經(jīng)由FcγIIB促進抗原消除的抗原結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供：抗原結(jié)合分子，其包含(i)對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、(ii)具有FcγRIIb選擇性結(jié)合活性的Fcγ結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(iii)在pH酸性范圍條件下具有FcRn結(jié)合活性的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及與給予該分子前相比降低該抗原的血漿中濃度的方法，其包括給予該分子。
【專利說明】經(jīng)由FeYIIB促進抗原消除的抗原結(jié)合分子

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供：抗原結(jié)合分子在從血漿中消除抗原中的使用；從血漿中消除抗原的 方法，其包括給予抗原結(jié)合分子；藥物組合物，其包含可從血漿中消除抗原的抗原結(jié)合分 子；以及用于從血漿中消除抗原的抗原結(jié)合分子的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗體在血漿中的穩(wěn)定性高、副作用也少，因而作為醫(yī)藥品受到關(guān)注。其中，IgG型 的抗體藥物有大量上市，現(xiàn)在也正在開發(fā)著數(shù)量眾多的抗體藥物（非專利文獻1和非專利 文獻2)。另一方面，作為能適用于第二代抗體藥物的技術(shù)，開發(fā)有各種技術(shù)，報道了使效應(yīng) 子功能、抗原結(jié)合能力、藥代動力學、穩(wěn)定性提高的技術(shù)或者使免疫原性風險降低的技術(shù)等 (非專利文獻3)。通常，抗體藥物的給藥量非常高，因而作為課題可考慮到難以制作皮下給 藥制劑，制備成本高等。作為降低抗體藥物的給藥量的方法，可考慮改善抗體的藥代動力學 的方法和使抗體與抗原的親和性提高的方法。
[0003] 作為改善抗體的藥代動力學的方法，報道有恒定區(qū)的人工氨基酸取代（非專利文 獻4和5)。作為增強抗體對抗原的結(jié)合活性和/或中和活性的技術(shù)，報道有親和性成熟技 術(shù)（非專利文獻6)，通過對可變區(qū)的CDR區(qū)等的氨基酸導入突變可以增強對抗原的結(jié)合活 性。通過增強抗原結(jié)合能力，可以使體外的生物活性提高，或者降低給藥量，進而也可以使 體內(nèi)（機體內(nèi)）的藥效提高（非專利文獻7)。
[0004] 另一方面，每一分子具有中和活性的抗體能夠中和的抗原量依賴于親和性，為了 以少的抗體量中和抗原，可以通過各種方法增強抗體的親和性（非專利文獻6)。進而，只 要是可共價地與抗原結(jié)合、對抗原的親和性無限大的抗體，則可以用一分子的抗體來中和 一分子的抗原（二價的情形為二抗原）。但是，這樣的方法中，限制是一分子抗體對一分子 抗原（二價的情形是二抗原）的化學計量的中和反應(yīng)，不可能用抗原量以下的抗體量來完 全中和抗原。即，在通過增強親和性來中和抗原的效果方面存在限制（非專利文獻8)。中 和抗體的情形中，為了使其中和效果持續(xù)一定期間，需要給予機體內(nèi)在該期間產(chǎn)生的抗原 量以上的抗體量，僅通過上述的抗體藥代動力學改善或者親和性成熟技術(shù)，在降低必要抗 體給藥量方面存在限制。因此，為了用抗原量以下的抗體量來使抗原的中和效果持續(xù)目標 時間，需要用一個抗體來中和多個抗原。作為實現(xiàn)其的新方法，最近報道了 PH和/或金屬 離子濃度依賴性地與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子（專利文獻1和2)。在血漿中的pH中性和 /或高鈣離子濃度條件下與抗原強結(jié)合、在內(nèi)體內(nèi)的pH酸性和/或低鈣離子濃度條件下從 抗原解離的離子濃度依賴性抗原結(jié)合分子，其可在內(nèi)體內(nèi)從抗原解離。離子濃度依賴性抗 原結(jié)合分子解離抗原后，若該分子通過FcRn再循環(huán)至血漿中，則可再次與抗原結(jié)合。因此， 一個離子濃度依賴性抗原結(jié)合分子可重復結(jié)合多個抗原。
[0005] 另一方面，與結(jié)合至FcRn而被再循環(huán)的抗體相比，抗原的血漿中滯留性非常短。 然而，即使抗原自身的血漿中滯留性短，若是這種血漿中滯留性長的普通抗體與該抗原結(jié) 合，那么抗體抗原復合體的血漿中滯留性也變得與抗體一樣長。因此，通常，如果給予抗體， 那么由于該抗體結(jié)合的抗原以抗體抗原復合體的形式存在，準確地說，血漿中滯留性變長 (難以從血漿中消除），故而血漿中的抗原濃度上升。另一方面，離子濃度依賴性抗原結(jié)合 分子可通過在內(nèi)體內(nèi)從抗原解離來抑制血漿中抗原濃度的上升。但是，上述對血漿中抗原 濃度上升的抑制受到與該抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的量的平衡的影響。因此還考慮了，存在通過給 予這樣的離子濃度依賴性抗原結(jié)合分子卻使血漿中抗原濃度與給予該分子前相比上升的 情況的可能性（專利文獻3)。
[0006] 最近，制作了在中性條件下具有FcRn結(jié)合的抗原結(jié)合分子。已發(fā)現(xiàn)，通過給予離 子濃度依賴性地與抗原結(jié)合、在中性條件下具有FcRn結(jié)合的抗原結(jié)合分子，可使血漿中抗 原濃度與給予該分子前相比降低（專利文獻3)。與普通抗體通過給予抗體使血漿中抗原濃 度上升相比，在pH中性條件下具有FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子和離子濃度依賴性地與 抗原結(jié)合、在PH中性條件下具有FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子可通過給予該分子使血漿 中抗原濃度降低。這樣的抗原結(jié)合分子可經(jīng)由作為與FcRn結(jié)合的結(jié)果所引起的胞吞作用 主動地從血漿中除去抗原，因此作為藥物極其有用。
[0007] 另一方面，作為IgG受體，除了 FcRn之外，還存在多種Fe Y受體（Fe Y RI、 Fe Y Rlla、Fe Y Rllb、Fe Y RIIIa)(非專利文獻9)。抗體的活性型Fe Y受體結(jié)合活性在 抗體的細胞毒活性中發(fā)揮重要作用，因此，迄今開發(fā)了通過增強活性型Fe Y受體結(jié)合活性 增強了細胞毒活性的以膜型抗原為靶標的抗體（非專利文獻10、11)。同樣地，抑制型Fe Y 受體（FcYRIIb)結(jié)合活性在免疫抑制活性（非專利文獻12、13、14)、激動活性（非專利文 獻15、16)等中發(fā)揮重要作用，因此，抑制型Fe Y受體結(jié)合活性增強的以膜型抗原為靶標的 抗原的研究正在進行中（非專利文獻17、18)。
[0008] 對于與可溶型抗原結(jié)合的抗體對FeY結(jié)合的影響，主要從副作用的觀點進行了 研究。例如，已知在給予了抗VEGF抗體貝伐單抗（bevacizumab)的患者組中血栓栓塞風 險上升（非專利文獻19)。另外，在抗CD40配體抗體的臨床開發(fā)試驗中，也同樣地觀察到 血栓栓塞，中止了臨床試驗（非專利文獻20)。在血小板細胞上發(fā)現(xiàn)了活性型Fe Y受體 Fe Y RIIa而非抑制型Fe Y受體Fe Y RIIb (非專利文獻21)，但是通過之后使用動物模型 等的研究表明，給予的任一抗體均經(jīng)由與血小板上Fe Y RIIa的結(jié)合使血小板聚集，其結(jié)果 形成血栓（非專利文獻22、非專利文獻23)。據(jù)報道，在自身免疫疾病之一的系統(tǒng)性紅斑狼 瘡患者中，通過Fe Y RIIa依賴性機制活化血小板，血小板的活化與嚴重性相關(guān)（非專利文 獻24)。另外，有報道稱，使用增強了 Fe Y RIIb結(jié)合的抗體作為藥物時，可望降低抗抗體的 產(chǎn)生風險（非專利文獻25)，膜型抗原結(jié)合抗體的Fe Y RIIa結(jié)合增強的抗體增強樹突細胞 或巨噬細胞介導的抗體依賴性吞噬活性（ADCP)(非專利文獻26)。然而，以可溶型抗原為 靶標的抗體的活性型和/或抑制型Fe Y受體結(jié)合活性對于給予了該抗體的機體中該抗體 或該抗體所結(jié)合的抗原的血漿中動力學的效果尚屬未知。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻 I :W02009/125825 專利文獻 2 :W02012/073992 專利文獻 3 :W02011/122011 非專利文獻 非專利文獻 I :Janice M Reichert，Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. , Nat. Biotechnol. (2005) 23， 1073-1078 非專利文獻 2 :Pavlou AKj Belsey MJ. , The therapeutic antibodies market to 2008., Eur. J. Pharm. Biopharm., (2005) 59 (3), 389-396 非專利文獻 3 :Kim SJj Park Y， Hong HJ.， Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies.， Mol. Cells， （2005) 20 (1)， 17-29 非專利文獻4 :Hinton PR, Xiong JM，Johlfs MG, Tang MT, Keller S，Tsurushita N. , An engineered human IgGl antibody with longer serum half-life.，J. Immunol. (2006) 176 (1)， 346-356 非專利文獻5 :Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，Medesan C，Ober RJj Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis.， Nat. Biotechnol. 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(2006) 203 (9), 2157-2164 非專利文獻 22 :Meyer T，Robles-Carrillo L，Robson T，Langer F，Desai H， Davila M, Amaya M，F(xiàn)rancis JLj Amirkhosravi A. , Bevacizumab immune complexes activate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice. , J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1)， 171-181 非專利文獻 23 :Robles-Carrillo L，Meyer T，Hatfield M，Desai H，Davila M， Langer F，Amaya M，Garber E，F(xiàn)rancis JLj Hsu YMj Amirkhosravi A. , Anti_CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice.， J. Immunol. (2010) 185 (3)， 1577-1583 非專利文獻 24 :Duffau P，Seneschal J，Nicco C，Richez C，Lazaro E，Douchet I，Bordes C，Viallard JFj Goulvestre C，Pellegrin JLj Weil B，Moreau JFj Batteux F, Blanco P. , Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus., Sci. Transl. Med (2010) 2 (47)，47-63 非專利文獻25 :Desai DD, Harbers SO, Flores M, Colonna L, Downie MP, Bergtold A, Jung S, Clynes R. , Fe gamma receptor IIB on dendritic cells enforces peripheral tolerance by inhibiting effector T cell responses., J. Immunol. (2007) 178 (10)， 6217-6226 非專利文獻 26 :Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR. , Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells.，Mol. Cancer Ther. (2008) 7 (8) 2517-2527。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明所要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明乃鑒于上述情況而完成。如前所述，以可溶型抗原為靶標的抗體與活性型和/ 或抑制型Fe Y受體的結(jié)合活性對給予了該抗體的機體中該抗體或該抗體所結(jié)合的抗原的 血漿中動力學的效果尚屬未知。即，本發(fā)明的課題在于，通過給予具有對血漿中以可溶型存 在的病因抗原的結(jié)合活性、對活性型和/或抑制型Fe Y受體具有所需的結(jié)合活性的抗原結(jié) 合分子，來抑制該分子所結(jié)合的抗原的血漿中濃度的上升。本發(fā)明的課題還在于，通過優(yōu)化 抗血漿中以可溶型存在的病因抗原的抗原結(jié)合分子對活性型和/或抑制型Fe Y受體的結(jié) 合活性，來優(yōu)化對該分子所結(jié)合的抗原的血漿中濃度上升的抑制。
[0011] 用于解決技術(shù)問題的手段 艮P，本發(fā)明提供：抗原結(jié)合分子，其包含（i)對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變 化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、（ii)具有FcYRIIb選擇性結(jié)合活性的Fcy結(jié)合結(jié)構(gòu)域和（iii)在 pH酸性范圍條件下具有FcRn結(jié)合活性的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和使該抗原的血楽中濃度與給 予該分子前相比降低的方法，其包括給予該分子。此外，本發(fā)明提供抗原的血漿中濃度的降 低劑，其包含含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分子：（i)對該抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而 變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、（ii)具有Fe Y RIIb選擇性結(jié)合活性的Fe Y結(jié)合結(jié)構(gòu)域和（iii) 在pH酸性范圍條件下具有FcRn結(jié)合活性的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供藥物組合物， 其包含含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分子：（i)對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、（ii)具有Fe Y RIIb選擇性結(jié)合活性的Fe Y結(jié)合結(jié)構(gòu)域和（iii)在pH酸 性范圍條件下具有FcRn結(jié)合活性的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，本發(fā)明提供含有下述結(jié)構(gòu)的 該分子在使抗原的血漿中濃度降低中的使用：（i)對該抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而 變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、（ii)具有Fe Y RIIb選擇性結(jié)合活性的Fe Y結(jié)合結(jié)構(gòu)域和（iii) 在PH酸性范圍條件下具有FcRn結(jié)合活性的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。除上述之外，本發(fā)明還提供 該分子的制備方法和/或篩選方法。并非旨在特別受以下的限定，作為非限定的一個方案， 具體提供以下內(nèi)容：
[1]抗原結(jié)合分子在使抗原從血漿中消除中的使用，其中，所述抗原結(jié)合分子包含對 該抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的 氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fc區(qū)；
[2] [1]的使用，其中，所述Fe區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少一個以上的 氨基酸進一步被取代的Fe區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、 269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356 位、 358位、396位、409位和419位；
[3] [2]的使用，其中，所述Fe區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的任一個 以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為Ile， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gln中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gln中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu ;
[4] [1]~[3]中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為對所述抗原的結(jié)合活性隨 鈣離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[5] [4]的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為結(jié)合活性以下述方式變化的抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域：在低鈣離子濃度條件下對所述抗原的結(jié)合活性比在高鈣離子濃度條件下對所述抗原 的結(jié)合活性低；
[6] [ir[3]中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為對所述抗原的結(jié)合活性隨 pH條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[7] [6]的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為結(jié)合活性以下述方式變化的抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域：在pH酸性范圍條件下對所述抗原的結(jié)合活性比在pH中性范圍條件下的結(jié)合活性 低；
[8] [ir[7]中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為抗體的可變區(qū)；
[9] [1]?[8]中任一項的使用，其中，所述Fc區(qū)為在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任 一個中含有的Fc區(qū)中以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的 Fc區(qū)；
[10] [1]~[8]中任一項的使用，其中，所述Fc區(qū)在pH酸性范圍條件下的FcRn結(jié)合活 性與SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一個中含有的Fc區(qū)的FcRn結(jié)合活性相比增強；
[11] [10]的使用，其中，所述增強的Fc區(qū)為在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一個 中含有的Fc區(qū)的氨基酸序列中選自以EU編號表示的下述位置的至少一個以上的氨基酸被 取代的 Fc 區(qū)：244 位、245 位、249 位、250 位、251 位、252 位、253 位、254 位、255 位、256 位、 257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、 293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、 332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、 380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、 427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439 位、440 位、442 位 或447位；
