針對(duì)腎相關(guān)抗原1的抗體及其抗原結(jié)合片段的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明披露了新穎的抗體和抗原結(jié)合片段，這些抗體和抗原結(jié)合片段特異性地結(jié)合至KAAG1上并且可以在包含表達(dá)KAAG1的細(xì)胞的癌癥的治療、檢測(cè)和診斷中使用。在此還披露了表達(dá)這些抗體和抗原結(jié)合片段的細(xì)胞連同使用這些抗體和片段檢測(cè)和治療癌癥的方法?？梢詮倪@樣的治療或檢測(cè)受益的癌癥適應(yīng)癥包括卵巢癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、腦癌、和前列腺癌、以及黑色素瘤。
【專利說明】針對(duì)腎相關(guān)抗原1的抗體及其抗原結(jié)合片段
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合至腎相關(guān)抗原I (KAAGl)上的特異性抗體或抗原結(jié)合片段以及它們用于癌癥的治療、檢測(cè)和診斷的用途。特別考慮了將治療劑與這些抗體或抗原結(jié)合片段一起遞送至細(xì)胞。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在美國，在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌占據(jù)女性中的最高腫瘤相關(guān)死亡率(杰瑪(Jemal)等人，2005)。在美國，它是女性中癌相關(guān)死亡的第四大原因(梅農(nóng)(Menon)等人，
2005)。美國癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)在2005年總計(jì)22，220個(gè)新病例并且將16，210例死亡歸因于該疾病(博納姆(Bonome)等人，2005)。對(duì)于過去30年，統(tǒng)計(jì)數(shù)字大體上保持相同-產(chǎn)生卵巢癌的大多數(shù)女性將死于這種疾病(錢伯斯(Chambers)和范德爾海登(Vanderhyden),
2006)。該疾病帶來1:70的壽命風(fēng)險(xiǎn)以及> 60%的死亡率(錢伯斯(Chambers)和范德爾海登(Vanderhyden)，2006)。高死亡率是由于當(dāng)惡性腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散在卵巢以外時(shí)卵巢癌的早期檢測(cè)的困難。實(shí)際上，>80%的患者被診斷為患有晚期疾病(III期或IV期)(博納姆(Bonome)等人，2005)。這些患者有不良的預(yù)后，這反映為< 45%的5年存活率，雖然80%至90%將最初對(duì)化療有反應(yīng)(貝雷克(Berek)等人，2000)。與較早時(shí)20%的5年存活率相比，這個(gè)增加的成就至少部分地是由于當(dāng)腫瘤組織局限于卵巢時(shí)最佳地減小腫瘤組織的體積的能力，這是針對(duì)卵巢癌的重要的預(yù)后因素(布里斯托(Bristow R.E.)，2000;布朗(Brown)等人，2004)。在被診斷患有早期疾病(I期)的患者中，5年存活率范圍為> 90 (錢伯斯(Chambers)和范德爾海登(Vanderhyden), 2006)。
[0004]卵巢癌包括從卵巢的表面 上皮或從表面包涵體(surface inclusion)衍生的腫瘤的多相群。它們分為漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣性、透明細(xì)胞、以及布倫納(過渡)類型，對(duì)應(yīng)于女性生殖道器官中的不同類型的上皮(史(Shih)和庫爾曼(Kurman)，2005)。在這些類型中，漿液性腫瘤占診斷的卵巢癌病例的大約60 %。每個(gè)組織學(xué)亞類進(jìn)一步分為三組:良性的、中間的(交界性腫瘤或低惡性傾向(LMP))、和惡性的，反映它們的臨床行為((塞德曼)Seidman等人，2002)。LMP表示10%至15%的被診斷為漿液性的腫瘤，并且是一個(gè)難題，因?yàn)樗鼈冋宫F(xiàn)非典型的核結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)移行為，然而它們與高級(jí)別(high-grade)漿液性腫瘤相比具有相當(dāng)?shù)偷那忠u性。在相同的時(shí)期內(nèi)，與晚期高級(jí)別疾病< 45%的存活率不同，對(duì)于患有LMP腫瘤的患者的5年存活率是95% (貝雷克(Berek)等人，2000)。
[0005]目前，卵巢癌的診斷是部分地通過患者病史的常規(guī)分析、以及通過進(jìn)行體格檢查、超聲檢查和X射線檢查、以及血液學(xué)篩查而完成的。已經(jīng)報(bào)道用于血清生物標(biāo)記的早期血液學(xué)檢測(cè)的兩種替代策略。一種方法是通過質(zhì)譜法分析血清樣品以便發(fā)現(xiàn)未知身份的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，從而檢測(cè)癌癥的存在或不存在(莫爾(Mor)等人，2005 ;科扎克(Kozak)等人，2003)。然而，這個(gè)策略是昂貴的并且不是廣泛可用的?？商娲?，是使用抗體微陣列、ELISA、或其他相似的方法檢測(cè)在血清中的已知蛋白質(zhì)/肽的存在或不存在。對(duì)于稱為CA-125(癌抗原-125)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記的血清檢測(cè)長期以來已被廣泛地作為針對(duì)卵巢癌的標(biāo)記而執(zhí)行。然而，雖然卵巢癌細(xì)胞可以產(chǎn)生過量的這些蛋白質(zhì)分子，仍有一些其他癌癥(包括輸卵管癌或子宮內(nèi)膜癌(cancer of the lining of the uterus))、患有胰腺癌的人的60%、以及患有其他惡性腫瘤的人的20% -25%具有升高水平的CA-125。CA-125測(cè)試僅僅獲得對(duì)于大約50%的I期卵巢癌患者的真實(shí)陽性結(jié)果，而具有獲得來自I1、II1、和IV期卵巢癌患者的真實(shí)陽性結(jié)果的80%的可能性。其他20%的卵巢癌患者未顯示CA-125濃度的任何增加。另外，升高的CA-125測(cè)試可以指示與癌癥不相關(guān)的其他良性活動(dòng)，例如月經(jīng)、懷孕、或子宮內(nèi)膜異位。因此，當(dāng)早期疾病仍然是可治療的、展現(xiàn)< 10%的陽性預(yù)測(cè)值(PPV)時(shí)，這種測(cè)試對(duì)于該早期疾病的檢測(cè)具有非常有限的臨床應(yīng)用。甚至在添加針對(duì)CA-125的超聲篩查的情況下，PPV僅僅提高至大約20% (科扎克(Kozak)等人，2003)。因此，這個(gè)測(cè)試不是有效的篩查測(cè)試。
[0006] 盡管疾病的病因?qū)W知識(shí)、侵襲性細(xì)胞減滅術(shù)、以及現(xiàn)代聯(lián)合化療的改進(jìn)，但在死亡率上僅有很小的變化。不好的結(jié)果已經(jīng)歸因于(I)缺乏適當(dāng)?shù)挠糜谠缙诩膊z測(cè)的與在這個(gè)階段的癥狀的微弱表現(xiàn)相結(jié)合的篩查測(cè)試-診斷經(jīng)常只是在進(jìn)展到后期之后才作出的，在此時(shí)癌癥的腹膜播散限制了有效治療，以及(2)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療策略的抵抗的頻繁產(chǎn)生，限制了患者的5年存活率的改進(jìn)。用于卵巢癌的初始化療方案包括卡鉬(Paraplatin)和紫杉醇(taxol)的結(jié)合。多年的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明這種結(jié)合在有效手術(shù)之后是最有效的-減小了患有新診斷的卵巢癌的大約80%女性中的腫瘤體積，并且40%至50%將具有完全消退-但研究繼續(xù)尋求改進(jìn)患者反應(yīng)的方法。最近的靶向難以到達(dá)的細(xì)胞的化療劑的腹腔輸注與靜脈內(nèi)遞送結(jié)合已經(jīng)增加了有效性。然而，嚴(yán)重的副作用常常導(dǎo)致不完全的療程。一些其他的化療劑包括多柔比星、順鉬、環(huán)磷酰胺、博來霉素、依托泊苷、長春堿、鹽酸拓?fù)涮婵?、異環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶以及美法侖。更為最近地，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明:與全身靜脈化療相比較，順鉬的腹膜內(nèi)給藥賦予了存活優(yōu)勢(shì)(卡尼斯特拉(Cannistra)和麥圭爾(McGuire),2007)。對(duì)于患有早期疾病接受化療的女性而言，優(yōu)異的存活率為開發(fā)改進(jìn)卵巢癌檢測(cè)的策略的研究工作提供了強(qiáng)的原理。此外，新的卵巢癌相關(guān)生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)將導(dǎo)致用于卵巢癌的未來治療的、具有最小副作用而更有效的治療策略的開發(fā)。
