組胺H1結合實驗(Chang等人，神經化學雜志(J Neurochem)，321658-1663(1979)；JI Martinez-Mir等人，BrainRes，526322-327(1990)；EEJ Haaksma等人，Pharmacol Ther，4773-104(1990))；咪唑啉結合實驗(CM Brown等人，英國藥理學雜志(Brit.JPharmacol)，99(4)803-809(1990))；毒蕈堿M5(人類重組體)結合實驗(NJBuckley等人，分子藥理，35469-476(1989))；去甲腎上腺素轉運蛋白(人類重組體)結合實驗(R.Raisman等人，歐洲藥理學雜志(Eur J Pharmacol)，78345-351(1982)；S.Z.Raisman等人，歐洲藥理學雜志，72423(1981))；5-羥色胺轉運蛋白(人)結合實驗(RJ D′Amato等人，J Pharmacol & ExpTher，242364-371(1987)；NL Brown等人，歐洲藥理學雜志，123161-165(1986))。細胞/功能實驗包括去甲腎上腺素轉運(NET-T)人類(A.Galli等人，J Exp Biol，1982197-2212(1995))；和5-羥色胺轉運(人)實驗(D′Amato等人，上面引用的和NL Brown等人，歐洲藥理學雜志，123161-165(1986))。結果可以用受體的％抑制表示。
實施例7在微透析模型中本發(fā)明化合物的體內效力 本發(fā)明化合物可以通過微透析研究(例如在雄性Sprague-Dawley大鼠中)來評價。MT Taber等人，“同時給藥氟西汀和WAY-100635對體內5-羥色胺能神經傳遞的差別效應對注射順序敏感，(Differential effects ofcoadministration of fluoxetine and WAY-100635 on serotonergicneurotransmission in vivosensitivity to sequence of injections，)”突觸(Synapse)，38(1)17-26(2000年10月)。這種技術能捕獲自由運動嚙齒類動物的腦內化合物的神經化學作用?？梢栽诖笫蟊硞阮~皮質(被認為與抑郁的病因學和/或治療有關的腦部區(qū)域)來研究這種作用。為了看看能否觀察到任何對5-羥色胺的作用，可以將本發(fā)明化合物(劑量30mg/kg，皮下給藥)與選擇性5-HT1A拮抗劑N-[2-[4-(2-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]乙基]-N-(2-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺組合進行測試。這樣做的原理是為了阻斷調節(jié)5-HT釋放的胞體樹突(somatodendritic)5-HT1A自身受體。排除了單獨用化合物對5-HT1A受體脫敏進行慢性(14天)神經化學研究的需要。適當的研究條件列在下面 動物雄性Sprague-Dawley大鼠(280-350g) 腦區(qū)域背側(DL)額皮質(A/P+3.2mm，M/L±3.5mm，D/V-1.5mm) 給藥術后恢復24小時 插入探針后平衡3小時 基線1小時40分鐘 在給藥1-[2-二甲基氨基-1-(4-苯酚)乙基]-順式-1，4-環(huán)己二醇(30mg/kg，口服)之前20分鐘給藥5-HT1A拮抗劑N-[2-[4-(2-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]乙基]-N-(2-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺(0.3mg/kg，皮下給藥) 樣品收集注射后收集樣品3小時2分鐘 分析用HPLC-ECD定量5-HT水平 在這些條件下，可以觀察到體內神經化學效應。可以觀察到其他的SNRIs和SSRIs(如文拉法辛和氟西汀)與5-HT1A拮抗作用的組合的體內神經化學效應，用于對比。
根據在說明書中引用的文獻的指導，能夠最通徹地理解本說明書。說明書中的實施方案提供本發(fā)明的實施方案的例證，而不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。技術人員很容易認識到許多其他的實施方案也包括在本發(fā)明中。將在本公開中引用的所有的出版物和專利以其全文引入作為參考。在一定程度上參考文獻引入的物質與本說明矛盾或不一致，本說明書將替代任何這樣的物質。文中任何參考文獻的引用并不是承認這些文獻為本發(fā)明的現(xiàn)有技術。
除非另外說明，在本說明書包括權利要求書中使用的表示成分的量、反應條件等的所有數字，將理解為在所有的情況下被術語“大約”修飾。因此，除非另外相反地說明，數字參數為近似值，并可以根據本發(fā)明想得到的所需性質而改變。至少，不是試圖用于限制權利要求書范圍的等價體的內容的申請，應當根據有效位數和常規(guī)的舍入方法來理解每個數字參數。
除非另外說明，一系列元素之前的術語“至少”應理解為涉及該系列中的每一個元素。本領域技術人員在至多采用常規(guī)實驗的情況下將認識到或能夠確定文中所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等價體。這些等價體將包括在下面權利要求書中。