[12] [11]的使用，其中，所述增強的Fc區(qū)在SEQ ID NO: 14、15、16或17中含有的 Fc區(qū)的氨基酸序列中含有選自以EU編號表示的下述位置的氨基酸的至少一個以上的氨基 酸： 244位的氨基酸為Leu， 245位的氨基酸為Arg, 249位的氨基酸為Pro， 250位的氨基酸為Gln或Glu中的任一個，或者 251位的氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個， 252位的氨基酸為Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一個， 254位的氨基酸為Ser或Thr中的任一個， 255位的氨基酸為Arg、Gly、Ile或Leu中的任一個， 256 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個， 257位的氨基酸為Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一個， 258位的氨基酸為Asp， 260位的氨基酸為Ser， 262位的氨基酸為Leu， 270位的氨基酸為Lys， 272位的氨基酸為Leu或Arg中的任一個， 279 位的氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任 一個， 283 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Trp或Tyr中的任一個， 285位的氨基酸為Asn， 286位的氨基酸為Phe， 288位的氨基酸為Asn或Pro中的任一個， 293位的氨基酸為Val， 307位的氨基酸為Ala、GliuGln或Met中的任一個， 308位的氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個， 309位的氨基酸為Pro， 311 位的氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一個， 312位的氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個， 314位的氨基酸為Ala或Leu中的任一個， 316位的氨基酸為Lys， 317位的氨基酸為Pro， 318位的氨基酸為Asn或Thr中的任一個， 332 位的氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個， 339位的氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個， 341位的氨基酸為Pro， 343位的氨基酸為Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr或Tyr中的任一個， 375位的氨基酸為Arg， 376位的氨基酸為Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一個， 377位的氨基酸為Lys， 378位的氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一個， 380位的氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個， 382 位的氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個， 385 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一個， 386 位的氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個， 387位的氨基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一個， 389位的氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個， 423位的氨基酸為Asn， 427位的氨基酸為Asn， 428位的氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個， 430 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個， 431位的氨基酸為His或Asn中的任一個， 433位的氨基酸為Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro或Ser中的任一個， 434位的氨基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一個， 436 位的氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一個， 438位的氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個， 440位的氨基酸為Lys，或者， 442位的氨基酸為Lys ;
[13] [ir[i2]中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合分子為抗體；
[14] 藥物組合物，其包含含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分子：對抗原的結(jié)合活性隨離子濃 度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨 基酸為Gly的Fc區(qū)；
[15] [14]的藥物組合物，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少一 個以上的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356位、358位、396位、409位和419位；
[16] [15]的藥物組合物，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸中 的任一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為Ile， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gln中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gln中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu ;
[17] 抗原結(jié)合分子的制備方法，其包括以下（a)~(e)的步驟： (a) 獲得對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟， (b) 獲得編碼在所述步驟（a)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因的步驟， (c) 將在所述步驟（b)中獲得的基因與編碼以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、 且271位的氨基酸為Gly的Fe區(qū)的基因有效連接的步驟， (d) 培養(yǎng)含有在所述步驟（c)中有效連接的基因的宿主細胞的步驟， (e) 從在所述步驟（d)中獲得的培養(yǎng)液分離抗原結(jié)合分子的步驟；
[18] [17]的制備方法，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少一個 以上的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、 268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、 356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位；
[19] [18]的制備方法，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的 任一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為Ile， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gln中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gln中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Met， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu ;
[20] 包含抗原結(jié)合分子的藥物組合物的制備方法，其包括以下（a)~(e)的步驟： (a) 獲得對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟， (b) 獲得編碼在所述步驟（a)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因的步驟， (c) 將在所述步驟（b)中獲得的基因與編碼以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、 且271位的氨基酸為Gly的Fe區(qū)的基因有效連接的步驟， (d) 培養(yǎng)含有在所述步驟（c)中有效連接的基因的宿主細胞的步驟， (e) 從在所述步驟（d)中獲得的培養(yǎng)液分離該抗原結(jié)合分子的步驟；
[21] [20]的制備方法，其中，所述Fe區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少一個 以上的氨基酸進一步被取代的Fe區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、 268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、 356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位；
[22] [21]的制備方法，其中，所述Fe區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的 任一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為Ile， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gln中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gln中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu ;
[23] 使抗原從血漿中消除的方法，其包括給予有效量的含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分 子的步驟：對該抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表 示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fc區(qū)；
[24] [23]的方法，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少一個以上 的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356 位、358位、396位、409位和419位；
[25] [24]的方法，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的任一 個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為Ile， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gln中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gln中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu ;
[26] [23]~[25]中任一項的方法，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為對所述抗原的結(jié)合活 性隨鈣離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[27] [26]的方法，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為結(jié)合活性以下述方式變化的抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域：在低鈣離子濃度條件下對所述抗原的結(jié)合活性比在高鈣離子濃度條件下對所述抗 原的結(jié)合活性低；
[28] [23]~[25]中任一項的方法，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為對所述抗原的結(jié)合活 性隨pH條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[29] [28]的方法，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為結(jié)合活性以下述方式變化的抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域：在pH酸性范圍條件下對所述抗原的結(jié)合活性比在pH中性范圍條件下的結(jié)合活性 低；
[30] [23]~[29]中任一項的方法，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為抗體的可變區(qū)；
[31] [23]?[30]中任一項的方法，其中，所述？(：區(qū)為在5￡〇10勵：14、15、16或17的 任一個中含有的Fc區(qū)中以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly 的Fc區(qū)；
[32] [23]~[30]中任一項的方法，其中，所述Fc區(qū)在pH酸性范圍條件下的FcRn結(jié)合 活性與SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一個中含有的Fe區(qū)的FcRn結(jié)合活性相比增強；
[33] [32]的方法，其中，所述增強的Fe區(qū)為在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一個 中含有的Fe區(qū)的氨基酸序列中選自以EU編號表示的下述位置的至少一個以上的氨基酸被 取代的 Fe 區(qū)：244 位、245 位、249 位、250 位、251 位、252 位、253 位、254 位、255 位、256 位、 257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、 293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、 332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、 380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、 427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439 位、440 位、442 位 或447位；
[34] [33]的方法，其中，所述增強的Fe區(qū)在SEQ ID NO: 14、15、16或17中含有的Fe 區(qū)的氨基酸序列中含有選自以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的至少一個以上的氨基 酸： 244位的氨基酸為Leu， 245位的氨基酸為Arg, 249位的氨基酸為Pro， 250位的氨基酸為Gln或Glu中的任一個，或者 251位的氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個， 252位的氨基酸為Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一個， 254位的氨基酸為Ser或Thr中的任一個， 255位的氨基酸為Arg、Gly、Ile或Leu中的任一個， 256 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個， 257位的氨基酸為Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一個， 258位的氨基酸為Asp， 260位的氨基酸為Ser， 262位的氨基酸為Leu， 270位的氨基酸為Lys， 272位的氨基酸為Leu或Arg中的任一個， 279 位的氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任 一個， 283 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Trp或Tyr中的任一個， 285位的氨基酸為Asn， 286位的氨基酸為Phe， 288位的氨基酸為Asn或Pro中的任一個， 293位的氨基酸為Val， 307位的氨基酸為Ala、GliuGln或Met中的任一個， 308位的氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個， 309位的氨基酸為Pro， 311 位的氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一個， 312位的氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個， 314位的氨基酸為Ala或Leu中的任一個， 316位的氨基酸為Lys， 317位的氨基酸為Pro， 318位的氨基酸為Asn或Thr中的任一個， 332 位的氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個， 339位的氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個， 341位的氨基酸為Pro， 343位的氨基酸為Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr或Tyr中的任一個， 375位的氨基酸為Arg， 376位的氨基酸為Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一個， 377位的氨基酸為Lys， 378位的氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一個， 380位的氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個， 382 位的氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個， 385 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一個， 386 位的氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個， 387位的氨基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一個， 389位的氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個， 423位的氨基酸為Asn， 427位的氨基酸為Asn， 428位的氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個， 430 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個， 431位的氨基酸為His或Asn中的任一個， 433位的氨基酸為Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro或Ser中的任一個， 434位的氨基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一個， 436 位的氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一個， 438位的氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個， 440位的氨基酸為Lys，或者， 442位的氨基酸為Lys ;
[35] [23]~[34]中任一項的方法，其中，所述抗原結(jié)合分子為抗體。
[0012] 本發(fā)明中，以下表述以彼此相同的含義使用："抗原結(jié)合分子在使抗原從血漿中消 除中的使用，其中，所述抗原結(jié)合分子包含對該抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fc 區(qū)"，和"起因于抗原的疾病的治療方法，其包括給予含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分子：對該抗 原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的氨基 酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fe區(qū)";以及"藥物組合物，其包含含有下述結(jié)構(gòu)的抗 原結(jié)合分子：對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表 示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fe區(qū)"，"抗原結(jié)合分子在制備藥 物組合物中的使用，其中，所述抗原結(jié)合分子包含對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變 化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly 的Fe區(qū)"，和"制備藥物組合物的方法，其包括使用含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分子的步驟： 對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的 氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fe區(qū)"。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013][圖1]是表示與現(xiàn)有的中和抗體相比，通過給予增強了中性pH下的Fcy受體結(jié) 合的的離子濃度依賴性地與抗原結(jié)合的抗體，可溶型抗原從血漿中消除的非限定的作用機 制的圖。
[0014][圖2]是顯示將H54/L28-IgGl或pH依賴性地與人IL-6受體結(jié)合的Fv4-IgGl給 予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0015][圖3]是顯示將pH依賴性地與人IL-6受體結(jié)合的Fv4-IgGl、沒有小鼠Fe Y R結(jié) 合的Fv4-IgGl的改變體即Fv4-IgGl-F760、增強了小鼠Fe Y R結(jié)合的Fv4-IgGl的改變體即 Fv4-IgGl-F1022或Fv4-IgGl的低巖藻糖型抗體即Fv4-IgGl-Fuc給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠 時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0016][圖 4]是顯示將含有 Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1022 和 Fv4-IgGl-F1022 的改變體即 提高了 pH酸性范圍的FcRn結(jié)合的Fv4-IgGl-F1093作為重鏈的抗原結(jié)合分子給予人FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0017][圖 5]是顯示將含有 Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1022 和 Fv4-IgGl-F1022 的改變體即 提高了 pH酸性范圍的FcRn結(jié)合的Fv4-IgGl-F1093作為重鏈的抗原結(jié)合分子給予人FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中給予的抗原結(jié)合分子的濃度變化的圖。
[0018][圖6]是顯示將Fv4-IgGl、增強了小鼠Fe YR結(jié)合的（特別是對小鼠Fe yRIIb、 小鼠Fe YRIII的結(jié)合得到增強）Fv4-IgGl的改變體即Fv4-IgGl-F1087和增強了小鼠 Fe Y R結(jié)合的（特別是對小鼠Fe Y RI、小鼠Fe Y RIV的結(jié)合得到增強）Fv4-IgGl的改變體 即Fv4-IgGl-F1182給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的 圖。
[0019][圖7]是顯示將Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1087和提高了 pH酸性范圍的FcRn結(jié)合 的 Fv4-IgGl-F1087 的改變體即 Fv4-IgGl-Fl 180、Fv4-IgGl-F1412 給予人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠 時的該小鼠血漿中給予的抗原結(jié)合分子的濃度變化的圖。