[0007]盡管這些在對(duì)于卵巢癌的理解和治療方面的最近進(jìn)展，化療的使用常常與嚴(yán)重的不良反應(yīng)相關(guān)，這些不良反應(yīng)限制了它們的使用。因此，對(duì)于更具特異性的策略(例如，抗原組織特異性與單克隆抗體的選擇性相結(jié)合)的需要將允許脫靶相關(guān)的副作用的顯著減少。隨著漸增數(shù)目的進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，用于卵巢癌治療的單克隆抗體的使用正開始出現(xiàn)(Oei等人,2008 ;尼哥底母(Nicodemus)和貝雷克(berek), 2005)。這些試驗(yàn)中的大多數(shù)已經(jīng)檢驗(yàn)了與放射性同位素(例如釔-90)結(jié)合的單克隆抗體、或者靶向已經(jīng)在其他癌類型中鑒定的腫瘤抗原的抗體的用途。對(duì)此的一個(gè)實(shí)例是貝伐單抗的使用，它靶向血管內(nèi)皮生長因子(伯格(Burger)，2007)。存在非常少的、當(dāng)前作為用于單克隆抗體的治療靶標(biāo)而被研究的卵巢癌特異性抗原。一些實(shí)例包括稱為B7-H4的蛋白質(zhì)(西蒙(Simon)等人，2006)以及更近地葉酸受體-a (埃貝爾(Ebel)等人’2007)的使用，后者近來已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)。
[0008]腎相關(guān)抗原I (KAAGl)是最初從衍生自組織相容性白細(xì)胞抗原-B7腎癌細(xì)胞系的cDNA文庫克隆的，作為呈遞至細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的抗原肽(Van den Eynde等人，1999 ；Genbank登錄號(hào)Q9UBP8，SEQ ID N0.:28 ;29)。發(fā)現(xiàn)含有KAAGl的基因座編碼轉(zhuǎn)錄在相對(duì)的DNA鏈上的兩種基因。發(fā)現(xiàn)有義鏈編碼一種轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物編碼稱為DCDC2的蛋白質(zhì)。由這些作者進(jìn)行的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，KAAGl反義轉(zhuǎn)錄物是腫瘤特異性的并且在正常組織中展現(xiàn)非常少的表達(dá)，而D⑶C2有義轉(zhuǎn)錄物被廣泛表達(dá)(Van den Eynde等人，1999)。在公開的專利申請(qǐng)?zhí)朠CT / CA2007 / 001134(其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)中披露了在癌癥中并且特別是在卵巢癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌以及黑色素瘤中的KAAGl轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。Van den Eynde等人還觀察到在腎癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、腦腫瘤、甲狀腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、以及頭頸腫瘤中的RNA表達(dá)。近來，通過連鎖不平衡研究獲得的強(qiáng)的遺傳證據(jù)發(fā)現(xiàn)VMP / DCDC2 / KAAGl基因座與誦讀困難相關(guān)(舒馬赫(Schumacher)等人,2006 ;科普(Cope)等人,2005)。這些報(bào)道之一指向作為誦讀困難患者中的罪魁禍?zhǔn)?culprit)的DCDC2標(biāo)記，因?yàn)樵谄べ|(zhì)神經(jīng)元遷移中這種蛋白質(zhì)的功能與常常展現(xiàn)異常的神經(jīng)元遷移和成熟的這些患者的癥狀一致(舒馬赫(Schumacher)等人，
2006)。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明涉及特異性抗-KAAGl抗體和抗原結(jié)合片段以及它們用于包含表達(dá)KAAGl或KAAGl變體的腫瘤細(xì)胞的癌癥的治療、檢測(cè)和診斷的用途。這樣的癌癥的示例性實(shí)施例包括例如卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。
[0011]抗體或抗原結(jié)合片段在靶向在腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)的KAAGl或KAAGl變體方面可以是特別有效的。
[0012]事實(shí)上，與例如在PCT / CA2009 / 001586 (其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)中披露的3D3和3G10抗體相比較，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段顯現(xiàn)出具有改進(jìn)的與表達(dá)KAAGl的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的能力。這些抗體和抗原結(jié)合片段還被內(nèi)化并且可以因此在將治療劑遞送至腫瘤細(xì)胞中是有用的。我們的結(jié)果表明，具有所希望特征(例如，改進(jìn)的結(jié)合和內(nèi)化)的抗體和抗原結(jié)合片段通常結(jié)合至KAAGl上的由氨基酸61至84界定的C端區(qū)域。然而，雖然3A4和3G10抗體兩者都結(jié)合至相同的區(qū)域上，3A4抗體顯現(xiàn)出比3G10抗體更有效地結(jié)合至腫瘤細(xì)胞的表面上。具體而言，在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)(一種測(cè)量抗體與細(xì)胞表面的直接結(jié)合的方法)中，表達(dá)KAAGl抗原的癌細(xì)胞需要比3G10大致少10倍的3A4。另外，在使用表面等離子體共振的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)3A4對(duì)KAAGl的親和力是在10皮摩爾以下，而抗體3D3和3G10展現(xiàn)出大于200納摩爾的親和力(低20倍的親和力)。因此，預(yù)期3A4在結(jié)合能力方面的這些增加轉(zhuǎn)化為改進(jìn)的治療活性。
[0013]本發(fā)明在其一方面提供了一種分離的或基本上純化的抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段可以能夠特異性地結(jié)合至一個(gè)序列，該序列與位于KAAGl (SEQ ID N0.:29)的氨基酸61至84之間的至少10個(gè)(例如10至20個(gè)或更多個(gè))連續(xù)氨基酸是一致的。
[0014]本發(fā)明還提供了能夠與在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭的分離的抗體或抗原結(jié)合片段。
[0015]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有在此所述的氨基酸序列的特異性抗體或抗原結(jié)合片段。這樣的抗體或抗原結(jié)合片段可以處于單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體(分離的)的形式，連同具有在此所述的特征的抗原結(jié)合片段。與此一道還包括這樣的抗體或抗原結(jié)合片段:這些抗體或抗原結(jié)合片段包括在單克隆、嵌合、人源化或人抗體之間的輕鏈和/或重鏈的排列。
[0016]本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以因此包含人抗體的人恒定區(qū)和/或框架氨基酸。
[0017]術(shù)語“抗體”是指完整抗體、單克隆抗體或多克隆抗體。術(shù)語“抗體”還包括多特異性抗體，例如雙特異性抗體。人抗體通常是由各自包含可變區(qū)和恒定區(qū)的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。輕鏈可變區(qū)包含3個(gè)⑶R，在此鑒定為側(cè)翼是框架區(qū)的⑶RLl或L1XDRL2或L2以及⑶RL3或L3。重鏈可變區(qū)包含3個(gè)⑶R，在此鑒定為側(cè)翼是框架區(qū)的⑶RHl或H1、⑶RH2或H2以及⑶RH3或H3。已經(jīng)使用卡巴特(Kabat)和肖蒂亞(Chotia)定義鑒定了本發(fā)明的人源化抗體的CDR(例如在SEQ ID N0.:56中列出的CDRH2)。然而，其他人(阿比南旦(Abhinandan)和馬丁(Martin), 2008)已經(jīng)使用了寬松地基于Kabat和Chotia的改良的方法，得到較短的CDR(例如，在SEQ ID N0.:6中列出的⑶RH2)的描述。