實施例8.去甲文拉法辛的其他代謝物 本發(fā)明的其他實施方案包括下列的去甲文拉法辛代謝物



權利要求
1.分離得到的下式的DV代謝物或衍生物和其藥學上可接受的鹽，
其中，羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的一個2-位或3-位碳上。
2.權利要求1的分離得到的DV代謝物或衍生物，其中羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的2-位碳上。
3.權利要求1的分離得到的DV代謝物或衍生物，其中羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的3-位碳上。
4.分離得到的下式的DV代謝物或衍生物和其藥學上可接受的鹽，
其中羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的一個2-位、3-位或4-位碳上。
5.權利要求4的分離得到的DV代謝物，其中羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的2-位碳上。
6.權利要求4的分離得到的DV代謝物，其中羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的3-位碳上。
7.權利要求4的分離得到的DV代謝物，其中羥基基團連接在環(huán)己基環(huán)上的4-位碳上。
8.分離得到的下式的DV代謝物或衍生物和其藥學上可接受的鹽
9.分離得到的下式的DV代謝物或衍生物和其藥學上可接受的鹽，
其中，羥基基團連接在芐基上的一個2-位或3-位碳上。
10.權利要求9的分離得到的DV代謝物，其中羥基基團連接在芐基上的2-位碳上。
11.權利要求9的分離得到的DV代謝物，其中羥基基團連接在芐基上的3-位碳上。
12.藥物組合物，該藥物組合物包含權利要求1、權利要求4、權利要求8或權利要求9的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。
13.權利要求12的藥物組合物，其還包含文拉法辛、O-脫甲基文拉法辛和O-脫甲基文拉法辛琥珀酸鹽或它們的藥學上可接受的鹽中的一種或多種。
14.治療至少一種哺乳動物中的中樞神經系統(tǒng)障礙的方法，該方法包括對需要這種治療的哺乳動物提供有效量的權利要求1、權利要求4、權利要求8或權利要求9的化合物。
15.權利要求14的方法，其中化合物被口服給藥。
16.分離得到的DV代謝物或衍生物，其選自
R1＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R3＝H，glu，SO3H
R3＝H(但當R2和R3＝H時則個是H)，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R3＝H，glu，SO3H
R3＝H，glu，SO3H
R4＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R3＝H，C(O)CH3，OH
R3＝H，C(O)CH3，OH
R4＝H，CH3
R4＝H，CH3
R5＝H，glu，SO3H
但不包括在同一結構上R1，R2，R3＝H
R1＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R3＝H，C(O)CH3，OH
R3＝H，C(O)CH3，OH
R4＝H，CH3
R4＝H，CH3
R5＝H，glu，SO3H
R5＝H，glu，SO3H
R6＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R3＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R4＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R1＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R2＝H，glu，SO3H
R3＝H，glu，SO3H
R3＝H，glu，SO3H。
全文摘要
本發(fā)明提供了被鑒定為脫甲基文拉法辛的代謝物或衍生物的新的分離得到的化合物，包括羥基-DV代謝物、羥基-DV-葡糖苷酸代謝物、N-氧化物-DV代謝物和芐基-羥基-DV代謝物。本發(fā)明包括藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明的任何代謝物或衍生物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還包括治療至少一種哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)障礙的方法，該方法包括對需要這種治療的哺乳動物提供有效量的本發(fā)明的化合物。
文檔編號C07C215/64GK101528667SQ200780039447
公開日2009年9月9日 申請日期2007年10月24日 優(yōu)先權日2006年10月25日
發(fā)明者M·J·霍夫曼, W·德邁歐, J·王, J·W·烏爾里希 申請人:惠氏公司