[0020][圖8]是顯示將Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1182和提高了 pH酸性范圍的FcRn結(jié)合 的Fv4-IgGl-F1182的改變體即Fv4-IgGl-F1181給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿 中給予的抗原結(jié)合分子的濃度變化的圖。
[0021][圖9]是顯示將Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1087和提高了 pH酸性范圍的FcRn結(jié)合 的 Fv4-IgGl-F1087 的改變體即 Fv4-IgGl-Fl 180、Fv4-IgGl-F1412 給予人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠 時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0022] [圖10]是顯示將Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1182和提高了 pH酸性范圍的FcRn結(jié)合 的Fv4-IgGl-F1182的改變體即Fv4-IgGl-F1181給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿 中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0023][圖11]是顯示將？￥41^61、對小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的結(jié)合增強了的 Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF44和對小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的結(jié)合進一步 增強了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF46給予正常小鼠時的該小鼠血漿中人IL-6 受體的濃度變化的圖。
[0024][圖12]是顯示將？￥41^61、對小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的結(jié)合增強了的 Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF44和對小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的結(jié)合進一步 增強了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF46給予Fe Y RIII缺失小鼠時的該小鼠血漿 中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0025][圖13]是顯示將？￥41^61、對小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的結(jié)合增強了的 Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF44和對小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的結(jié)合進一步 增強了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF46給予Fc受體Y鏈缺失小鼠時的該小鼠 血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0026][圖14]是顯示將？￥41^61、對小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的結(jié)合增強了的 Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF44和對小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的結(jié)合進一步 增強了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl-mF46給予Fe Y RIIb缺失小鼠時的該小鼠血漿 中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0027][圖15]是顯示使用具有Fe Y RIIa多態(tài)性（R/H)的來自供體的血小板的血小板聚 集測定中奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復合體的血小板聚集能力的評價結(jié)果的圖。
[0028][圖16]是顯示使用具有Fe Y RIIa多態(tài)性（H/H)的來自供體的血小板的血小板聚 集測定中奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復合體的血小板聚集能力的評價結(jié)果的圖。
[0029][圖17]是表示評價洗滌血小板的膜表面的⑶62p表達的結(jié)果的圖。用黑色涂覆 的圖形顯示與PBS反應(yīng)后加入ADP進行刺激時的結(jié)果的圖，圖形的中央未涂覆者顯示與免 疫復合體反應(yīng)后用ADP進行刺激時的結(jié)果的圖。
[0030][圖18]是表示評價洗滌血小板的膜表面的活性型整聯(lián)蛋白表達的結(jié)果的圖。用 黑色涂覆的圖形顯示與PBS反應(yīng)后加入ADP進行刺激時的結(jié)果的圖，圖形的中央未涂覆者 顯示與免疫復合體反應(yīng)后用ADP進行刺激時的結(jié)果的圖。
[0031][圖19]橫軸表示各ro變體對FeYRIIb的相對結(jié)合活性的值，縱軸表示各ro變 體對FeYRIIa R型的相對結(jié)合活性的值。將各H)變體對各FeYR的結(jié)合量的值除以作為 對照的導入改變前的抗體IL6R-F652/IL6R-L (IL6R-F652是SEQ ID NO: 61規(guī)定的含有以 EU編號表示的238位的Pro取代成Asp的改變Fc的抗體重鏈）對各FeYR的結(jié)合量的值， 進而乘以100倍，將所得的值作為各變體對各FeYR的相對結(jié)合活性的值。圖中的F652 點圖顯示IL6R-F652/IL6R-L的值。
[0032][圖20]縱軸顯示將各改變導入不具有P238D改變的GpH7-B3(SEQ ID NO: 63)/ GpL16-kO中而得的改變體對Fe Y RIIb的相對結(jié)合活性的值，橫軸顯示將各改變導入具有 P238D改變的IL6R-F652(SEQ ID NO: 61)/IL6R-L中而得的改變體對FcyRIIb的相對結(jié) 合活性的值。應(yīng)予說明，將各改變體對Fe Y RIIb的結(jié)合量的值除以導入改變前的抗體對 FcYRIIb的結(jié)合量的值，進而乘以100倍，將所得的值作為相對結(jié)合活性的值。這里，導入 到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形、導入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L 中的情形均發(fā)揮對Fe Y RIIb的結(jié)合增強效果的改變含有在區(qū)A中；在導入到不具有P238D 的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形發(fā)揮對Fe Y RIIb的結(jié)合增強效果，但在導入到具有P238D 的IL6R-F652/IL6R-L中的情形不發(fā)揮對Fe Y RIIb的結(jié)合增強效果的改變含有在區(qū)B中。
[0033][圖21]表示Fe (P238D)/Fe YRIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)。
[0034][圖22]表示相對于FeYRIIb胞外區(qū)以及Fe CH2結(jié)構(gòu)域A，通過基于C a原子間 距的最小二乘法，使Fe(P238D)/FeY RIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)與Fe(WT)/FeY RIIb胞 外區(qū)復合體的模型結(jié)構(gòu)疊合的圖。
[0035][圖23]表示對于Fe (P238D) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)與Fe (WT) / Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的模型結(jié)構(gòu)，以Fe CH2結(jié)構(gòu)域A以及Fe CH2結(jié)構(gòu)域B各自單獨通 過基于C a原子間距的最小二乘法進行疊合，并對P238D附近的詳細結(jié)構(gòu)進行比較的圖。
[0036][圖24]是示出在Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)中，在Fe CH2結(jié) 構(gòu)域A的以EU編號表示的237位的Gly的主鏈和Fe Y RIIb的160位的Tyr之間觀察到氫 鍵的圖。
[0037][圖25]是示出在Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)中，在Fe CH2結(jié) 構(gòu)域B的以EU編號表示的270位的Asp和Fe Y RIIb的131位的Arg之間觀察到靜電相互 作用的圖。
[0038][圖26]橫軸表示各2B變體對Fe Y RIIb的相對結(jié)合活性的值、縱軸表示各2B變 體對Fe Y RIIa R型的相對結(jié)合活性的值。將各2B變體對各Fe Y R的結(jié)合量的值除以作 為對照的導入改變前的抗體（以EU編號表示的238位的Pro取代成Asp的改變Fe)對各 Fe Y R的結(jié)合量的值，進而乘以100倍，將所得的值作為各2B變體對各Fe Y R的相對結(jié)合活 性的值。
[0039][圖27]是表示Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)中Fe鏈A的以EU 編號表示的233位的Glu與Fe Y RIIb胞外區(qū)的其周邊殘基的圖。
[0040][圖28]是表示Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)中Fe鏈A的以EU 編號表示的330位的Ala與Fe Y RIIb胞外區(qū)的其周邊殘基的圖。
[0041][圖29]是示出相對于Fe鏈B，通過基于Ca原子間距的最小二乘法，使 Fe (P238D) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體和Fe (WT) /Fe Y RIIIa胞外區(qū)復合體的晶體結(jié)構(gòu)疊合， Fe鏈B的以EU編號表示的271位的Pro的結(jié)構(gòu)的圖。
[0042][圖30]是通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的Fe (P208) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的 圖。就Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域各自而言，位于左側(cè)者為結(jié)構(gòu)域A，位于右側(cè)者為 結(jié)構(gòu)域B。
[0043][圖31]是將通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的Fc(P208)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合 體的結(jié)構(gòu)與Fe (WT)/Fe Y RIIa胞外區(qū)復合體的結(jié)構(gòu)（PDB碼：3RY6)，在Fe部分CH2結(jié)構(gòu) 域A中，通過基于Ca原子間距的最小二乘法進行疊合，并進行了比較的圖。圖中，用粗 線描畫的部分為Fe (P208)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的結(jié)構(gòu)，用細線描畫的部分為Fe (WT) / Fe Y RIIa胞外區(qū)復合體的結(jié)構(gòu)。應(yīng)予說明，在Fe (WT) /Fe Y RIIa胞外區(qū)復合體的結(jié)構(gòu)中，僅 描畫了 Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域A。
[0044][圖32]是顯示在Fc(P208)/Fe YRIIb胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)中，與 Fe Y RIIb的160位的Tyr在主鏈部分形成氫鍵的Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的 237位的Asp附近的詳細結(jié)構(gòu)的圖。
[0045][圖33]是顯示在Fc(P208)/Fe YRIIb胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)中，與 Fe Y RIIb的160位的Tyr在主鏈部分形成氫鍵的Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的 237位的Asp側(cè)鏈周圍的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)的圖。
[0046][圖34]是實施例10中顯示的、將Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的X射線 晶體結(jié)構(gòu)和Fe (P208)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域B 中通過基于C a原子間距的最小二乘法進行疊合，對于以EU編號表示的266位~271位的 環(huán)周邊進行比較的圖。本環(huán)中，F(xiàn)e (P208)與Fe (P238D)比較，以EU編號表示的268位具有 H268D改變，以EU編號表示的271位具有P271G改變。
[0047][圖35]是在Fe (P208)/Fe YRIIb胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)中，將Fe部分 CH2結(jié)構(gòu)域B的Ser239周邊的結(jié)構(gòu)與通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到的作為2F〇-Fc系數(shù) 的電子密度一起顯示的圖。
[0048][圖36]是將通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的Fc(P208)/FeYRIIaR胞外區(qū)復合體 的立體結(jié)構(gòu)與Fe(P208)/FeYRIIb胞外區(qū)復合體的立體結(jié)構(gòu)，通過基于Ca原子間距的最 小二乘法進行疊合，并進行了比較的圖。
[0049][圖37]是將Fe (P208)/Fe Y RIIaR胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)和Fe (P208)/ Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)，在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的237 位的Asp附近，與通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到的作為2F〇-Fc系數(shù)的電子密度一起進行 比較的圖。
[0050][圖38]是將Fe (P208)/Fe Y RIIaR胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)和Fe (P208)/ Fe Y RIIb胞外區(qū)復合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)，在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域B的以EU編號表示的237 位的Asp附近，與通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到的作為2F〇-Fc系數(shù)的電子密度一起進行 比較的圖。
[0051][圖39]是比較Gld和G4d的恒定區(qū)序列的圖；圖中，以粗框包圍的氨基酸表示Gld 和G4d中的不同氨基酸殘基位點。
[0052][圖40]是顯示正常小鼠中GA2-IgGl和GA2-F1087的血漿中抗體濃度變化的圖。
[0053][圖41]是顯示給予了 GA2-IgGl和GA2-F1087的正常小鼠中的血漿中hlgA濃度 變化的圖。
[0054][圖42]是顯示正常小鼠中GA2-IgGl和GA2-F1087的血漿中抗體濃度變化的圖。
[0055][圖 43]是給予了 278-IgGl 和 278-F1087 的 C57BL/6J 小鼠中的血漿中 hlgE (Asp6)濃度變化的圖。
[0056][圖44]是顯示將Fv4-mIgGl和對小鼠Fe Y RIIb的結(jié)合增強了的Fv4-mIgGl的改 變體即Fv4-mIgGl-MB367給予正常小鼠時的該小鼠血漿中的抗人IL-6受體小鼠抗體濃度 變化的圖。
[0057][圖45]是顯示將？￥4111861和對小鼠？(^1?1113的結(jié)合增強了的？ ￥4111861的改 變體即Fv4-mIgGl-MB367給予正常小鼠時的該小鼠血漿中的可溶型人IL-6受體濃度變化 的圖。

【具體實施方式】
[0058] 提供以下的定義和詳細說明來使本說明書中說明的本發(fā)明容易理解。
[0059] 氨某酸 本說明書中，例如，如 Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、 Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V 所表示，將 氨基酸以單字母密碼或三字母密碼或者這兩者標記。
[0060] 氨某酸的改奪 為了改變抗原結(jié)合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可適宜采用位點特異性誘變法 (Kunkel 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82，488-492))或重疊延伸 PCR等公 知的方法。通過這些公知的方法可適宜進行氨基酸的添加、缺失和/或取代。取代氨基酸 殘基是指以通過取代成其它氨基酸殘基例如就以下（a)~(c)的方面進行改變?yōu)槟康模?(a) 折疊結(jié)構(gòu)或螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域中的多肽的主鏈結(jié)構(gòu)； (b) 靶位點中的電荷或疏水性；或 (c) 側(cè)鏈的大小。
[0061] 氨基酸殘基根據(jù)其結(jié)構(gòu)所含的側(cè)鏈的特性被分類為以下的組： (1) 疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ; (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ; (3) 酸性：Asp、Glu; ⑷堿性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向的殘基：Gly、Pro;以及 (6) 芳族性：Trp、Tyr、Phe。
[0062] 這些的在各組內(nèi)的氨基酸殘基的取代稱為保守取代，而在不同組之間的氨基酸殘 基的取代稱為非保守取代。本發(fā)明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，還可以 是保守保守取代與非保守取代的組合。此外，作為取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基 酸改變方法，也可采用多種公知的方法（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35，225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (2003) 100 (11)，6353-6357)。還可適 宜使用例如：含有作為終止密碼子之一的UAG密碼子（琥珀密碼子）的互補琥珀抑制基 因tRNA上連接有非天然氨基酸而成的tRNA的無細胞翻譯系統(tǒng)（Clover Direct (Protein Express))等。
[0063] 此外，作為表示氨基酸改變的表述，可適宜采用：在表示特定位置的數(shù)字的前后使 用改變前和改變后的氨基酸的單字母密碼的表述。例如，在抗體恒定區(qū)所含的Fc區(qū)中加入 氨基酸取代時，所使用的P238D的改變表示以EU編號表示的238位的Pro取代成Asp。艮P， 數(shù)字表示以EU編號表示的氨基酸的位置，其之前記載的氨基酸的單字母密碼表示取代前 的氨基酸，其之后記載的氨基酸的單字母密碼表示取代后的氨基酸。
[0064]和 / 或 本說明書中，"和/或"用語的含義是指熟語"和/或"的前后用語的組合，含有"和"與 "或"適宜組合的所有組合。具體而言，例如，"326位、328位和/或428位的氨基酸被取代" 包括以下的氨基酸的改變的變異： (a) 326 位，（b) 328 位，（c) 428 位，（d) 326 位和 328 位，（e)326 位和 428 位，（f) 328位和428位，（g) 326位、328位和428位。