[0018]如在此使用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指保留與抗原(例如，KAAGl、KAAGl的分泌形式或其變體)結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由完整抗體的片段執(zhí)行。包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”之內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由'、VH、(^和Chi結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，由Vh和Cm結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體的單臂的'和Vh結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(華德(Ward)等人，(1989)《自然》(Nature) 341:544-546)，由Vh結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如，Vh CDR3)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域'和Vh由獨(dú)立的基因編碼，可以使用重組方法通過使它們能夠被制造為單一多肽鏈的合成接頭而將它們結(jié)合，該單一多肽鏈中的\和Vh區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(ScFv));參見例如伯德(Bird)等人(1988)《自然》(Science) 242:423-426 ;以及赫斯頓(Huston)等人(1988)《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體還旨在被包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”之內(nèi)。此外，抗原結(jié)合`片段包括結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白，這些結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白包含⑴與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合域多肽(例如重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、或經(jīng)由接頭肽而與輕鏈可變區(qū)融合的重鏈可變區(qū))，(ii)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。鉸鏈區(qū)可以通過將一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基用絲氨酸殘基替換而被修飾，從而防止二聚化。這樣的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白進(jìn)一步披露于US2003 / 0118592和US2003 / 0133939中。這些抗體片段是使用對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言已知的常規(guī)技術(shù)而獲得的，并且按照與完整抗體相同的方式對(duì)這些片段的效用進(jìn)行了篩選。
[0019]術(shù)語“人源化抗體”包括全人源化抗體(即，框架是100%人源化的)以及部分人源化抗體(例如，至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域含有來自人抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，同時(shí)其他氨基酸是非人親本抗體的氨基酸)。典型地，“人源化抗體”含有非人親本抗體(例如，小鼠、大鼠、兔子、非人靈長類，等等)的CDR、以及與天然人抗體或人抗體共有序列的那些一致的框架。在這種情況下，那些“人源化抗體”表征為全人源化。“人源化抗體”還可以含有一種或多種氨基酸置換，這些置換不對(duì)應(yīng)于人抗體或人抗體共有序列的那些。這樣的置換包括例如可以保留抗體特征(例如，親和力、特異性，等等)的回復(fù)突變(例如，非人氨基酸的再引入)。這樣的置換通常是在框架區(qū)?！叭嗽椿贵w”任選地還包含:典型地為人抗體的恒定區(qū)(Fe)的至少一部分。典型地，“人源化抗體”的恒定區(qū)與人抗體的恒定區(qū)是一致的。
[0020]術(shù)語“天然人抗體”是指由人抗體譜(即，種系序列)編碼的(可編碼的)抗體。
[0021]術(shù)語“嵌合抗體”是指具有非人可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體。
[0022]術(shù)語“雜交抗體”是指這樣一種抗體:包含來自某些類型的抗體(例如,人源化的)的它的重鏈或輕鏈可變區(qū)(它的重鏈或輕鏈)之一，而另一個(gè)重鏈或輕鏈可變區(qū)(重鏈或輕鏈)是來自另一種類型(例如，鼠，嵌合的)。
[0023]在一些實(shí)施例中，人源化抗體的重鏈和/或輕鏈框架區(qū)可以包含來自非人抗體(旨在被人源化)的從一至三十個(gè)氨基酸以及來自天然人抗體或人抗體共有序列的剩余部分。在一些情況下，人源化抗體可以包含從I至6個(gè)非人⑶R并且六個(gè)⑶R常常是非人的。
[0024]被選擇用于非人親本抗體的人源化的天然人抗體可以包含一個(gè)可變區(qū)，該可變區(qū)具有與非人親本抗體的(模式化)可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)(可重疊的)相似的三維結(jié)構(gòu)。像這樣，人源化抗體具有更大的具有與非人親本抗體的三維結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)的可能性。
[0025]被選擇用于人源化目的的天然人抗體的輕鏈可變區(qū)可以具有例如在整體上(在整個(gè)輕鏈可變區(qū)上)與非人親本抗體的輕鏈可變區(qū)至少70^^75^^80%等的一致性?？商娲?，被選擇用于人源化目的的天然人抗體的輕鏈框架區(qū)可以具有例如與非人親本抗體的輕鏈框架區(qū)至少70%、75 %、80 %、85 %等的序列一致性。在一些實(shí)施例中，被選擇用于人源化目的的天然人抗體在其輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)中可以具有與非人親本抗體的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)相同或基本上相同數(shù)目的氨基酸。
[0026]被選擇用于人源化目的的天然人抗體的重鏈可變區(qū)可以具有例如在整體上(在整個(gè)重鏈可變區(qū)上)與非人親本抗體的重鏈可變區(qū)至少60%、70%、75%、80%等的一致性。同樣，根據(jù)本發(fā)明，人源化抗體重鏈的人框架區(qū)氨基酸殘基可以來自天然人抗體重鏈框架區(qū)，該天然人抗體重鏈框架區(qū)具有與非人親本抗體的重鏈框架區(qū)至少70^^75^^89%等的一致性。在一些實(shí)施例中，被選擇用于人源化目的的天然人抗體在其重鏈互補(bǔ)決定區(qū)可以具有與非人親本抗體的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)相同或基本上相同數(shù)目的氨基酸。
[0027]被選擇用于非人親本抗體的人源化的天然人抗體可以包含一個(gè)可變區(qū)，該可變區(qū)具有與非人親本抗體的(模式化)可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)(可重疊的)相似的三維結(jié)構(gòu)。像這樣，人源化或雜交抗體具有更大的具有與非人親本抗體的三維結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)的可能性。
[0028]例如，可以被選擇用于人源化目的的天然人抗體重鏈可變區(qū)可以具有以下特征:
a)與非人抗體重鏈的三維結(jié)構(gòu)相似或相同的(可重疊的)三維結(jié)構(gòu)，和/或b)具有與非人抗體的重鏈框架區(qū)至少70% —致的氨基酸序列的框架區(qū)。任選地，在重鏈CDR(例如，所有三個(gè)CDR)中的(許多個(gè))氨基酸殘基與非人重鏈CDR氨基酸殘基相同或基本上相同。
[0029]可替代地，可以被選擇用于人源化目的的天然人抗體輕鏈可變區(qū)可以具有以下特征:a)與非人抗體輕鏈的三維結(jié)構(gòu)相似或相同的(可重疊的)三維結(jié)構(gòu)，和/或b)具有與非人抗體的輕鏈框架區(qū)至少70% —致的氨基酸序列的框架區(qū)。任選地，在輕鏈CDR(例如，所有三個(gè)CDR)中的(許多個(gè))氨基酸殘基與非人輕鏈CDR氨基酸殘基相同或基本上相同。