[0065]抗原 本說明書中，"抗原"只要含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的表位，則其結(jié)構(gòu)并不限于特 定的結(jié)構(gòu)。換而言之，抗原可以是無機物也可以是有機物。作為抗原，可例示如下所述的 分子：17-從、4-188、40。、6-酮-?6?13、8-異-?6?23、8-氧代-(16、41腺苷受體、433、八〇￡、 ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、 激活素 RIB ALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/ TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素（Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、 ALK-1、ALK-7、a -1-抗胰蛋白酶、a -V/P-1 拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、 APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房鈉尿因子、av/b3 整聯(lián)蛋白、Axl、b2M、 B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴細胞刺激因子（BlyS)、BACE、BACE-I、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、 BAK、Bax、BCA-I、BCAM、Bel、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BM、BLC、BL-CAM、BLK、 BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3、成骨蛋白（Osteogenin)、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-I、 BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BRK-2、 RPK-I、BMPR-II (BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、BPDE、BPDE-DNA、 BTC、補體因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗原（CEA)、 癌相關(guān)抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶 E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶0、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/ Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCLl、CCLll、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、 CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、 CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、 CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、 CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、 CD30、CD30L、CD32、CD33(p67 蛋白）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、 CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、 CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌 毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium Perfringens)毒素、CKb8-l、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、 CNTN-1、COX、C-Re t、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CLI、CX3CRI、CXCL、CXCLI、CXCL2、 CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、 CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗 原、0八隊00：、0^?3、0(：-516隊補體抑制因子（衰變促進因子）、脫（1-3)-16?-1(腦16?-1)、 Dhh、地高辛、DNAM-I、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-Al、EDA-A2、EDAR、EGF、 EGFR(ErbB-I)、EMA、EMMPRIN、ENA、內(nèi)皮素受體、腦啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin 1、EpCAM、 Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-選擇素、ET-1、因子 Ila、因子 VII、因子 VIIIc、因子 IX、 成纖維細胞活化蛋白（FAP)、Fas、FcRl、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、 FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、？1、？11?、？1卜3、？1卜4、促卵胞激素、0乂乂乂(：趨化因子、？201、？202、 FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、⑶2、⑶3、⑶F、 ⑶F-l、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5(BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6(BMP-13、CDMP-2)、⑶F-7(BMP-12、 CDMP-3)、⑶F-8 (Myostatin，肌肉生長抑制素）、⑶F-9、⑶F-15 (MIC-I)、⑶NF、⑶NF、GFAP、 GFRa-1、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/ 111&)、61^3?、8?130、 8?72、61?0、生長激素釋放因子、半抗原（咿-。&?或??？-。&?)、冊46卩、 HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子（HGF)、H印B gpl20、乙醜肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB_2)、Her3(ErbB_3)、Her4(ErbB_4)、單純皰疫病 毒（HSV) gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原（High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMW-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gp 120 V3 環(huán)、 HLA、HLA-DR、HM1. 24、HMFG ?￡]\1、111?、肚1^、人心肌球蛋白、人巨細胞病毒0〇^)、人生長激素 (HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-I、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA 受體、IgE、IGF、 IGF 結(jié)合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-I、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、 IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、 干擾素（INF)-a、INF-P、INF-Y、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素樣生長 因子1、整聯(lián)蛋白a2、整聯(lián)蛋白a3、整聯(lián)蛋白a4、整聯(lián)蛋白a4/01、整聯(lián)蛋白a4/37、 整聯(lián)蛋白a5(aV)、整聯(lián)蛋白a5/01、整聯(lián)蛋白a5/P3、整聯(lián)蛋白a6、整聯(lián)蛋白31、 整聯(lián)蛋白P 2、干擾素Y、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、 激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶L1、激肽釋放 酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質(zhì)形成細胞生長因子（KGF)、層連蛋白5、 LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛伏型 TGF-1、潛伏型 TGF-I bpl、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 相關(guān)抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選 擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黃體激素、淋巴毒素@受體、Mac-1、MAdCAM、 MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金屬蛋白酶、MGDF 受體、MGMT、 MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-I-a、MK、MMACl、MMP、MMP-I、MMP-10、MMP-II、MMP-12、 MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、 粘蛋白（Mucl)、MUC18、繆勒管抑制物質(zhì)、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C 粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶、神經(jīng)營養(yǎng)素-3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4或神經(jīng)營養(yǎng)素-6、Neurturin、神 經(jīng)生長因子（NGF)、NGFR、NGF- P、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGGI、OPG、0PN、 OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr、甲狀旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣 黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤 堿性磷酸酶（PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰島素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺 特異性膜抗原（PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素 A鏈、松弛素B鏈、腎素、呼吸道合胞體病毒（RSV)F、RSV Fgp、Ret、類風濕因子、RLIP76、 RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、 SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤 相關(guān)糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體（例如，T細胞受體a / p )、TdT、TECK、TEM1、 TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸 PLAP 樣堿性磷酸酶、TfR、TGF、TGF- a、TGF- P、TGF- P 泛特 異性（TGF-P Pan Specific)、TGF-P RI (ALK-5)、TGF-P RII、TGF-P RIIb、TGF-P RIII、 TGF-P 1、TGF-P 2、TGF-P 3、TGF-P 4、TGF-P 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲狀腺激素、Tie、 TMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-a、TNF-a @、TNF-3 2、TNFc、 TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL Rl Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、 TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcRl、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、 TRUNDD)、TNFRSF1IA(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF1IB(OPG 0CIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、 TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD 120b、p75-80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4 (0X40 ACT35、TXGPl R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-I、APTl、CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、 TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRHl), TNFRSF25 (DR3 Ap〇-3, LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體、TL2)、TNFSFl I (TRANCE/RANK 配 體 ODF、OPG 配體）、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體）、TNFSF13 (APRIL TALL2)、 TNFSF13B(BAFF BLYS、TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、 TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFlA(TNF-a 黏附素 (Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、 TNFSF4(0X40 配體 gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40 配體 CD154、gp39、HIGM1、MD3、TRAP)、 TNFSF6 (Fas 配體 Apo-I 配體、APTl 配體）、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9(4-1BB 配體 CD137 配體）、TP-I、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-Rl、 TRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關(guān)抗原 CA125、腫瘤 相關(guān)抗原表達病毒Y相關(guān)碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-I、 VECAD、VE-鈣黏蛋白、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-I (flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、 VEGI、VM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整聯(lián)蛋白、馮維勒布蘭德因子、WIF-1、WNT1、 WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、 WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNTlI、WNT16、XCLl、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP、XPD、 HMGBl、IgA、A P、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、 氧化LDL、PCSK9、激肽釋放酶原、RON、TMEM16F、S0D1、嗜鉻粒蛋白A、嗜鉻粒蛋白B、tau、 VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、NavL 1、NavL 2、NavL 3、NavL 4、NavL 5、NavL 6、 NavL 7、NavL 8、NavL 9、EPCR、Cl、Clq、Clr、Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、 C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、備解素、殼硬蛋白（sclerostin)、血纖 蛋白原、血纖蛋白、凝血酶原、凝血酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VII、因子Vila、因子 VIII、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子Xlla、 因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓調(diào)節(jié)蛋白、TAPI、tPA、纖溶酶原、纖溶 酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配體蛋白聚糖-1、多配體蛋白聚糖-2、多配體蛋白聚糖-3、多配 體蛋白聚糖-4、LPA、SlP以及用于激素和生長因子的受體。
[0066] 上述抗原的例示中也記載了受體，這些受體在血漿等生物流體中以可溶型存在 時，可與本發(fā)明的抗原結(jié)合分子形成復合體，所以，只要上述列舉的受體以可溶型在血漿等 生物流體中存在，就可作為與本發(fā)明的抗原結(jié)合分子結(jié)合而形成本發(fā)明的復合體的抗原使 用。作為這樣的可溶型受體的一個非限定的方案，可例示出例如Mullberg等（J. Immunol. (1994) 152 (10)，4958-4968)中記載的可溶型 IL-6R 即由 SEQ IDNO: 1 表示的 IL-6R 多 肽序列中1-357位氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
[0067] 上述抗原的例示中也記載了可溶型抗原，對該抗原所存在的溶液沒有限定，該可 溶型抗原可存在于生物流體，即充斥于機體內(nèi)的脈管或組織/細胞間的所有流體。作為一 個非限定的方案，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子所結(jié)合的抗原可存在于細胞外液。細胞外液是脊 椎動物中血漿、組織間液體、淋巴液、密實的結(jié)締組織、腦脊液、髓液、穿刺液或關(guān)節(jié)液等骨 和軟骨中的成分、肺泡液（支氣管肺泡灌洗液）、腹水、胸膜液、心包液、囊內(nèi)液或眼房水（房 水）等細胞透過液（作為細胞的主動運輸/分泌活動的結(jié)果而產(chǎn)生的各種腺腔內(nèi)液體和消 化道腔等其他體腔內(nèi)液體）的統(tǒng)稱。
[0068] 表位 表示存在于抗原中的抗原決定簇的表位，意指本說明書中公開的抗原結(jié)合分子中的抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的抗原上的位點。所以，例如表位可通過其結(jié)構(gòu)來定義。此外，也可以 通過相對于識別該表位的抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合活性來定義該表位。抗原為肽或者多 肽時,還可以通過構(gòu)成表位的氨基酸殘基來規(guī)定表位。此外,表位為糖鏈時，也可以通過特 定的糖鏈結(jié)構(gòu)來規(guī)定表位。
[0069] 線性表位是下述表位，其含有氨基酸一級序列被識別的表位。線性表位在固有序 列中典型地含有至少3個氨基酸，和最普通地含有至少5個、例如約8至約10個、6至20個 氨基酸。
[0070] 與線性表位相對地，立體結(jié)構(gòu)表位是這樣的表位，其中，含有表位的氨基酸的一級 序列并非是被識別表位的單一規(guī)定成分（例如，氨基酸的一級序列不需要被規(guī)定表位的抗 體所識別的表位）。立體結(jié)構(gòu)表位相對于線性表位可以含有增大數(shù)目的氨基酸。關(guān)于立體 結(jié)構(gòu)表位的識別，抗體識別肽或蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。例如，蛋白質(zhì)分子折疊形成三維結(jié)構(gòu) 時，形成立體結(jié)構(gòu)表位的某氨基酸和/或多肽主鏈變得并排，使得抗體可以識別表位。確定 表位的立體結(jié)構(gòu)的方法包括例如：X射線晶體學、二維核磁共振分光學以及位點特異性旋 轉(zhuǎn)標記和電子順磁共振分光學，但并非限定于此。例如，參照Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第 66卷、Morris(編）。
[0071] 結(jié)合活件 下述例示了通過含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子來確認對表 位的結(jié)合的方法，但通過含有針對IL-6R以外的抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分 子來確認對表位的結(jié)合的方法也可以基于下述例示而適宜實施。
[0072] 例如，含有針對IL-6R抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子識別存在于IL-6R分 子中的線性表位，可通過如下所示操作來確認。為了上述目的，合成了含有構(gòu)成IL-6R的胞 外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的線性肽。該肽可化學地合成?；蛘撸梢岳糜蒘EQ ID NO: 2表示 的IL-6R的cDNA中編碼相當于胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的區(qū)域，通過基因步驟技術(shù)得到。 其次，對含有構(gòu)成胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的線性肽和含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合活性進行評價。例如，通過以固定化線性肽作為抗原的ELISA， 可以評價該抗原結(jié)合分子對該肽的結(jié)合活性?；蛘?，基于該抗原結(jié)合分子對IL-6R表達細 胞的結(jié)合中的、線性肽造成的抑制水平，也可以明確對線性肽的結(jié)合活性。通過這些試驗， 可以明確該抗原結(jié)合分子對線性肽的結(jié)合活性。
[0073] 此外，含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子識別立體結(jié)構(gòu)表 位，這可如下進行確認。為了上述目的，制備了表達IL-6R的細胞?？膳e出：含有針對IL-6R 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子在與IL-6R表達細胞接觸時強烈地與該細胞結(jié)合， 但該抗原結(jié)合分子與經(jīng)固定化的含有構(gòu)成IL-6R胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的線性肽實質(zhì) 上不結(jié)合的情形等。這里，實質(zhì)上不結(jié)合是指，對人IL-6R表達細胞的結(jié)合活性的80%以下、 通常50%以下、優(yōu)選30%以下、特別優(yōu)選15%以下的結(jié)合活性。
[0074] 作為測定對含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的IL-6R表達 細胞的結(jié)合活性的方法，可舉出例如：Antibodies A Laboratory Manual記載的方法（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)。S卩，可通過 以IL-6R表達細胞為抗原的ELISA或FACS (熒光活化細胞分選（fluorescence activated cell sorting))的原理來進行評價。
[0075] 在ELISA形式中，對含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的 IL-6R表達細胞的結(jié)合活性，通過比較由酶反應(yīng)生成的信號水平而定量地進行評價。即，將 被測多肽締合物添加至固定有IL-6R表達細胞的ELISA板，利用識別被測抗原結(jié)合分子的 酶標記抗體檢測與細胞結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子?；蛘咴贔ACS中，制作被測抗原結(jié)合分子 的稀釋系列，確定相對于IL-6R表達細胞的抗體結(jié)合效價（titer)，由此可以比較被測抗原 結(jié)合分子對IL-6R表達細胞的結(jié)合活性。
[0076] 被測抗原結(jié)合分子與懸浮于緩沖液等中的細胞表面上表達的抗原的結(jié)合可以通 過流式細胞儀檢測。作為流式細胞儀，已知例如如下的裝置： FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM (均為 BD Biosciences 公司的商品名） EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為 Beckman Coulter 公司的商品名）。
[0077] 例如，作為含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活 性的優(yōu)選測定方法的一例，可舉出以下方法。首先，將表達IL-6R的細胞與被測抗原結(jié)合分 子反應(yīng)，將其用識別被測抗原結(jié)合分子的經(jīng)FITC標記的二次抗體染色。將被測抗原結(jié)合分 子用適宜的優(yōu)選緩沖液稀釋，由此將該抗原結(jié)合分子制備為所期望的濃度來使用。例如，能 夠以IOy g/ml至lOng/ml之間的任意濃度使用。接著，通過FACSCalibur (BD公司）測定 熒光強度和細胞數(shù)?？贵w對該細胞的結(jié)合量被反映為使用CELL QUEST Software (BD公司） 進行分析而得的熒光強度即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，能夠測定由被測抗原 結(jié)合分子的結(jié)合量表示的被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合活性。
[0078] 含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子與某抗原結(jié)合分子共有 表位，這可通過兩者對相同表位的競爭來確認?？乖Y(jié)合分子間的競爭通過交叉阻斷試驗 等來檢測。例如競爭ELISA試驗是優(yōu)選的交叉阻斷試驗。
[0079] 具體而言，在交叉阻斷試驗中，包被微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候選競爭 抗原結(jié)合分子的存在下或不存在下經(jīng)過預培養(yǎng)后，添加被測抗原結(jié)合分子。與孔中的IL-6R 蛋白結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子的量與競爭結(jié)合相同表位的候選競爭抗原結(jié)合分子的結(jié)合 能力間接地相關(guān)。即，競爭抗原結(jié)合分子對相同表位的親和性越大，則被測抗原結(jié)合分子對 包被有IL-6R蛋白的孔的結(jié)合活性越降低。
[0080] 經(jīng)由IL-6R蛋白而與孔結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子的量可以通過預先標記抗原結(jié) 合分子來容易地測定。例如，經(jīng)生物素標記的抗原結(jié)合分子通過使用親和素過氧化酶結(jié)合 物和合適的底物來測定。利用過氧化酶等酶標記的交叉阻斷試驗特別被稱為競爭ELISA試 驗?？乖Y(jié)合分子能夠用可檢測或可測定的其它標記物質(zhì)進行標記。具體而言，公知的是 放射標記或突光標記等。
[0081] 與在候選競爭抗原結(jié)合分子的不存在下實施的對照試驗中得到的結(jié)合活性進行 比較，競爭抗原結(jié)合分子只要可以阻斷至少20%、優(yōu)選至少2(T50%、進一步優(yōu)選至少50%的 含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合，則該被測抗原結(jié)合分子是 與競爭抗原結(jié)合分子實質(zhì)上結(jié)合于相同表位或者競爭結(jié)合于相同的表位的抗原結(jié)合分子。
[0082] 在鑒定含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子所結(jié)合的表位的 結(jié)構(gòu)時，被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子共有表位，這可通過比較兩者的抗原結(jié)合 分子對在構(gòu)成該表位的肽中導入氨基酸突變而得的肽的結(jié)合活性來進行評價。
[0083] 作為這種測定結(jié)合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通過比較被測抗原 結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子對導入了突變的線性肽的結(jié)合活性來測定。作為ELISA以外 的方法，通過使被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子流過該柱后，對洗脫液中洗脫的抗 原結(jié)合分子進行定量，也可以測定對結(jié)合于柱的該突變肽的結(jié)合活性。使突變肽作為例如 與GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0084] 此外，鑒定的表位為立體表位時，被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子共有表 位，這可通過以下方法來評價。首先，制備表達IL-6R的細胞和表達在表位中導入了突變的 IL-6R的細胞。將這些細胞懸浮于PBS等適當?shù)木彌_液中，向所得細胞懸浮液中添加被測抗 原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子。其次，用合適的緩沖液洗滌，向所得細胞懸浮液中添加能 夠識別被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子的經(jīng)FITC標記的抗體。被標記抗體染色的 細胞的熒光強度和細胞數(shù)通過FACSCalibur (BD公司）來測定。被測抗原結(jié)合分子和對照抗 原結(jié)合分子的濃度通過合適的緩沖液適當稀釋，由此可以制備為所期望的濃度來使用。例 如，能夠以10 U g/ml至lOng/ml之間的任意濃度使用。標記抗體對該細胞的結(jié)合量被反映 為使用CELL QUEST S〇ftware(BD公司）進行分析而得的熒光強度即幾何平均值。即，通過 得到該幾何平均值，可以測定由標記抗體的結(jié)合量表示的被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié) 合分子的結(jié)合活性。
[0085] 本方法中，例如"實質(zhì)上不與突變IL-6R表達細胞結(jié)合"可通過以下方法判斷。首 先，用標記抗體染色與表達突變IL-6R的細胞結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分 子。接著，檢測細胞的熒光強度。熒光檢測中使用作為流式細胞儀的FACSCalibur時，所得 的熒光強度可以使用CELL QUEST Software進行分析。由多肽締合物存在下和不存在下的 幾何平均值，根據(jù)下述的計算式算出該比較值（AGeo-Mean)，由此可以求出抗原結(jié)合分子 的結(jié)合所帶來的熒光強度的增加比例。
[0086] A Geo-Mean = Geo-Mean (多肽締合物存在下）/Geo-Mean (多肽締合物不存在下） 將通過分析得到的、反映被測抗原結(jié)合分子對突變IL-6R表達細胞的結(jié)合量的幾何平 均比較值（突變IL-6R分子AGeo-Mean值）與反映被測抗原結(jié)合分子對IL-6R表達細胞 的結(jié)合量的AGeo-Mean比較值進行比較。此時，計算相對于突變IL-6R表達細胞和IL-6R 表達細胞的AGeo-Mean比較值時使用的被測抗原結(jié)合分子的濃度特別優(yōu)選制備為相互相 同或者實質(zhì)上相同的濃度。預先確定了識別IL-6R中的表位的抗原結(jié)合分子被用作對照抗 原結(jié)合分子。
[0087] 被測抗原結(jié)合分子相對于突變IL-6R表達細胞的AGeo-Mean比較值只要小于被 測抗原結(jié)合分子相對于IL-6R表達細胞的AGeo-Mean比較值的至少80%、優(yōu)選50%、進一步 優(yōu)選30%、特別優(yōu)選15%，則認為"實質(zhì)上不與突變IL-6R表達細胞結(jié)合"。求出Geo-Mean值 (幾何平均）的計算式記載于 CELL QUEST Software User's Guide (BD biosciences 公 司）。通過對比較值進行比較，只要是能夠?qū)⑵鋵嵸|(zhì)上視為相同的程度，則能夠評價被測抗 原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子的表位相同。
[0088] 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 本說明書中，"抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域"只要與目標抗原結(jié)合，則可以使用任意結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 域。作為這類結(jié)構(gòu)域的實例，可優(yōu)選舉出例如：抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)、機體內(nèi)存在 的細胞膜蛋白Avimer中所含的35個氨基酸左右的被稱為A結(jié)構(gòu)域的組件（國際公開 W02004/044011、W02005/040229)、含有與在細胞膜表達的糖蛋白纖連蛋白中的蛋白結(jié)合結(jié) 構(gòu)域10Fn3結(jié)構(gòu)域的Adnectin (國際公開W02002/032925)、以構(gòu)成蛋白A的含有58個氨基 酸的3個螺旋束（bundle)的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域為支架的Affibody (國際公開W01995/001937)、 具有含33個氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角和2個反向平行螺旋以及環(huán)的亞基重復重疊而成的結(jié)構(gòu)的 錨蛋白重復序列（ankyrin repeat :AR)的分子表面露出的區(qū)域DARPins (Designed Ankyrin R印eat proteins)(國際公開W02002/020565)、支持嗜中性粒細胞明膠酶結(jié)合脂質(zhì)運載蛋 白（neutrophil gelatinase-associated Iipocalin(NGAL))等脂質(zhì)運載蛋白分子中高度 保守的8個反向平行鏈在中央方向扭曲的桶結(jié)構(gòu)的單側(cè)的4個環(huán)區(qū)即Anticalin等（國 際公開W02003/029462)、作為七鰓鰻、八目鰻等無顎類的獲得免疫系統(tǒng)且不具有免疫球蛋 白結(jié)構(gòu)的可變性淋巴細胞受體（variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸殘基 的重復（leucine-rich-repeat(LRR))組件重復重疊而成的馬蹄鐵形的結(jié)構(gòu)內(nèi)部的平行型 片結(jié)構(gòu)的凹陷區(qū)域（國際公開W02008/016854)。作為本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選實 例，可舉出含有抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。作為這種抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的實例，優(yōu)選可舉出"scFv(單鏈Fv) "、"單鏈抗體"、"Fv"、"scFv2(單鏈Fv2) "、"Fab"或 "F(ab'）2" 等。
[0089] 本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與相同的表位結(jié)合。這里，相同 的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中。或者，本發(fā)明的 抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與相互不同的表位結(jié)合。這里，不同的表位可以存 在于例如含有SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中。
[0090] 特異件 與本發(fā)明提供的抗原結(jié)合分子對抗原的結(jié)合相關(guān)的特異性是指：特異性地結(jié)合的分子 的一方的分子對于其一個或多個結(jié)合對象分子以外的分子不顯示實質(zhì)性結(jié)合的狀態(tài)。此 處，不顯示實質(zhì)性結(jié)合是指，如前述結(jié)合活性項目中所記載，對該對象分子以外的分子顯示 對該對象分子的結(jié)合活性的80%以下、通常50%以下、優(yōu)選30%以下、特別優(yōu)選15%以下的 結(jié)合活性。此外，也可以用于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)δ晨乖兴亩鄠€表位中特定的表位為 特異性的情形。此外，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的表位含有在多個不同的抗原中時，具有該抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子可以與含有該表位的各種抗原結(jié)合。
[0091] 中和活件 本發(fā)明的一個非限定的方案中提供包含下述抗原結(jié)合分子作為有效成分的藥物組 合物：包含（i)對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、（ii)對 Fe YRIIb具有選擇性結(jié)合活性的Fe Y結(jié)合結(jié)構(gòu)域和（iii)在pH酸性范圍條件下具有FcRn 結(jié)合活性的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有對該抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。一般地，中和活 性是指抑制病毒或毒素等對細胞具有生物學活性的配體的該生物學活性的活性。即，具有 中和活性的物質(zhì)是指與該配體或該配體所結(jié)合的受體結(jié)合而抑制該配體與受體的結(jié)合的 物質(zhì)。與配體的結(jié)合因中和活性而受到阻斷的受體不能夠發(fā)揮該受體介導的生物學活性。 在抗原結(jié)合分子為抗體時，這種具有中和活性的抗體一般稱為中和抗體。某被測物質(zhì)的中 和活性可通過在該被測物質(zhì)存在或不存在下的條件之間比較配體存在下的生物學活性來 測定。
[0092] 例如，被認為是IL-6R的主要配體的物質(zhì)，可適宜舉出：由SEQ ID NO: 3表示的 IL-6。其氨基末端形成胞外結(jié)構(gòu)域的I型膜蛋白IL-6受體與因IL-6誘導而二聚化的gpl30 受體一起形成異四聚體（Heinrich等人（Biochem. J. (1998) 334，297-314))。由于該 異四聚體的形成，與gpl30受體締合的Jak發(fā)生活化。Jak進行自磷酸化和受體的磷酸化。 受體和Jak的磷酸化位點對于屬于Stat3這樣的具有SH2的Stat家族的分子、MP激酶、 PI3/Akt、其它具有SH2的蛋白或銜接頭發(fā)揮結(jié)合位點的功能。接著，與gpl30受體結(jié)合的 Stat通過Jak進行磷酸化。磷酸化的Stat形成二聚體而轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)節(jié)祀基因的轉(zhuǎn)錄。 Jak或Stat也可以經(jīng)由其它類的受體而參與信號級聯(lián)。不受控制的IL-6的信號級聯(lián)在自 身免疫疾病的病態(tài)或炎癥、多發(fā)性骨髓瘤或前列腺癌等的癌癥中被觀察到?？勺鳛榘┗?發(fā)揮作用的Stat3在多種癌癥中穩(wěn)態(tài)性活化。在前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤中，源自IL-6 受體的信號級聯(lián)和源自上皮生長因子受體（EGFR)家族成員的信號級聯(lián)之間存在交互作用 (Ishikawa 等人（J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2)，55-66))。
[0093] 這樣的細胞內(nèi)的信號級聯(lián)根據(jù)每一細胞種類而不同，因此可對作為目標的每一靶 細胞設(shè)定適宜的靶分子，不限定于上述的因子。通過測定機體內(nèi)信號的活化，可以評價中和 活性。此外，以對存在于機體內(nèi)信號級聯(lián)下游的靶基因的轉(zhuǎn)錄誘導作用作為指標，也可以 檢測機體內(nèi)信號的活化。靶基因的轉(zhuǎn)錄活性變化可以通過報道基因測定的原理進行檢測。 具體而言，將GFP(綠色熒光蛋白）或螢光素酶等報道基因配置在靶基因的轉(zhuǎn)錄因子或啟 動子區(qū)的下游，通過測定該報道基因活性，可以將轉(zhuǎn)錄活性變化作為報道基因活性進行測 定。機體內(nèi)信號的活化的測定試劑盒可適宜使用市售的試劑盒（例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等）。
[0094] 進而，通常作為測定作用于在促進細胞生長的方向上發(fā)揮功能的信號級聯(lián)的EGF 受體家族等的受體配體的中和活性的方法，可以通過測定作為靶標的細胞的生長活性，來 評價抗原結(jié)合分子的中和活性。例如，作為評價或測定對于其生長受例如HB-EGF等EGF 家族的生長因子促進的細胞生長的、基于抗HB-EGF抗體的中和活性的抑制效果的方法，可 適宜使用以下的方法。作為在試管內(nèi)評價或測定該細胞生長抑制活性的方法，可以使用測 定活細胞攝入培養(yǎng)基中添加的[3H]標記的胸苷作為DNA復制能力指標的方法。作為更簡 便的方法，可以使用在顯微鏡下計測將臺盼藍等染料排除到細胞外的能力的染料排除法或 MTT法。后者利用了：活細胞具有將四氮唑鹽MTT (3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯 基溴化四唑）轉(zhuǎn)換為藍色的甲（formazan)產(chǎn)物的能力。更具體而言，向被測細胞的培養(yǎng) 液中添加配體和被測抗體，經(jīng)過一定時間后，將MTT溶液加入培養(yǎng)液中靜置一定時間，由此 MTT被攝入到細胞內(nèi)。其結(jié)果，黃色化合物MTT由于細胞內(nèi)的線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶而 轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色化合物。使該藍色生成物溶解、顯色后，測定其吸光度，以此作為活細胞數(shù)的指 標。除了 MTT之外，還可適宜使用市售的（nacalai tesque等）MTS、XTT、WST-1、WST-8等 試劑。在活性測定時，將作為對照抗體的與抗HB-EGF抗體具有相同同種型的抗體且不具有 該細胞生長抑制活性的結(jié)合抗體、和抗HB-EGF抗體同樣進行使用，抗HB-EGF抗體顯示較對 照抗體強的細胞生長抑制活性，由此可以判定活性。
[0095] 作為用于評價活性的細胞，可適宜使用例如作為其生長受HB-EGF促進的細胞的、 卵巢癌細胞RMG-I細胞株或者用連接有編碼人EGFR胞外結(jié)構(gòu)域與小鼠G-CSF受體胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域框內(nèi)融合而成的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因以表達的載體轉(zhuǎn)化的小鼠Ba/F3細胞 等。如此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過適宜選擇用于評價活性的細胞，來用于上述的細胞生長 活性的測定。
[0096] 抗體 本說明書中，抗體是指天然的免疫球蛋白或者通過部分或完全合成制備得到的免疫球 蛋白。抗體可從天然存在其的血漿或血清等天然資源或產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞的培養(yǎng)上 清液中分離得到，或者通過使用基因重組等方法而部分或完全合成。作為抗體的實例，優(yōu) 選可舉出：免疫球蛋白的同種型和這些同種型的亞類。作為人的免疫球蛋白，已知有IgGU 1 §62、1§63、1§64、1§41、1§42、1 §0、1§￡、1§11這9種類型（同種型）。本發(fā)明的抗體中可含 有這些同種型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。作為人IgGU人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定區(qū)， 基因多態(tài)性所致的多個的同種異型序列記載于Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242中，本發(fā)明中可以是其中的任一個序列。特別是 作為人IgGl的序列，EU編號356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。此外，作為 人Ig K恒定區(qū)和人Ig X恒定區(qū)，基因多態(tài)性所致的多個的同種異型序列記載于Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242 中，本發(fā)明中可 以是其中的任一個序列。
[0097] 制備具有所期望結(jié)合活性的抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。以下例 示與IL-6R結(jié)合的抗體（抗IL-6R抗體）的制作方法。與IL-6R以外的抗原結(jié)合的抗體也 可以根據(jù)下述例示而適宜制作。
[0098] 抗IL-6R抗體可以使用公知的方法以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。作為抗 IL-6R抗體，可優(yōu)選制作來源于哺乳動物的單克隆抗體。來源于哺乳動物的單克隆抗體含 有：由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體和利用基因步驟技術(shù)通過用含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化 的宿主細胞產(chǎn)生的單克隆抗體等。應(yīng)予說明，本申請發(fā)明的單克隆抗體包括"人源化抗體" 和"嵌合抗體"。