[0030]典型的抗原結(jié)合部位包含由輕鏈免疫球蛋白與重鏈免疫球蛋白配對(duì)形成的可變區(qū)?？贵w可變區(qū)的結(jié)構(gòu)是非常一致的并且展現(xiàn)非常相似的結(jié)構(gòu)。這些可變區(qū)典型地包含相對(duì)同源的框架區(qū)(FR)，這些框架區(qū)被三個(gè)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)間隔開。抗原結(jié)合片段的整體結(jié)合活性常常由CDR的序列決定。FR對(duì)于最優(yōu)的抗原結(jié)合而言常常起著CDR的三維上的正確定位和比對(duì)的作用。
[0031]本發(fā)明的抗體和/或抗原結(jié)合片段可以例如源于小鼠、大鼠或任何其他哺乳動(dòng)物或源于其他來源(例如，通過重組DNA技術(shù))。
[0032]根據(jù)下文所給出的非限制性詳細(xì)說明，本發(fā)明的進(jìn)一步的范圍、適用性和優(yōu)勢(shì)將變得清楚。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這個(gè)詳細(xì)說明在指示本發(fā)明的示例性實(shí)施例時(shí)僅僅是以舉例的方式并參考附圖而給出的。
[0033]附圖簡要說明
[0034]圖1顯示了來自ELISA的結(jié)果，ELISA將當(dāng)與漸增濃度的重組人KAAGl —起孵育時(shí)3A4嵌合抗-KAAGl抗體的結(jié)合與對(duì)照抗體的結(jié)合進(jìn)行了比較。3A4的結(jié)合曲線由較淺顏色的線顯示。
[0035]圖2顯不了一個(gè)直方圖，該直方圖描述了來自ELISA分析的結(jié)果從而映射3A4抗-KAAGl抗體的表位特異性。結(jié)果顯示3A4與包含在氨基酸61-84之間的KAAGl羧基端之內(nèi)的氨基酸序列相互作用。將3A4與3C4、3D3、和3G10抗-KAAGl抗體的結(jié)合進(jìn)行了比較，已知這些抗體分別與KAAGl的區(qū)域1-35、36-60、以及61-84相互作用。
[0036]圖3A顯示了用3A4抗-KAAGl抗體(顏色較深的線)與用對(duì)照IgG (顏色較淺的線)對(duì)SK0V-3和T0V-21G卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)的比較結(jié)果。
[0037]圖3B顯示了用3A4抗-KAAGl抗體(顏色較深的線)與用對(duì)照IgG (顏色較淺的線)對(duì)293E人腎細(xì)胞進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)的比較結(jié)果。
[0038]圖4表示通過流式細(xì)胞術(shù)用3A4抗-KAAGl抗體對(duì)SK0V-3細(xì)胞表面上的KAAGl抗原的檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞在37C被孵育時(shí)， 熒光信號(hào)隨著時(shí)間降低，表明當(dāng)細(xì)胞與3A4—起孵育時(shí)，KAAGl /抗體復(fù)合物在孵育期間被內(nèi)化。
[0039]圖5顯示了 3A4抗-KAAGl的內(nèi)化和它與LAMPl的共定位，LAMPl是一種與內(nèi)體和溶酶體膜相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0040]圖6A和6B是表示暴露至不同的抗-KAAGl抗體的腫瘤細(xì)胞的FAC分析的圖。
[0041]圖7是代表在細(xì)胞膜中的KAAGl取向的2種可能的圖示的原理圖。
[0042]圖8是鼠3A4可變結(jié)構(gòu)域的分子模型(帶狀圖)。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。
[0043]圖9a是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體LhlHhl (即，人源化輕鏈I和人源化重鏈I)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lhl指定變體I的人源化輕鏈，而Hhl指定變體I的重鏈。
[0044]圖9b是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體LhlHh2 (即，人源化輕鏈I和人源化重鏈2)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lhl指定變體I的人源化輕鏈，而Hh2指定變體2的重鏈。
[0045]圖9c是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體LhlHh3 (即，人源化輕鏈I和人源化重鏈3)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lhl指定變體I的人源化輕鏈，而Hh3指定變體3的重鏈。
[0046]圖9d是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體LhlHh4 (即，人源化輕鏈I和人源化重鏈4)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lhl指定變體I的人源化輕鏈，而Hh4指定變體4的重鏈。
[0047]圖9e是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hhl (即，人源化輕鏈2和人源化重鏈I)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hhl指定變體I的重鏈。
[0048]圖9f是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh2 (即，人源化輕鏈2和人源化重鏈2)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用111、112和113標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh2指定變體2的重鏈。
[0049]圖9g是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh3 (即，人源化輕鏈2和人源化重鏈3)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh3指定變體3的重鏈。
[0050]圖9h是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh4 (即，人源化輕鏈2和人源化重鏈4)的分子模型。⑶R環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh4指定變體4的重鏈。
[0051]圖1Oa是鼠和人源化輕鏈的3A4可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)。輕鏈具有兩種人源化變體(Lhl和Lh2)。⑶R顯示為粗體，并且由⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架區(qū)內(nèi)的回復(fù)突變加有下劃線。
[0052]圖1Ob是鼠和人源化重鏈的3A4可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)。重鏈具有四種人源化變體(Hhl至Hh4)。⑶R顯示為粗體，并且由⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架區(qū)內(nèi)的回復(fù)突變加有下劃線。
[0053]圖1lA 是使用 ClustalW2 程序(拉金(Larkin M.A.),等人,(2007) ClustalW 和ClustalX 版本 2.《生物信息學(xué)》(Bioinformatics) 200723 (21):2947-2948)的鼠 3A4 輕鏈可變區(qū)(SEQ ID N0.:4)與輕鏈可變區(qū)變體(SEQ ID N0.:33)的比對(duì)，其中(星號(hào))指示具有單個(gè)完全保守的殘基的位置，其中“:”(冒號(hào))指示在具有強(qiáng)相似特性的組之間的保守性(強(qiáng)相似特性即在Gonnet PAM250矩陣中的得分> 0.5)，并且其中“。”(句點(diǎn))指示在具有弱相似特性的組之間的保守性(弱相似特性即在Gonnet PAM250矩陣中的得分=< 0.5)。
[0054]圖1lB 是使用 ClustalW2 程序(拉金(Larkin M.A.),等人,(2007) ClustalW 和ClustalX 版本 2.《生物信息學(xué)》(Bioinformatics) 200723 (21):2947-2948)的鼠 3A4 重鏈可變區(qū)(SEQ ID N0.:2)與輕鏈可變區(qū)變體(SEQ ID N0.:38)的比對(duì)，其中(星號(hào))指示具有單個(gè)完全保守的殘基的位置，其中“:”(冒號(hào))指示在具有強(qiáng)相似特性的組之間的保守性(強(qiáng)相似特性即在Gonnet PAM250矩陣中的得分> 0.5)，并且其中”(句點(diǎn))指示在具有弱相似特性的組之間的保守性(弱相似特性即在Gonnet PAM250矩陣中的得分=< 0.5)。