[0099]產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用公知技術(shù)，例如如下所示的方法來制作。 艮P，使用IL-6R蛋白作為敏化抗原，按照通常的免疫方法來免疫哺乳動物。通過通常的細胞 融合法，將所得免疫細胞與公知的親本細胞融合。其次，通過通常的篩選方法篩選單克隆抗 體產(chǎn)生細胞，由此可以選擇出產(chǎn)生抗IL-6R抗體的雜交瘤。
[0100] 具體而言，單克隆抗體的制作例如如下所示地進行。首先，表達其核苷酸序列公開 在SEQ ID NO: 2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO: 1表示的IL-6R蛋白，其用作 敏化抗原用于抗體制備。即，將編碼IL-6R的基因序列插入公知的表達載體，由此轉(zhuǎn)化適 當?shù)乃拗骷毎?。以公知的方法從該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中純化所期望的人IL-6R蛋 白。為了從培養(yǎng)上清液中獲得可溶型的IL-6R，代替由SEQ ID NO: 1表示的IL-6R蛋白，表 達了例如，如 Mullberg 等（J. Immunol. (1994) 152 (10)，4958-4968)所記載的可溶型 IL-6R、即SEQ ID NO: 1表示的IL-6R多肽序列中、含有第1位至357位氨基酸的蛋白。此 夕卜，純化的天然IL-6R蛋白也可以同樣地用作敏化抗原。
[0101] 作為用于免疫哺乳動物的敏化抗原，可使用該純化IL-6R蛋白。此外，IL-6R的部 分肽也可以用作敏化抗原。此時，該部分肽也可以根據(jù)人IL-6R的氨基酸序列通過化學合 成獲得。此外，也可以通過將IL-6R基因的一部分整合至表達載體并進行表達來獲得。進 而，還可以使用蛋白質(zhì)分解酶分解IL-6R蛋白來獲得，用作部分肽的IL-6R肽的區(qū)域和大小 并不特別限于特定的方案。對于優(yōu)選的區(qū)域，可以從SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中相當 于第20-357位氨基酸的氨基酸序列中選擇任意的序列。構(gòu)成作為敏化抗原的肽的氨基酸 的數(shù)目優(yōu)選為至少5個以上、例如6個以上、或7個以上。更具體而言，可以將8~50、優(yōu)選 1(T30個殘基的肽用作敏化抗原。
[0102] 此外，也可以將IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽與不同的多肽進行融合而得 的融合蛋白用作敏化抗原。為了制備用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以優(yōu)選利用抗體 的Fc片段或肽標簽等。表達融合蛋白的載體可如下制作：將編碼所期望的兩種或兩種以 上的多肽片段的基因框內(nèi)融合，將該融合基因如前所述地插入表達載體。融合蛋白的制 作方法記載于 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed.，9. 47-9. 58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. press)。用作敏化抗原的 IL-6R 的獲得方法和使用它的免疫方法也具體記載于國際公開W02003/000883、W02004/022754、 W02006/006693 等中。
[0103] 作為用該敏化抗原免疫的哺乳動物，并不限定于特定的動物，優(yōu)選考慮與細胞融 合中使用的親本細胞的相容性來選擇。通常適宜使用嚙齒類的動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠 或兔、猴等。
[0104] 按照公知的方法將上述動物用敏化抗原免疫。例如，作為通常的方法，通過將敏化 抗原注射給予至哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下來實施免疫。具體而言，將用PBS (磷酸緩沖鹽水 (Phosphate-Buffered Saline))或生理鹽水等以適當稀釋倍率稀釋的敏化抗原根據(jù)需要 與通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑混合，在乳化后將該敏化抗原對哺乳動物每4至21天給 予數(shù)次。此外，敏化抗原免疫時可以使用適當?shù)妮d體。特別是將分子量小的部分肽用作敏 化抗原時，有時期望將與白蛋白、匙孔血藍蛋白等載體蛋白質(zhì)結(jié)合的該敏化抗原肽進行 免疫。
[0105] 此外，產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤也可通過使用DNA免疫如下所示來制作。DNA免疫 是指下述免疫方法：被給予了以能在免疫動物中表達編碼抗原蛋白的基因的方式構(gòu)建的載 體DNA的該免疫動物中，敏化抗原在該免疫動物的機體內(nèi)表達，由此賦予免疫刺激。與將蛋 白質(zhì)抗原給予免疫動物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下優(yōu)越性： -能夠維持如IL-6R的膜蛋白的結(jié)構(gòu)而賦予免疫刺激 -無需純化免疫抗原。
[0106] 為了通過DNA免疫獲得本發(fā)明的單克隆抗體，首先，對免疫動物給予表達IL-6R蛋 白的DNA。編碼IL-6R的DNA可通過PCR等公知方法合成。將所得DNA插入適當?shù)谋磉_載 體，給予免疫動物。作為表達載體，可優(yōu)選利用例如PCDNA3.1等市售的表達載體。作為將 載體給予機體的方法，可采用通常所使用的方法。例如，將吸附有表達載體的金顆粒用基因 槍導入免疫動物個體的細胞內(nèi)，由此進行DNA免疫。進而，識別IL-6R的抗體的制作也可以 采用國際公開W02003/104453中記載的方法來制作。
[0107] 如此將哺乳動物免疫，確認到血清中與IL-6R結(jié)合的抗體效價的上升后，從哺乳 動物采集免疫細胞，進行細胞融合。作為優(yōu)選的免疫細胞，特別可使用脾細胞。
[0108] 作為與前述免疫細胞融合的細胞，可使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞優(yōu) 選具備用于篩選的適當?shù)倪x擇標記物。選擇標記物是指賦予細胞能夠在特定培養(yǎng)條件下存 活（或死亡）的性質(zhì)。選擇標記物中，公知的是次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶缺 失（以下簡稱為HGPRT缺失）或胸苷激酶缺失（以下簡稱為TK缺失）等。具有HGPRT、TK 缺失的細胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性（以下簡稱為HAT敏感性）。HAT敏感 性的細胞不能在HAT選擇培養(yǎng)基中進行DNA合成而會死亡，但若與正常細胞發(fā)生融合，則可 利用正常細胞的補救途徑繼續(xù)DNA的合成，因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也會生長。
[0109] HGPRT缺失、TK缺失的細胞各自可通過含有6-硫代鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤（以下 簡稱為8AG)或5'溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基來選擇。DNA中整合有這些嘧啶類似物的正常細胞 會死亡。而無法整合這些嘧啶類似物的缺乏上述酶的細胞則可以在選擇培養(yǎng)基中存活。此 夕卜，被稱為G418抗性的選擇標記物可通過新霉素抗性基因賦予針對2-脫氧鏈霉胺系抗生 素（慶大霉素類似物）的抗性。細胞融合中優(yōu)選的各種骨髓瘤細胞是公知的。
[0110] 作為這類骨髓瘤細胞，可適宜使用例如P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550) > P3x63Ag8U. I (Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7)，511-519)、 MPC-II(CelI(1976)8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature(1978)276 (5685)，269-270)、FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2)，1-21)、S194/5.XX0.BU. I (J. Exp. Med. (1978) 148 (1)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0111] 基本上，根據(jù)公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法（Methods Enzymol. (1981)73，3-46)等，進行前述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。
[0112] 更具體而言，例如，可以在細胞融合促進劑的存在下，在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施 前述細胞融合。作為融合促進劑，使用例如聚乙二醇（PEG)、仙臺病毒（HVJ)等，進而為了提 高融合效率，根據(jù)期望添加二甲基亞砜等助劑使用。
[0113] 免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設(shè)定。例如，相對于骨髓瘤細胞，優(yōu)選 使免疫細胞為1至10倍。作為用于前述細胞融合的培養(yǎng)液，使用例如適于前述骨髓瘤細胞 株的生長的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及用于此種細胞培養(yǎng)的通常的培養(yǎng)液，進而可 優(yōu)選添加胎牛血清（FCS)等血清補液。
[0114] 對于細胞融合，將規(guī)定量的前述免疫細胞和骨髓瘤細胞在前述培養(yǎng)液中充分混 合，將預先加熱至37°C左右的PEG溶液（例如平均分子量1000至6000左右）通常以30至 60%(w/v)的濃度添加?；旌弦和ㄟ^緩慢混合而形成所期望的融合細胞（雜交瘤）。其次， 依次添加上述列舉的適當?shù)呐囵B(yǎng)液，通過重復進行離心除去上清的操作，可以除去對雜交 瘤的生長不利的細胞融合劑等。
[0115] 這樣得到的雜交瘤可通過用通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液（含有次黃嘌呤、 氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液）培養(yǎng)來進行選擇。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可持續(xù)足夠所 期望的雜交瘤以外的細胞（非融合細胞）死亡的時間（通常，所述足夠的時間為數(shù)天至數(shù) 周）。其次，通過通常的有限稀釋方法，實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0116] 如此得到的雜交瘤可通過使用對應(yīng)于用于細胞融合的骨髓瘤所具有的選擇標記 物的選擇培養(yǎng)液來進行選擇。例如，具有HGPRT或TK缺失的細胞可以通過用HAT培養(yǎng)液 (含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液）培養(yǎng)來進行選擇。即，在細胞融合中使用HAT 敏感性的骨髓瘤細胞時，在HAT培養(yǎng)液中，與正常細胞的細胞融合成功了的細胞可選擇性 地生長。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可以持續(xù)足夠所期望的雜交瘤以外的細胞（非融合細 胞）死亡的時間。具體而言，通常通過數(shù)天至數(shù)周的培養(yǎng)，可以選擇所期望的雜交瘤。其次， 可通過通常的有限稀釋方法，實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0117] 所期望抗體的篩選和單克隆優(yōu)選可通過公知的基于抗原抗體反應(yīng)的篩選方法來 實施。例如，與IL-6R結(jié)合的單克隆抗體可以與細胞表面表達的IL-6R結(jié)合。這樣的單克 隆抗體可通過例如FACS (熒光活化細胞分選）來篩選。FACS是可以通過用激光分析與熒光 抗體接觸的細胞并測定各細胞發(fā)出的熒光來測定抗體對細胞表面的結(jié)合的系統(tǒng)。
[0118]為了利用FACS來對產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤進行篩選，首先制備表達 IL-6R的細胞。優(yōu)選用于篩選的細胞是強制表達IL-6R的哺乳動物細胞。作為對照，通過使 用用作宿主細胞的未轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，可以選擇性地檢測抗體對細胞表面的IL-6R的 結(jié)合活性。即，通過選擇產(chǎn)生不與宿主細胞結(jié)合、而與IL-6R強制表達細胞結(jié)合的抗體的雜 交瘤，可以獲得產(chǎn)生IL-6R單克隆抗體的雜交瘤。
[0119] 或者，可以基于ELISA的原理來評價抗體對固定化的IL-6R表達細胞的結(jié)合活性。 例如，將IL-6R表達細胞固定于ELISA板的孔中。使雜交瘤的培養(yǎng)上清液與孔內(nèi)的固定化 細胞接觸，檢測與固定化細胞結(jié)合的抗體。單克隆抗體來源于小鼠時，與細胞結(jié)合的抗體可 通過抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。通過這些篩選選擇出的、產(chǎn)生具有抗原結(jié)合能力的所期 望的抗體的雜交瘤可以通過有限稀釋方法等進行克隆。
[0120] 這樣制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。此外，該 雜交瘤可以在液氮中長期保存。
[0121] 按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，可從其培養(yǎng)上清液中獲得所期望的單克隆抗體。 或者，可以將雜交瘤給予和其具有相容性的哺乳動物并使其生長，從其腹水中獲得單克隆 抗體。前者的方法適于獲得高純度的抗體。
[0122] 也可以適宜地使用由從該雜交瘤等抗體產(chǎn)生細胞克隆的抗體基因編碼的抗體。將 克隆的抗體基因整合至適當?shù)妮d體中，導入宿主，由此表達由該基因所編碼的抗體。用于抗 體基因的分離、向載體中的導入以及宿主細胞的轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)由例如Vandamme等確立 (Eur.J. Biochem. (1990) 192 (3)，767-775)。此外，如下所述的重組抗體的制備方法也是 公知的。
[0123] 例如，由產(chǎn)生抗IL-6R抗體的雜交瘤細胞獲得編碼抗IL-6R抗體的可變區(qū)（V區(qū)） 的cDNA。為此，通常首先從雜交瘤提取總RNA。作為用于從細胞提取mRNA的方法，例如可 使用如下所述的方法： -胍超離心法（Biochemistry (1979) 18 (24)，5294-5299) -AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1)， 156-159)。
[0124]提取的 mRNA 可使用 mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience 制）等 進行純化?；蛘哌€市售有 QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience 制）等這樣的用于從細胞直接提取總mRNA的試劑盒。使用這種試劑盒，可從雜交瘤獲得 mRNA?？梢允褂梅崔D(zhuǎn)錄酶由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可通過AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化學工業(yè)社制）等合成。此外，為 了 cDNA的合成和擴增，可以適宜采用使用了 SMART RACE cDNA擴增試劑盒（Clontech制） 和 PCR 的 5'-RACE 法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (23)，8998-9002、 NucleicAcidsRes. (1989) 17 (8)，2919-2932)。進而，可以在這種 cDNA 的合成過程中 向cDNA的兩末端導入后述適合的限制酶位點。
[0125] 從所得PCR產(chǎn)物純化出目標cDNA片段，接著與載體DNA連接。如此制作重組載體， 并導入大腸桿菌等中，選擇菌落后，可以由形成該菌落的大腸桿菌制備所期望的重組載體。 而且，對于該重組載體是否具有目標cDNA的堿基序列，可以通過公知的方法例如雙脫氧核 苷酸鏈終止法等來確認。
[0126] 為了獲得編碼可變區(qū)的基因，簡便的是利用5' -RACE法，其中使用了可變區(qū)基因 擴增用的引物。首先，將從雜交瘤細胞提取的RNA作為模板來合成cDNA，獲得5'-RACE cDNA 文庫。5'-RACE cDNA文庫的合成中可適宜地使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒等市售的 試劑盒。
[0127] 以所得的5'_RACE cDNA文庫為模板，通過PCR法擴增抗體基因。基于公知的抗體 基因序列，可設(shè)計小鼠抗體基因擴增用的引物。這些引物根據(jù)免疫球蛋白的亞類而具有不 同的堿基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒（Roche Diagnostics)等市售試劑盒來預先確定亞類。
[0128] 具體而言，例如為了獲得編碼小鼠IgG的基因時，可以使用能夠擴增編碼作為重 鏈的Y 1、Y 2a、Y 2b、Y 3、作為輕鏈的K鏈和：V鏈的基因的引物。為了擴增IgG的可變 區(qū)基因，通常，3'側(cè)的引物采用會退火到相當于接近可變區(qū)的恒定區(qū)的部分上的引物。而 5'側(cè)的引物則采用5' RACE cDNA文庫制作試劑盒所附帶的引物。
[0129] 利用如此擴增得到的PCR產(chǎn)物，可以重構(gòu)由重鏈和輕鏈的組合構(gòu)成的免疫球蛋 白。將經(jīng)重構(gòu)的免疫球蛋白針對IL-6R的結(jié)合活性作為指標，可篩選所期望的抗體。例如， 為了獲得針對IL-6R的抗體時，進一步優(yōu)選抗體對IL-6R的結(jié)合是特異性的。與IL-6R結(jié) 合的抗體可例如如下所述進行篩選： (1) 使含有由雜交瘤獲得的cDNA所編碼的V區(qū)的抗體與IL-6R表達細胞接觸的步驟； (2) 檢測IL-6R表達細胞與抗體的結(jié)合的步驟；以及 (3) 選擇與IL-6R表達細胞結(jié)合的抗體的步驟。
[0130] 檢測抗體和IL-6R表達細胞的結(jié)合的方法是公知的。具體而言，通過如前所述的 FACS等方法，可檢測抗體與IL-6R表達細胞的結(jié)合。為了評價抗體的結(jié)合活性，可適宜利用 IL-6R表達細胞的固定標本。
[0131] 作為以結(jié)合活性為指標的抗體的篩選方法，還可適宜采用淘選法，其利用了噬菌 體載體。從多克隆抗體表達細胞群以重鏈和輕鏈的亞類的文庫的形式獲得抗體基因時，有 利的是利用噬菌體載體的篩選方法。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因通過用適當?shù)慕宇^序 列連接，可形成單鏈Fv (scFv)。通過將編碼scFv的基因插入噬菌體載體，可以獲得在表面 表達scFv的噬菌體。該噬菌體與所期望的抗原接觸后，回收與抗原結(jié)合的噬菌體，從而可 以回收編碼具有目標結(jié)合活性的scFv的DNA。通過根據(jù)需要重復該操作，可以濃縮具有所 期望結(jié)合活性的scFv。
[0132] 得到編碼抗IL-6R抗體的V區(qū)的目標cDNA后，通過識別插入在該cDNA的兩末端 的限制酶位點的限制酶，將該cDNA消化。優(yōu)選的限制酶會識別并消化在構(gòu)成抗體基因的堿 基序列中出現(xiàn)頻率低的堿基序列。進而，為了將1拷貝的消化片段以正確方向插入載體，優(yōu) 選插入能提供粘性末端的限制酶。將如上所述消化的編碼抗IL-6R抗體的V區(qū)的cDNA插 入適當?shù)谋磉_載體，由此可獲得抗體表達載體。此時，只要將編碼抗體恒定區(qū)（C區(qū)）的基 因和編碼前述V區(qū)的基因框內(nèi)融合，則可獲得嵌合抗體。這里，嵌合抗體是指恒定區(qū)和可變 區(qū)的來源不同。因此，除了小鼠-人等異種嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也含有在本 發(fā)明的嵌合抗體中。通過在預先具有恒定區(qū)的表達載體中插入前述V區(qū)基因，可以構(gòu)建嵌 合抗體表達載體。具體而言，例如，可在保持有編碼所期望抗體恒定區(qū)的DNA的表達載體的 5'側(cè)適宜地配置消化前述V區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。對經(jīng)相同組合的限制酶消 化的兩者進行框內(nèi)融合，由此構(gòu)建嵌合抗體表達載體。
[0133] 為了制備抗IL-6R單克隆抗體，以在表達調(diào)控區(qū)的調(diào)控下進行表達的方式，將抗 體基因整合至表達載體中。用于表達抗體的表達調(diào)控區(qū)含有例如增強子和啟動子。此外， 可以在氨基末端添加合適的信號序列，以使表達的抗體分泌到細胞外。在后述實施例中，作 為信號序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 4)的肽，除此之外 也可以添加合適的信號序列。表達的多肽在上述序列的羧基末端部分被切斷，被切斷的多 肽能夠以成熟多肽的形式分泌到細胞外。其次，用該表達載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，由此?以獲得表達編碼抗IL-6R抗體的DNA的重組細胞。
[0134] 為了表達抗體基因，編碼抗體重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）的DNA被分別整合于不 同的表達載體中。通過用整合有H鏈和L鏈的載體共轉(zhuǎn)化（co-transfect)相同的宿主細 胞，可以表達具備H鏈和L鏈的抗體分子?；蛘?，也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合于單 一表達載體中，并用其轉(zhuǎn)化宿主細胞（參照國際公開WO 1994/011523)。
[0135] 用于將分離的抗體基因?qū)脒m當?shù)乃拗鱽碇谱骺贵w的宿主細胞和表達載體的多 個組合是公知的。這些表達系統(tǒng)均可用于分離本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。將真核細胞用作 宿主細胞時，可適宜使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，動物細胞可例示下述 細胞。
[0136] (1)哺乳類細胞：CHO (中國倉鼠卵巢細胞系）、COS (猴腎細胞系）、骨髓瘤（Sp2/ 0、NS0等）、BHK (幼倉鼠腎細胞系）、Hela、Vero、HEK293 (具有剪切的腺病毒（Ad) 5 DNA的 人胚腎細胞系）、Freestyle293、PER. C6細胞（轉(zhuǎn)化有5型腺病毒（Ad5) ElA和ElB基因的 人胚視網(wǎng)膜細胞系）等（Current Protocols in Protein Science (2001 年 5 月，第 5. 9 單元，表5. 9. 1)) (2) 兩棲類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等 (3) 昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5 等。
[0137] 或者，作為植物細胞，公知有基于來源于煙草（Nicotiana tabacum)等煙草 (Nicotiana)屬的細胞的抗體基因表達系統(tǒng)。植物細胞的轉(zhuǎn)化中，可以適宜使用進行了愈傷 組織培養(yǎng)的細胞。
[0138] 進而，作為真菌細胞，可以使用如下細胞： -酵母：釀酒酵母（Saccharomyces serevisiae)等酵母（Saccharomyces)屬、巴斯德 畢赤酵母（Pichia pastoris)等畢赤酵母屬 _絲狀真菌：黑曲霉菌（Aspergillus niger)等曲霉（Aspergillus)屬。
[0139] 此外，利用原核細胞的抗體基因表達系統(tǒng)也是公知的。例如，使用細菌細胞時，可 適宜利用大腸桿菌（E. coli)、枯草桿菌等細菌細胞。通過轉(zhuǎn)化向這些細胞中導入含有目標 抗體基因的表達載體。通過在體外培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，可以從該轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)物中獲得 所期望的抗體。
[0140] 除了上述宿主細胞之外，重組抗體的產(chǎn)生也可以利用轉(zhuǎn)基因動物。即，可以從導入 有編碼所期望抗體的基因的動物獲得該抗體。例如，抗體基因可以通過框內(nèi)插入編碼乳汁 中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)部，而構(gòu)建為融合基因。作為分泌至乳汁中的蛋白質(zhì)，可 利用例如山羊P酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚 胎，再將該進行了注入的胚胎導入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的轉(zhuǎn)基因山羊（或其后 代）產(chǎn)生的乳汁中，能夠以與乳汁蛋白的融合蛋白的形式獲得所期望的抗體。此外，為了 使由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所期望抗體的乳汁量增加，可以對轉(zhuǎn)基因山羊給予激素（Bio/ Technology (1994)， 12 (7)， 699-702)。
[0141] 對人給予本說明書中記載的抗原結(jié)合分子時，作為該抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，可以適宜采用來源于基因重組型抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該基因重組型抗體為 了降低針對人的異源抗原性等目的已進行了人工改變。基因重組型抗體含有例如人源化 (Humanized)抗體等。這些改變抗體可使用公知方法適宜制備。
[0142] 用于制作本說明書中記載的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體可變區(qū)通常 由被4個框架區(qū)域（FR)保持的3個互補決定區(qū)（complementarity-determining region; CDR)構(gòu)成。CDR是實質(zhì)上決定抗體的結(jié)合特異性的區(qū)域。CDR的氨基酸序列富有多樣性。 另一方面，構(gòu)成FR的氨基酸序列即便是在具有不同結(jié)合特異性的抗體之間也多顯示高度 的同一性。因此，通常認為可以通過CDR的移植來將某抗體的結(jié)合特異性移植到其它抗體。
[0143] 人源化抗體也被稱為重構(gòu)（reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物例如小 鼠抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于獲得人源化抗體的通常的基 因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法， 公知的是例如重疊延伸PCR。重疊延伸PCR中，用于合成人抗體FR的引物中添加有編碼待 移植小鼠抗體CDR的堿基序列。針對4個FR分別準備引物。通常，對于將小鼠CDR移植到 人FR中，選擇與小鼠FR同一性高的人FR，在維持CDR功能方面認為有利。即，通常優(yōu)選利 用下述人FR，其含有與待移植小鼠CDR的相鄰FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
[0144] 此外，連接的堿基序列被設(shè)計為相互框內(nèi)連接。通過各引物單獨地合成人FR。結(jié) 果得到各FR上添加有編碼小鼠CDR的DNA的產(chǎn)物。各產(chǎn)物的編碼小鼠CDR的堿基序列被 設(shè)計為相互重疊。接著，使以人抗體基因為模板合成的產(chǎn)物的重疊CDR部分相互退火，進行 互補鏈合成反應(yīng)。通過該反應(yīng)，人FR通過小鼠⑶R序列而連接。
[0145] 最終3個⑶R和4個FR連接得到的V區(qū)基因，通過會與其5'末端和3'末端發(fā)生退 火并添加有適當?shù)南拗泼缸R別序列的引物而擴增出其全長。將如上所述得到的DNA和編碼 人抗體C區(qū)的DNA以進行框內(nèi)融合的方式插入表達載體中，由此可以制作人型抗體表達用 載體。將該整合載體導入宿主建立重組細胞后，培養(yǎng)該重組細胞，通過表達編碼該人源化抗 體的DNA，從而在該培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生該人源化抗體（參照歐州專利公開EP239400、 國際公開 W01996/002576)。
[0146] 通過定性或者定量地測定并評價如上所述制作的人源化抗體的抗原結(jié)合活性，可 以適宜地選擇人抗體FR，以便通過CDR連接時該CDR形成良好的抗原結(jié)合位點。根據(jù)需要， 也可以按照重構(gòu)人抗體CDR形成合適抗原結(jié)合位點的方式來取代FR的氨基酸殘基。例如， 可以應(yīng)用將小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR導入氨基酸序列的突變。具體而 言，可以向會與FR發(fā)生退火的引物中導入部分堿基序列的突變。通過這樣的引物合成的 FR中導入了堿基序列的突變。通過用上述方法測定并評價進行了氨基酸取代的突變型抗 體的抗原結(jié)合活性，可以選擇具有所期望性質(zhì)的突變FR序列（Cancer Res.，（1993) 53， 851-856)。
[0147] 此外，將具有人抗體基因的全部組成成分的轉(zhuǎn)基因動物（參照國際公開 W01993/012227、W01992/003918、W01994/002602、W01994/025585、W01996/034096、 W01996/033735)作為免疫動物，可以通過DNA免疫獲得所期望的人抗體。
[0148] 進而，使用人抗體文庫通過淘選獲得人抗體的技術(shù)也是已知的。例如，人抗體的V 區(qū)以單鏈抗體（scFv)的形式通過噬菌體展示法表達在噬菌體的表面?？梢赃x擇表達與抗 原結(jié)合的scFv的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進行分析，可以確定編碼與抗原結(jié)合 的人抗體V區(qū)的DNA序列。確定與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列后，將該V區(qū)序列與所期望 的人抗體C區(qū)序列框內(nèi)融合后，插入適當?shù)谋磉_載體，由此可以制作表達載體。將該表達 載體導入上述列舉的適宜表達細胞中，通過使編碼該人抗體的基因表達，可以獲得該人抗 體。這些方法已經(jīng)公知（參照國際公開W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、 W01993/011236、TO1993/019172、TO1995/001438、W01995/015388)。
[0149] 此外，作為獲得抗體基因的方法，除了上述之外，還可適宜地使用如Bernasconi 等（Science (2002) 298，2199-2202)或國際公開W02008/081008中記載的B細胞克隆 (各抗體的編碼序列的鑒定和克隆、其分離、以及用于制備各抗體（特別是IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4)的表達載體構(gòu)建用的用途等）的方法。
[0150]EU編號和Kabat編號 根據(jù)本發(fā)明中使用的方法，分配給抗體的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat規(guī)定 (Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md.，1987年和1991年）。本說明書中，抗原結(jié)合分子為抗體或抗原結(jié)合片段 時，可變區(qū)的氨基酸按照Kabat編號來表示，恒定區(qū)的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的 EU編號來表示。
[0151]離子濃度備件 金屬離子濃度備件 本發(fā)明的一個方式中，離子濃度是指金屬離子濃度。"金屬離子"是指屬于除了氫以外 的堿金屬和銅族等第I族、堿土類金屬和鋅族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和 硅之外的第IV族、鐵族和鉬族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亞族的元素以及銻、鉍、 釙等金屬元素的離子。金屬原子具有釋放出原子價電子而形成陽離子的性質(zhì)，稱這為離子 化傾向。認為離子化傾向大的金屬富有化學活性。
[0152] 作為本發(fā)明中優(yōu)選的金屬離子的實例，可舉出鈣離子。鈣離子參與許多生命現(xiàn)象 的調(diào)節(jié)，鈣離子參與骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收縮，白細胞的運動和吞噬等的活化， 血小板的變形和分泌等的活化，淋巴細胞的活化，組胺的分泌等肥大細胞的活化，兒茶酚胺 a受體或乙酰膽堿受體介導的細胞應(yīng)答，胞吐作用，遞質(zhì)從神經(jīng)元末端的釋放，神經(jīng)元的軸 漿流等。作為細胞內(nèi)的鈣離子受體，已知具有多個鈣離子結(jié)合位點、且認為在分子進化上 來源于共同起源的肌鈣蛋白C、鈣調(diào)蛋白、小白蛋白、肌球蛋白輕鏈等，其結(jié)合模體也大量已 知。還熟知例如，鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2結(jié)構(gòu)域、凝 血蛋白因子IX所含的Gla結(jié)構(gòu)域、脫唾液酸糖蛋白受體或甘露糖結(jié)合受體所含的C型凝集 素、LDL受體所含的A結(jié)構(gòu)域、膜聯(lián)蛋白、血小板反應(yīng)蛋白3型結(jié)構(gòu)域和EGF樣結(jié)構(gòu)域。
[0153] 本發(fā)明中，在金屬離子為鈣離子時，作為鈣離子濃度條件，可舉出低鈣離子濃度條 件和高鈣離子濃度條件。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中含有的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性 隨鈣離子濃度條件而變化是指，低鈣離子濃度和高鈣離子濃度條件的不同導致抗原結(jié)合分 子中含有的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性發(fā)生變化。可舉出例如，高鈣離子濃度條件下 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性高于低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié) 合活性的情形。此外還可例示出，低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性 高于高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性的情形。
[0154] 本說明書中，高鈣離子濃度并不特別限于統(tǒng)一的數(shù)值，可以是優(yōu)選選自IOOy M至 IOmM之間的濃度。此外，在其它方案中，可以是選自200 iiM至5mM之間的濃度。此外，在不 同的方案中，可以是選自400 iiM至3mM之間的濃度，在其它的方案中也可以是選自200 iiM 至2mM之間的濃度。進而，還可以是選自400 M至ImM之間的濃度。特別優(yōu)選可舉出選自 與機體內(nèi)血漿中（血中）的鈣離子濃度接近的500 ii M至2. 5mM之間的濃度。
[0155] 本說明書中，低鈣離子濃度并不特別限于統(tǒng)一的數(shù)值，可以是優(yōu)選選自0. IuM至 30iiM之間的濃度。此外，在其它方案中，可以是選自0. 2iiM至20iiM之間的濃度。此外， 在不同的方案中，可以是選自〇. 5 ii M至10 ii M之間的濃度，在其它的方案中也可以是選自 Iy M至5 M之間的濃度。進而，還可以是選自2 M至M之間的濃度。特別優(yōu)選可舉出 選自與機體內(nèi)的早期內(nèi)體內(nèi)的離子化鈣濃度接近的I U M至5 ii M之間的濃度。
[0156] 本發(fā)明中，低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原 結(jié)合活性意指，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子在選自〇. IyM 至30 ii M之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于選自IOOii M至IOmM之間的鈣離子濃度 下的抗原結(jié)合活性。優(yōu)選意指本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子在 選自0. 5 ii M至IOii M之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于在選自200 ii M至5mM之間 的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性，特別優(yōu)選意指機體內(nèi)的早期內(nèi)體內(nèi)的鈣離子濃度下的抗 原結(jié)合活性弱于機體內(nèi)的血漿中的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性，具體意指抗原結(jié)合分子 在選自IuM至5iiM之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于在選自500 ii M至2. 5mM之 間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性。
[0157] 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨金屬離子濃 度條件而變化與否可以通過使用例如前述結(jié)合活性項目中所記載的公知測定方法來確定。 例如，為了確認與低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子 的抗原結(jié)合活性相比高鈣離子濃度條件下的所述結(jié)構(gòu)域或所述分子的抗原結(jié)合活性變得 更高，對低鈣離子濃度和高鈣離子濃度條件下的所述結(jié)構(gòu)域或所述分子的抗原結(jié)合活性進 行比較。
[0158] 進而，本發(fā)明中，"低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件下 的抗原結(jié)合活性"的表述也可以表述為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的 高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性。應(yīng)予說 明，本發(fā)明中有時也將"低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件下的 抗原結(jié)合活性"記載為"低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性弱于高鈣離子濃度條件下的 抗原結(jié)合活性"，此外，有時也將"使低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃 度條件下的抗原結(jié)合活性"記載為"使低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性弱于高鈣離子 濃度條件下的抗原結(jié)合活性"。
[0159] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜選擇測定抗原結(jié)合活性時的鈣離子濃度以外的條件， 沒有特別限定。例如，可以在ffiPES緩沖液、37 °C的條件下進行測定。例如，可以使用 Biacore (GE Healthcare)等進行測定。對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分 子和抗原的結(jié)合活性的測定，在抗原為可溶型抗原時，通過對固定有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含 有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的芯片流過作為分析物的抗原，由此可以評價對可溶型抗原的 結(jié)合活性，在抗原為膜型抗原時，通過對固定有抗原的芯片流過作為分析物的抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，由此可以評價對膜型抗原的結(jié)合活性。
[0160] 本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中，只要低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性弱于高鈣離 子濃度條件的抗原結(jié)合活性，則低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性和高鈣離子濃度 條件下的抗原結(jié)合活性之比沒有特別限定，優(yōu)選相對于抗原的低鈣離子濃度條件下的 KD(Dissociation constant:解離常數(shù)）和高I丐離子濃度條件的KD之比KD (Ca 3uM)/KD (Ca 2mM)的值為2以上，進一步優(yōu)選KD (Ca 3iiM)/KD (Ca 2mM)的值為10以上，進一步優(yōu) 選1?化&311]\〇/1(0化&21111)的值為40以上。1(0化 &311]\〇/1(0化&21111)的值的上限沒有 特別限定，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)可以制作，則可以是400、1000、10000等任意的值。
[0161] 作為抗原結(jié)合活性的值，在抗原為可溶型抗原時可以使用KD (解離常數(shù)），而在 抗原為膜型抗原時可以使用表觀KD(Apparent dissociation constant:表觀解離常數(shù)）。 KD(解離常數(shù)）和表觀KD(表觀解離常數(shù)）可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行測定，例 如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德圖（Scatchard plot)、流式細胞儀等。
[0162] 此外，作為示出本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的低鈣 濃度條件下的抗原結(jié)合活性和高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性之比的其它指標，還可適宜 使用例如解離速率常數(shù)即kd (Dissociation rate constant:解離速率常數(shù)）。代替KD (解 離常數(shù)）而使用kd(解離速率常數(shù)）來作為示出結(jié)合活性之比的指標時，相對于抗原的 低鈣濃度條件下的kd(解離速率常數(shù)）和高鈣濃度條件下的kd(解離速率常數(shù)）之比即 kd(低鈣濃度條件）/kd (高鈣濃度條件）的值優(yōu)選為2以上，進一步優(yōu)選為5以上，進一步 優(yōu)選為10以上，更優(yōu)選為30以上。kd(低鈣濃度條件）/kd(高鈣濃度條件）的值的上限 沒有特別限定，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識可以制作，則可以為50、100、200等任意的 值。
[0163] 作為抗原結(jié)合活性的值，在抗原為可溶型抗原時可以使用kd(解離速率常數(shù)），在 抗原為膜型抗原時可以使用表觀kd(Apparent dissociation rate constant :表觀解離速 率常數(shù)）。kd (解離速率常數(shù)）和表觀kd (表觀解離速率常數(shù)）可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的方法測定，例如可使用Biacore (GE healthcare)、流式細胞儀等。應(yīng)予說明，本發(fā)明中， 在測定不同鈣離子濃度下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有該結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合 活性時，鈣濃度以外的條件優(yōu)選為相同。
[0164] 例如，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣 離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合分子的篩選方法，可例示W(wǎng)O 2012/073992等（例如段落0200-0213)中記載的方法。
[0165] t?庫 根據(jù)一個方案，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合分子可以由文庫獲得，該文庫主 要由多種抗原結(jié)合分子形成，所述多種抗原結(jié)合分子的序列相互不同，并且其抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域中含有至少一個使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的氨基酸殘 基。作為離子濃度的實例，優(yōu)選可舉出金屬離子濃度或氫離子濃度。
[0166] 本說明書中，"文庫"是指多種抗原結(jié)合分子或含有抗原結(jié)合分子的多種融合多 肽、或編碼它們的序列的核酸、多核苷酸。文庫中所含的多種抗原結(jié)合分子或含有抗原結(jié)合 分子的多種融合多肽的序列并非單一的序列，而是序列相互不同的抗原結(jié)合分子或含有抗 原結(jié)合分子的融合多肽。