[0055]圖12a表示pKCR5-3A4_HC-變體I的質(zhì)粒圖譜。人源化3A4變體的重鏈以相同方式被克隆到PK-CR5的HindIII位點(diǎn)中。因此，所得質(zhì)粒與pKCR5-3A4_HC變體I相同，除了重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的序列之外。
[0056]圖12b表示pMPG-CR5-3A4-LC-變體I的質(zhì)粒圖譜。3A4抗體的人源化變體I和2的輕鏈以相同方式被克隆到pMPG-CR5的BamHI位點(diǎn)中。因此，所得質(zhì)粒與PMPG-CR5-3A4-LC-變體I相同，除了輕鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的序列之外。
[0057]圖13表示在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞之后抗體產(chǎn)生的分析。通過蛋白質(zhì)印跡法來分析用人源化3A4抗體的輕鏈和重鏈的不同組合轉(zhuǎn)染的CHOcTA細(xì)胞的上清液(轉(zhuǎn)染后13天)。在上清液中產(chǎn)生的抗體的定量是在針對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)品(純化的人類IgG抗體)的稀釋物的蛋白質(zhì)印跡的帶掃描之后確定的。Mr分子量標(biāo)記(kDa)。
[0058]圖14是重組KAAGl樣品的Superdex G75凝膠過濾的曲線圖。將KAAGl注入經(jīng)過凝膠過濾，并且以0.4ml / min進(jìn)行分離。最大的峰在15-19部分之間。
[0059]圖15是列出了鼠3A4抗體和3A4抗體的人源化變體的速率常數(shù)和親和常數(shù)的表格。
[0060]圖16A是展示了人源化抗體的締合速率(Ka)的直方圖。
[0061]圖16B是展示了人源化抗體的解離速率(Kd)的直方圖。
[0062]圖16C是展示了人源化抗體的親和常數(shù)(Kd)的直方圖。
[0063]圖17a展示了在ELISA中結(jié)合至KAAGl上的人源化3A4變體。這個(gè)圖顯示了 3A4人源化抗體變體和鼠3A4的對(duì)比結(jié)合。與Lhl輕鏈變體組裝的人源化重鏈(Hhl、Hh2、Hh3和Hh4)的濃度依賴性結(jié)合曲線。
[0064]圖17b展示了在ELISA中結(jié)合至KAAGl上的人源化3A4變體。這個(gè)圖顯示了 3A4人源化抗體變體和鼠3A4的對(duì)比結(jié)合。與Lh2輕鏈變體組裝的人源化重鏈(Hhl、Hh2、Hh3和Hh4)的濃度依賴性結(jié)合曲線。
[0065]圖18展示了結(jié)合至癌細(xì)胞表面上的KAAGl的人源化3A4變體。這個(gè)圖解顯示了人源化和鼠3A4抗體在未透性化的SK0V-3卵巢癌細(xì)胞上的對(duì)比結(jié)合活性。
[0066]發(fā)明詳細(xì)說明
[0067]KAAGl在癌細(xì)朐中的表汰和牛物活件
[0068]本發(fā)明涉及抗體的用途，這些抗體靶向在不同癌類型(特別是卵巢癌)中發(fā)現(xiàn)的腫瘤。為了將抗體導(dǎo)向腫瘤，在癌細(xì)胞細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤特異性抗原的鑒定是必須進(jìn)行的。有若干可供使用以鑒定腫瘤特異性抗原的技術(shù)，并且用于鑒定在卵巢腫瘤中的KAAGl的方法(即稱為mRNA的基于轉(zhuǎn)錄的消減擴(kuò)增(STAR)的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)平臺(tái))描述于公開的專利申請(qǐng)?zhí)?PCT / CA2007 / 001134 中，該申請(qǐng)?zhí)栐?2007 年 12 月 27 日在 WO / 2007 / 147265號(hào)之下公開。
[0069]卵巢癌STAR文庫的分析產(chǎn)生了許多編碼分泌的和細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的基因。這些中的之一，稱為AB-0447,含有一個(gè)開放閱讀框，該開放閱讀框編碼一種相應(yīng)于SEQ IDN0.:29的84個(gè)氨基酸的多肽，SEQ ID N0.:29由一種885個(gè)堿基對(duì)的cDNA編碼，該cDNA具有在SEQ ID N0.:28中顯示的核苷酸序列。公開可用的數(shù)據(jù)庫的研究揭示了 AB-0447核苷酸序列與稱為KAAGl的基因的核苷酸序列一致。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了將其功能結(jié)構(gòu)域呈遞至細(xì)胞外室的膜錨定蛋白。KAAGl是最初從腎癌文庫作為細(xì)胞表面抗原而被克隆的，這是證實(shí)它的膜定位的一個(gè)結(jié)果。另外，我們的研究顯示該蛋白質(zhì)是在其氨基端被加工，這個(gè)結(jié)果與功能性信號(hào)肽在氨基酸30和34上或它們之間的裂解一致。此外，全長cDNA的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致在培養(yǎng)基中裂解的KAAGl的檢測(cè)。這個(gè)最終發(fā)現(xiàn)指示這種膜錨定蛋白可以在以高水平表達(dá)時(shí)從細(xì)胞脫落。相比之下，KAAGl的氨基截短突變體的表達(dá)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)保留。當(dāng)前沒有任何闡明它的功能的公開報(bào)道，并且如由本發(fā)明披露的卵巢癌中KAAGl的過度表達(dá)在以前從未有文件記錄過。
[0070]因此我們已經(jīng)研究了 KAAGl是否可以用于基于抗體的診斷和治療。
[0071]已經(jīng)建立了若干基于卵巢癌細(xì)胞的模型，例如T0V-21G、T0V-112D, 0V-90以及其他，并且這些模型對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟悉的。這些細(xì)胞是人卵巢癌細(xì)胞系的集合的一部分，這些人卵巢癌細(xì)胞系衍生自具有卵巢腫瘤或腹水液的患者。這些細(xì)胞系已經(jīng)經(jīng)歷深入分析，包括在微陣列上的全基因表達(dá)譜，這些微陣列使這些細(xì)胞系成為優(yōu)異的用于人卵巢癌的基于細(xì)胞的模型。生長特性、基因表達(dá)譜以及對(duì)化學(xué)治療藥的反應(yīng)指示這些細(xì)胞系對(duì)于卵巢腫瘤體內(nèi)行為是非常具有代表性的(貝諾特(Benoit)等人，2007)。從這些卵巢癌細(xì)胞系分離的總RNA的RT-PCR分析顯示KAAGl轉(zhuǎn)錄物弱表達(dá)于從原發(fā)性腫瘤衍生的細(xì)胞系中。相比之下，源于腹水液的細(xì)胞系包含高水平的KAAGl表達(dá)。在來自腹水液的細(xì)胞中KAAGl的增加的表達(dá)表明細(xì)胞的環(huán)境影響KAAGl基因的調(diào)節(jié)。腹水細(xì)胞與晚期疾病相關(guān)，并且這種表達(dá)模式意味著增加的KAAGl水平與錨定非依賴性生長(anchorage-1ndependent growth)相關(guān)。與這個(gè)后者的表明一致，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將這些細(xì)胞在3D培養(yǎng)下培養(yǎng)為球狀體細(xì)胞時(shí)，在從原發(fā)性腫瘤衍生的細(xì)胞系中KAAGl表達(dá)顯著增加。這些球狀體細(xì)胞已經(jīng)被廣泛表征，并且發(fā)現(xiàn)其展示出許多與體內(nèi)腫瘤相關(guān)的特性(科迪(Cody)等人，2008)。因此，發(fā)現(xiàn)在模擬腫瘤進(jìn)展(特別是在卵巢癌的演化過程中)的模型中KAAGl的表達(dá)顯著增加。
[0072]隨著在卵巢癌細(xì)胞中KAAGl表達(dá)被調(diào)節(jié)的證明，在基于細(xì)胞的測(cè)定中檢驗(yàn)了這種基因在卵巢癌細(xì)胞行為中的功能。為此目的，使用RNA干擾(RNAi)來敲低卵巢癌細(xì)胞系中的內(nèi)源性KAAGl基因的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)KAAGl的降低的表達(dá)導(dǎo)致如在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性測(cè)定中所確定的細(xì)胞遷移的顯著減少，如由傷口愈合(或擦傷)分析所舉例說明的。這種類型的分析測(cè)量了細(xì)胞填充一個(gè)融合單層中的裸露區(qū)的速度。KAAGl的表達(dá)降低導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞系的存活的降低，如通過克隆生成測(cè)定(例如集落存活分析)所測(cè)量的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用其他方法來評(píng)估KAAGl在癌細(xì)胞(特別是卵巢癌細(xì)胞)的行為中的需要。
[0073]基于在大比例的卵巢腫瘤中KAAGl的表達(dá)、它在正常組織中的有限表達(dá)、以及在表達(dá)水平和增加的惡性之間的一致性、以及KAAGl在卵巢癌細(xì)胞系的行為中的假定的生物作用，將KAAGl選擇作為治療靶標(biāo)，以用于開發(fā)用于卵巢癌的檢測(cè)、預(yù)防、和治療的抗體。KAAGl在除了卵巢癌之外的癌癥中的表達(dá)還引導(dǎo) 申請(qǐng)人:對(duì)用于其他癌癥適應(yīng)癥的治療性或診斷性抗體進(jìn)行評(píng)估。
[0074]因此本發(fā)明提供了抗-KAAGl抗體和其抗原結(jié)合片段，它們特異性地靶向KAAGl并且可以例如用作抗體-藥物結(jié)合物。
[0075]這樣的抗體和抗原結(jié)合片段包括例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、抗體片段、單鏈抗體、域抗體、以及具有抗原結(jié)合區(qū)的多肽。
[0076]結(jié)合至KAAGl上的抗體和抗原結(jié)合片段
[0077]最初將抗體針對(duì)它們對(duì)感興趣抗原的特異性而從Fab文庫分離。
[0078]在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段的可變區(qū)可以與所希望的物種的恒定區(qū)融合，由此允許抗體由所希望的物種的效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別。恒定區(qū)可以例如源于IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4亞型。克隆或合成框內(nèi)恒定區(qū)與可變區(qū)在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的范圍之內(nèi)，并且可以例如通過重組DNA技術(shù)來進(jìn)行。因此，包含人抗體恒定區(qū)的抗體以及包含人抗體框架氨基酸的抗體或抗原結(jié)合片段也被本發(fā)明包括。
[0079]本發(fā)明因此提供了示例性實(shí)施例，包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種分離的抗體或抗原結(jié)合片段，該輕鏈可變區(qū)具有；
[0080] a.一個(gè) CDRLl 序列，該 CDRLl 序列包含 SEQ ID N0.:8 或如在 SEQID N0.:8 中所列出的；
[0081]b.一個(gè) CDRL2 序列，該 CDRL2 序列包含 SEQ ID N0.:9 或如在 SEQID N0.:9 中所列出的，或；
[0082]c.一個(gè) CDRL3 序列，該 CDRL3 序列包含 SEQ ID N0.: 10 或如在 SEQID N0.:10 中所列出的。
[0083]分離的抗體或抗原結(jié)合片段還可以包含一個(gè)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有；
[0084]a.一個(gè) CDRHl 序列，該 CDRHl 序列包含 SEQ ID N0.:5 或如在 SEQID N0.:5 中所列出的；
[0085]b.一個(gè) CDRH2 序列，該 CDRH2 序列包含 SEQ ID N0.:6 或如在 SEQID N0.:6 中所列出的，或；
[0086]c.一個(gè) CDRH3 序列，該 CDRH3 序列包含 SEQ ID N0.:7 或如在 SEQID N0.:7 中所列出的。
[0087]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含輕鏈可變區(qū)的任何單獨(dú)的⑶R或者⑶R1、⑶R2和/或⑶R3的組合。可以更具體地選擇⑶R3。組合可以包括例如CDRLl 和 CDRL3, CDRLl 和 CDRL2, CDRL2 和 CDRL3 以及，CDRLl、CDRL2 和 CDRL3。
[0088]在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含重鏈可變區(qū)的任何單獨(dú)的⑶R或者⑶R1XDR2和/或⑶R3的組合?？梢愿唧w地選擇⑶R3。組合可以包括例如CDRHl 和 CDRH3，CDRHl 和 CDRH2，CDRH2 和 CDRH3 以及，CDRHl、CDRH2 和 CDRH3。
[0089]根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3中的至少兩個(gè)CDR。
[0090]同樣，根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含一個(gè)⑶RL1、一個(gè)⑶RL2和一個(gè)CDRL3。
[0091]進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含:
[0092]a.⑶RLl、⑶RL2或⑶RL3中的至少兩個(gè)⑶R以及；
[0093]b.一個(gè)⑶RHl、一個(gè)⑶RH2或一個(gè)⑶RH3中的至少兩個(gè)⑶R。
[0094]抗體或抗原結(jié)合片段可以更優(yōu)選地包含一個(gè)⑶RLl、一個(gè)⑶RL2和一個(gè)⑶RL3。
[0095]抗體或抗原結(jié)合片段也可以更優(yōu)選地包含一個(gè)⑶RHl、一個(gè)⑶RH2和一個(gè)⑶RH3。
[0096]根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含一個(gè)⑶RHl、一個(gè)⑶RH2或一個(gè)⑶RH3。[0097]根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段也可以包含一個(gè)⑶RH1、一個(gè)⑶RH2和一個(gè)CDRH3。
[0098]當(dāng)輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)僅有一者可獲得時(shí)，可以使用在本領(lǐng)域中已知的方法通過篩選互補(bǔ)可變區(qū)文庫而重建抗體或抗原結(jié)合片段(波爾托拉諾(Portolano)等人《免疫學(xué)雜志》(The Journal of Immunology) (1993) 150:880-887,克拉克森(Clarkson)等人,《自然》(Nature) (1991)352:624-628)。
[0099]本發(fā)明還包括含有在此處所述的⑶R的至少一者中具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。
[0100]本發(fā)明還包括含有在至少兩個(gè)⑶R中具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。
[0101]本發(fā)明還包括含有在3個(gè)⑶R中具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換(與原始⑶R相比較)的可變鏈的多肽或抗體。
[0102]本發(fā)明還包括含有在至少一個(gè)⑶R中具有至少兩個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。
[0103]本發(fā)明還包括含有在至少兩個(gè)⑶R中具有至少兩個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。
[0104]本發(fā)明還包括含有在3個(gè)⑶R中具有至少兩個(gè)保守性氨基酸置換(與原始⑶R相比較)的可變鏈的多肽或抗體。
[0105]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種多肽、抗體或抗原結(jié)合片段，它們包含(在單一多肽鏈上或在多個(gè)分開的多肽鏈上`)在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段之一的輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)以及重鏈可變區(qū)的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)。
[0106]本發(fā)明在其另一個(gè)方面涉及抗-KAAGl抗體，這些抗-KAAGl抗體可以包含(在單一多肽鏈上或在多個(gè)分開的多肽鏈上)在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段的所有六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻。
[0107]變體抗體和抗原結(jié)合片段
[0108]本發(fā)明還包括在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段的變體。所包括的變體抗體或抗原結(jié)合片段是具有在氨基酸序列中的變異的那些。例如，所包括的變體抗體或抗原結(jié)合片段是具有至少一個(gè)變體⑶R(兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)變體⑶R或甚至12個(gè)變體OTR)、一個(gè)變體輕鏈可變區(qū)、一個(gè)變體重鏈可變區(qū)、一個(gè)變體輕鏈和/或一個(gè)變體重鏈的那些。包括在本發(fā)明中的變體抗體或抗原結(jié)合片段是具有例如與原始抗體或抗原結(jié)合片段相比較相似的或改進(jìn)的結(jié)合親和力的那些。
[0109]如在此使用的術(shù)語“變體”適用于在此所述的任何序列，并且包括例如變體CDR (CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRHl、CDRH2和/或CDRH3)、變體輕鏈可變區(qū)、變體重鏈可變區(qū)、變體輕鏈、變體重鏈、變體抗體、變體抗原片段以及KAAGl變體。
[0110]被本發(fā)明包括的變體抗體或抗原結(jié)合片段是可以包含插入、缺失或氨基酸置換(保守性或非保守性)的那些。這些變體在其氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基可以被去除并且在其位置中插入一個(gè)不同的殘基。
[0111]本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以具有如上所述的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，并且可以進(jìn)一步包含恒定區(qū)的氨基酸，例如人抗體恒定區(qū)的氨基酸。[0112]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以包含例如人IgGl恒定區(qū)。
[0113]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例，抗原結(jié)合片段可以是例如scFv、Fab、Fab'或(Fab' )2。
[0114]用于置換誘變的感興趣位點(diǎn)包括高變區(qū)(CDR)，但是還考慮了在框架區(qū)中或甚至在恒定區(qū)中的修飾?？梢酝ㄟ^將來自以下列出的組(I至6組)中之一的(⑶R、可變鏈、抗體等的)氨基酸用相同組的另一個(gè)氨基酸交換而產(chǎn)生保守性置換。
[0115]保守性置換的其他示例性實(shí)施例示于表格IA中“優(yōu)選的置換”標(biāo)題之下。如果這樣的置換導(dǎo)致所不希望的特性，則可以將在表1A中命名為“示例性置換”的、或如在下文進(jìn)一步參考氨基酸類別所述的更多實(shí)質(zhì)性改變引入，并且篩選產(chǎn)物。
[0116]本領(lǐng)域中已知的是變體可以通過置換誘變而產(chǎn)生，并且保留本發(fā)明的多肽的生物活性。這些變體在其氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基被去除并且在其位置中插入一個(gè)不同的殘基。例如，用于置換誘變的感興趣的一個(gè)位點(diǎn)可以包括這樣一個(gè)位點(diǎn):在該位點(diǎn)中從不同物種獲得的特定殘基是相同的。被鑒定為“保守性置換”的置換的實(shí)例示于表1A中。如果這樣的置換導(dǎo)致所不希望的改變，則可以將在表1A中命名為“示例性置換”的、或如在下文進(jìn)一步參考氨基酸類別所述的其他類型的置換引入，并且篩選產(chǎn)物。
[0117]通過選擇置換而完成在功能或免疫身份方面的實(shí)質(zhì)性修飾，這些置換在它們對(duì)維持以下項(xiàng)的作用方面顯著不同:(a)在置換區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，如片層或螺旋構(gòu)象。(b)分子在靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈的體積?；诠餐膫?cè)鏈特性將天然存在的殘基分組:
[0118](I組)疏水性的:正亮氨酸 、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)
[0119](2組)中性親水性的:半胱氨酸(Cys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)
[0120](3組)酸性的:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
[0121](4組)堿性的:天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
[0122](5組)影響鏈取向的殘基:甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro);以及
[0123](6組)芳香族的:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)
[0124]非保守性置換將需要將這些類別之一的一個(gè)成員用另一個(gè)交換。
[0125]表1A.氨基酸置換
【權(quán)利要求】
1.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體或其抗原結(jié)合片段能夠特異性地結(jié)合至腎相關(guān)抗原I (KAAGl)上，這種腎相關(guān)抗原I具有與SEQ ID N0.:4至少70%—致的一個(gè)輕鏈可變區(qū)和/或與SEQ ID N0.:2至少70%—致的一個(gè)重鏈可變區(qū)，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與SEQ ID N0.:4或SEQ ID N0.:2相比包含至少一個(gè)氨基酸置換，并且其中所述氨基酸置換是在一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)之外。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)與SEQID N0.:4是至少80% —致的。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)與SEQID N0.:4是至少90% —致的。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)與SEQID N0.:2是至少80% —致的。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)與SEQID N0.:2是至少90% —致的。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該至少一個(gè)氨基酸置換是在該輕鏈可變區(qū)之內(nèi)。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該至少一個(gè)氨基酸置換是在該重鏈可變區(qū)之內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中這些重鏈⑶R包含在SEQ ID N0.:5、SEQ ID N0.:6 和 SEQ ID N0.:7 中列出的這些氨基酸。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中這些輕鏈⑶R包含在SEQ ID N0.:8、SEQ ID N0.:9 和 SEQ ID N0.:10 中列出的這些氨基酸。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體是一種單克隆抗體、一種嵌合抗體、一種雜交抗體、一種人源化抗體或一種人抗體、或它們的一種抗原結(jié)合片段。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)是如在SEQ ID N0.:30中所列出的。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)是如在SEQIDN0.:32中所列出的。
13.如權(quán)利要求12所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)是如在SEQIDN0.:33中或在SEQ ID N0.:34中所列出的。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQ ID N0.:35中所列出的。
15.如權(quán)利要求14所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQIDN0.:36中所列出的。
16.如權(quán)利要求15所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQIDN0.:37中所列出的。
17.如權(quán)利要求16所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQIDN0.:38, SEQ ID N0.:39, SEQ ID N0.:40 或 SEQ ID N0.:41 中所列出的 。
18.一種抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段能夠與如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭并且具有少InM的親和力。
19.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段與一種治療部分相結(jié)合。
20.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段與一種可檢測(cè)部分相結(jié)合。
21.一種核酸，該核酸編碼如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段的一個(gè)輕鏈可變區(qū)和/或一個(gè)重鏈可變區(qū)。
22.—種載體，該載體包含如權(quán)利要求21所述的核酸。
23.如權(quán)利要求22所述的載體，其中所述載體是一種表達(dá)載體。
24.一種分離的細(xì)胞，這種分離的細(xì)胞包含如權(quán)利要求21所述的核酸。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種核酸、以及編碼一個(gè)重鏈可變區(qū)的一種核酸。
26.如權(quán)利要求25所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)、組裝和/或分泌一種抗體或其抗原結(jié)合片段。
27.一種分離的細(xì)胞，這種分離的細(xì)胞包含或表達(dá)如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
28.如權(quán)利要求27所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種核酸、以及編碼一個(gè)重鏈可變區(qū)的一種核酸。
29.如權(quán)利要求28所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)、組裝和/或分泌一種抗體或其抗原結(jié)合片段。
30.一種藥物組合物，該藥物組合物包含如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段、以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
31.一種組合物，該組合物包含如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段、以及一種載體。
32.—種治療癌癥的方法，該癌癥包含表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的細(xì)胞，該方法包括將如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段給予至有需要的受試者。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中該癌癥選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦腫瘤、甲狀腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管腫瘤、膀胱腫瘤、肺腫瘤以及頭頸部腫瘤。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中該癌癥是卵巢癌。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該癌癥是復(fù)發(fā)性卵巢癌。
36.如權(quán)利要求32至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
37.一種檢測(cè)腫瘤的方法，該腫瘤包含表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的細(xì)胞，該方法包括將如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段給予至有需要的受試者。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中有需要的受試者患有一種選自下組的癌癥，該組由以下各項(xiàng)組成:卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。
39.一種用于檢測(cè)KAAGl或KAAGl變體的方法，該方法包括使一種表達(dá)KAAGl或KAAGl變體的細(xì)胞或一種包含或疑似包含KAAGl或該KAAGl變體的樣品與如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段接觸，并且對(duì)結(jié)合進(jìn)行測(cè)量。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中受試者患有或疑似患有癌癥。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
42.如權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品是從一種哺乳動(dòng)物獲得的一種血清樣品、一種血漿樣品或一種血液樣品。
43.如權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品是從一種哺乳動(dòng)物獲得的一種組織樣品。
44.如權(quán)利要求39至41所述的方法，其中該樣品是一種細(xì)胞培養(yǎng)物或一種上清液。
45.如權(quán)利要求39至44中任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將結(jié)合至KAAGl或該KAAGl變體上的抗體的量進(jìn)行定量。
46.—種試劑盒,該試劑盒包含如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
47.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段在一種藥劑的制造中的用途，該藥劑用于治療癌癥，該癌癥包含表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的細(xì)胞。
48.如權(quán)利要求47所述的用途，其中該癌癥選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。
49.如權(quán)利要求48所述的用途，其中該癌癥是卵巢癌。
50.如權(quán)利要求49所述的用途，其中該癌癥是復(fù)發(fā)性卵巢癌。
51.如權(quán)利要求47至50中任一項(xiàng)所述的用途，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
52.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段在包含表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的細(xì)胞的癌癥的診斷中的用途，或在表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的細(xì)胞的檢測(cè)中的用途。
53.如權(quán)利要求52所述的用途，其中該癌癥選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。
54.如權(quán)利要求53所述的用途,其中該癌癥是卵巢癌。
55.如權(quán)利要求54所述的用途，其中該癌癥是復(fù)發(fā)性卵巢癌。
56.如權(quán)利要求52至55中任一項(xiàng)所述的用途，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
57.一種用于獲得抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，該抗體或其抗原結(jié)合片段適合于用作一種治療癌癥的抗體-藥物結(jié)合物，該癌癥包含表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的細(xì)胞，該方法包括: a.提供特異性地結(jié)合至一種表位的一種抗體或一種抗原結(jié)合片段，該表位被包含在KAAGl或一種KAAGl變體的氨基酸61與84之間； b.對(duì)該抗體或抗原結(jié)合片段在表達(dá)KAAGl或一種KAAGl變體的一種細(xì)胞之內(nèi)的內(nèi)化進(jìn)行測(cè)試；并且 c.對(duì)被內(nèi)化的一種抗體或一種抗原結(jié)合片段進(jìn)行分離。
【文檔編號(hào)】A61P35/04GK103492418SQ201280015597
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月31日
【發(fā)明者】G·B·特雷姆勃雷, A·N·莫萊提斯, T·舒利亞, M·菲利昂 申請(qǐng)人:阿萊斯亞生物療法股份有限公司