[0167] 本說明書中，序列相互不同的多種抗原結(jié)合分子的記載中的"序列相互不同"這一 術(shù)語意指文庫中的各抗原結(jié)合分子的序列相互不同。即，文庫中的相互不同的序列的數(shù)量 反映文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量，有時也被視為"文庫大小"。通常的噬菌體展示 文庫為IO 6至1〇12,通過使用核糖體展示法等公知的技術(shù)，可將文庫大小放大至1〇14。然而， 噬菌體文庫的淘選選擇時使用的噬菌體顆粒的實際數(shù)目通常比文庫大小大10至10, 000 倍。該過量倍數(shù)也稱為"文庫當量數(shù)"，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能夠存在10至 10, 000個。所以，本發(fā)明中的"序列相互不同"這一術(shù)語意指文庫當量數(shù)除外的文庫中的各 抗原結(jié)合分子的序列相互不同，更具體意指序列相互不同的抗原結(jié)合分子存在IO 6至1〇14 個分子、優(yōu)選IO7至1〇12個分子、進一步優(yōu)選IO8至IO11個分子、特別優(yōu)選IO 8至101°個分 子。
[0168] 此外，本發(fā)明的主要由多種抗原結(jié)合分子形成的文庫這一記載中的術(shù)語"多種"， 對于例如本發(fā)明的抗原結(jié)合分子、融合多肽、多核苷酸分子、載體或病毒來說，通常是指這 些物質(zhì)的2種以上的集合。例如，只要某2個以上的物質(zhì)在特定形態(tài)方面相互不同，則表示 該物質(zhì)存在2種以上。作為實例，可舉出氨基酸序列中的特定氨基酸位置觀察到的突變體 氨基酸。例如，當除了柔性殘基以外或除了露出于表面的超變氨基酸位置的特定突變體氨 基酸以外，序列實質(zhì)上相同、優(yōu)選相同的本發(fā)明的2個以上的抗原結(jié)合分子存在時，則本發(fā) 明的抗原結(jié)合分子存在多種。在其它實例中，當除了編碼柔性殘基的堿基以外或除了編碼 露出于表面的超變氨基酸位置的特定突變體氨基酸的堿基以外實質(zhì)上相同、優(yōu)選相同的序 列的本發(fā)明的2個以上的多核苷酸分子存在時，貝U本發(fā)明的多核苷酸分子存在多種。
[0169] 進而，本發(fā)明的主要由多種抗原結(jié)合分子形成的文庫的記載中的"主要由...形 成"的表述反映出文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量中抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨 離子濃度條件而不同的抗原結(jié)合分子的數(shù)量。具體而言，優(yōu)選表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原 結(jié)合分子在文庫中至少存在IO 4個分子。此外，更優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn) 出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在IO5個分子的文庫中獲得。進一步優(yōu)選本發(fā)明的 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在IO 6個分子的文庫中獲 得。特別優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在 IO 7個分子的文庫中獲得。還優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗 原結(jié)合分子至少存在IO8個分子的文庫中獲得。其它表述中，也可適宜地表述為文庫中的 序列不同的獨立克隆的數(shù)量中的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而不同的 抗原結(jié)合分子的比例。具體而言，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的 抗原結(jié)合分子占文庫中序列不同的獨立克隆的數(shù)量的0. 1%至80%、優(yōu)選0. 5%至60%、更優(yōu) 選1%至40%、進一步優(yōu)選2%至20%、特別優(yōu)選4%至10%的文庫中獲得。融合多肽、多核苷 酸分子或載體的情形也與上述相同，可以用分子的數(shù)量或全部分子中的比例來表述。此外， 病毒的情形也與上述相同，可以用病毒個體的數(shù)量或全部個體中的比例來表述。
[0170] 俥抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活件隨鈣離子濃度備件而奪化的氨某酸 通過前述篩選方法篩選的本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合分子可用任意方法制 備，例如，在金屬離子為鈣離子濃度的情形中，可以使用預先存在的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原 結(jié)合分子、預先存在的文庫（噬菌體文庫等）、由對動物進行免疫得到的雜交瘤或來自免疫 動物的B細胞制得的抗體或文庫、向這些抗體或文庫導入能螯合鈣的氨基酸（例如天冬氨 酸或谷氨酸）或非天然氨基酸突變而得的抗體或文庫（能螯合鈣的氨基酸（例如天冬氨酸 或谷氨酸）或非天然氨基酸的含有率提高的文庫或者在特定位置導入能夠螯合鈣的氨基 酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）或非天然氨基酸突變而得的文庫等）等。
[0171] 如前所述，作為使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的氨基酸 的實例，例如，在金屬離子為鈣離子時，只要是形成鈣結(jié)合模體的氨基酸即可，不論其種類 如何。鈣結(jié)合模體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的，并且有詳細記載（例如Springer等（Cell (2000) 102，275-277)、Kawasaki 和 Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2，305-490)、 Moncrief 等（J. Mol. Evol. (1990) 30，522-562)、Chauvaux 等（Biochem. J. (1990) 265，261-265)、Bairoch 和&?(卩￡85 1^?.(1990) 269，454-456)、〇3￥18(恥￥81〇1. (1990) 2，410-419)、Schaefer 等（Genomics (1995) 25，638?643)、Economou 等（EMB0 J. (1990) 9，349-354)、Wurzburg 等（Structure. (2006) 14，6，1049-1058))。即，本 發(fā)明抗原結(jié)合分子中可以含有ASGPR，⑶23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知鈣結(jié) 合模體。作為這種鈣結(jié)合模體的優(yōu)選實例，除了上述之外，還可舉出SEQ ID NO: 5所述的 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中所含的鈣結(jié)合模體。
[0172] 此外，作為使本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中含有的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性隨 鈣離子濃度條件而變化的氨基酸的實例，還可適宜使用具有金屬螯合作用的氨基酸。作為 具有金屬螯合作用的氨基酸的實例，優(yōu)選可舉出例如：絲氨酸（Ser (S))、蘇氨酸（Thr (T))、 天冬酰胺（Asn(N))、谷氨酰胺（Gin(Q))、天冬氨酸（Asp(D))和谷氨酸（Glu(E))等。
[0173] 含有前述氨基酸的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原結(jié) 合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化，則可以是形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可 變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中的任意位置。在一個非限定的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以 由下述文庫獲得，該文庫主要由重鏈的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合 活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。此外，在另 一非限定的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由重鏈的 CDR3中含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原 結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由重鏈的CDR3的以Kabat編號表示的95位、 96位、IOOa位和/或101位含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0174] 此外，在本發(fā)明的非限定的一個方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文 庫獲得，該文庫主要由輕鏈的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣 離子濃度條件而變化的氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。此外，在另一非限定 的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDRl中含 有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu) 域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDRl的以Kabat編號表示的30位、31位和/ 或32位含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0175] 此外，在其它非限定的方式中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該 文庫主要由輕鏈的CDR2中含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在另 一非限定的方案中，提供下述文庫，該文庫主要由輕鏈的CDR2的以Kabat編號表示的50位 含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0176] 進而，在其它非限定的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該 文庫主要由輕鏈的CDR3中含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其 它方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDR3的以 Kabat編號表示的92位含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0177] 此外，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫作為本發(fā)明的不同方案來獲得， 該文庫主要由選自上述記載的輕鏈的CDRl、CDR2和CDR3中的2個或3個CDR含有該氨基 酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。進而，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述 文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的以Kabat編號表示的30位、31位、32位、50位和/或92位 中的任一個以上含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0178] 在特別優(yōu)選的實施方案中，理想的是抗原結(jié)合分子的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的框 架序列具有人的種系框架序列。因此，在本發(fā)明的一個方案中，若框架序列完全為人的序 列，則認為在給予人（例如疾病的治療）時，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子基本或完全不會引起免 疫原性反應(yīng)。根據(jù)上述含義，本發(fā)明的"含有種系序列"意指本發(fā)明的框架序列的一部分與 任意的人的種系框架序列的一部分相同。例如，在本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的重鏈FR2的序 列為多個不同的人的種系框架序列的重鏈FR2序列組合得到的序列時，也是本發(fā)明的"含 有種系序列"的抗原結(jié)合分子。
[0179]作為框架的實例，優(yōu)選可舉出例如：/-1^86(111^口:/八匕386.1]11'(3-0口6.03111.3(3.111^/) 等網(wǎng)站中所包括的、現(xiàn)在已知的完全人型框架區(qū)域的序列。這些框架區(qū)域的序列能夠 適宜用作本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中所含的種系序列。種系序列可基于其相似性來分類 (Tomlinson 等（J. Mol. Biol. (1992) 227，776-798)Williams Immunol. (1993) 23， 1456-1461)和 Cox 等（Nat. Genetics (1994) 7， 162-168))?？?以從分類為7個亞類的V K、分類為10個亞類的V X、分類為7個亞類的VH中適宜選擇合 適的種系序列。
[0180] 完全人型VH序列并不僅限于下述，可適宜舉出例如：VHl亞類（例如，VH1-2、 VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1_69)、VH2 亞類（例如，VH2-5、 VH2-26、VH2-70)、VH3 亞類（VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、 VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、 VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亞類（VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、 乂114-59、￥114-61)、￥冊亞類（￥冊-51)、￥冊亞類（￥冊-1)、￥117亞類（￥117-4、￥117-81)的￥11序 列等。它們也記載于公知文獻（Matsuda等（J. Exp. Med. (1998) 188，1973-1975))等 中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于它們的序列信息適宜設(shè)計本發(fā)明的抗原結(jié)合分子。還可適宜 使用它們以外的完全人型框架或框架的亞區(qū)（sub-region)。
[0181] 完全人型VK序列并不僅限于下述，可適宜舉出例如：分類為Vkl亞類的A20、 A30、LI、L4、L5、L8、L9、Lll、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、 018 ;分類為 Vk2 亞類的 A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011 ;分類為 Vk3 亞類的 A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25 ;分類為Vk4亞類的B3 ;分類為Vk5亞類的B2(本說明 書中也稱為 Vk5_2);分類為 VK6 亞類的 A10、A14、A26 等（Kawasaki 等（Eur. J. Immunol. (2001) 31，1017-1028)、Schable 和 Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374， 1001-1022)和&'ensing-Kuppers 等（Gene (1997) 191，173-181))。
[0182] 完全人型的VA序列并不僅限于下述，可適宜舉出例如：分類為VLl亞類的Vl-2、 V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1_22 ;分 類為 VLl 亞類的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19;分類 為 VL3 亞類的 V3-2、V3-3、V3-4 ;分類為 VL4 亞類的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6 ;分類為 VL5 亞類的 ￥5-1、￥5-2、75-4、￥5-6等（1^￥&8&1^等（6611〇1116 1^8.(1997) 7，250-261))。
[0183] 通常這些框架序列根據(jù)一個或更多個氨基酸殘基的區(qū)別而相互不同。這些框架序 列可以與本發(fā)明的"使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的至少一個氨 基酸殘基"一起使用。作為與本發(fā)明的"使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而 變化的至少一個氨基酸殘基"一起使用的完全人型框架的實例，并不僅限于此，此外還可舉 出：K0L、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM 等（例如，前述的 Kabat 等（1991)和 Wu 等〇. Exp. Med (1970) 132，211-250))。
[0184] 本發(fā)明并不受特定理論的束縛，認為種系序列的使用有望排除大多數(shù)個體中有害 免疫反應(yīng)的一個原因如下所述。通常的免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的親和性成熟階段的結(jié)果造成免疫 球蛋白的可變區(qū)頻繁地產(chǎn)生體細胞的突變。這些突變主要產(chǎn)生在其序列為超變的⑶R的附 近，對框架區(qū)域的殘基也造成影響。這些框架的突變在種系的基因中不存在，此外成為患者 的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人類種群暴露于種系的基因所表達的框架序 列的大多數(shù)，作為免疫耐受性的結(jié)果，預測這些種系的框架在患者中的免疫原性低或為非 免疫原性。為了使免疫耐受性的可能性最大，編碼可變區(qū)的基因可以從通常存在的功能性 種系基因的集合中選擇。
[0185] 為了制作本發(fā)明的前述可變區(qū)序列的序列、重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)序列或者 CDR序列或框架序列中含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨 基酸的抗原結(jié)合分子，可適宜采用位點特異性誘變法（Kunkel等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82，488-492))或重疊延伸PCR等公知方法。
[0186] 例如，通過將被選擇作為預先含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度 條件而變化的至少一個氨基酸殘基的框架序列的輕鏈可變區(qū)、與被制作為隨機可變區(qū)序列 文庫的重鏈可變區(qū)組合，由此可以制作含有本發(fā)明的多種序列相互不同的抗原結(jié)合分子的 文庫。作為這樣的非限定性實例，在離子濃度為鈣離子濃度時，可適宜舉出例如：將SEQ ID NO: 5 (Vk5-2)所述的輕鏈可變區(qū)序列和被制作作為隨機可變區(qū)序列文庫的重鏈可變區(qū)組 合而成的文庫。
[0187] 此外，也可以進行設(shè)計，以使前述被選擇作為預先含有使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原 結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基的框架序列的 輕鏈可變區(qū)的序列中含有作為該氨基酸殘基以外的殘基的各種氨基酸。本發(fā)明中，這樣的 殘基也被稱為柔性殘基。本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性只要隨 離子濃度條件而變化，則該柔性殘基的數(shù)目和位置并不限于特定的方案。即，重鏈和/或輕 鏈的CDR序列和/或FR序列中可以含有一個或更多個的柔性殘基。例如，在離子濃度為鈣 離子濃度時，作為導入SEQ ID NO: 5 (Vk5-2)所述的輕鏈可變區(qū)序列中的柔性殘基的非限 定性實例，可舉出表1或表2中所述的氨基酸殘基。
[0188] [表1]

【權(quán)利要求】
1. 抗原結(jié)合分子在使該抗原從血漿中消除中的使用，其中所述抗原結(jié)合分子包含對抗 原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的氨基 酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly的Fc區(qū)。
2. 權(quán)利要求1的使用，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少一個 以上的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、 268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、 356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位。
3. 權(quán)利要求2的使用，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的任 一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為lie， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gin中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gin中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272 位的氨基酸為 Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro 或 Gin, 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu。
4. 權(quán)利要求1~3中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為對所述抗原的結(jié)合活 性隨鈣離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
5. 權(quán)利要求4的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為結(jié)合活性以下述方式變化的抗原 結(jié)合結(jié)構(gòu)域：在低鈣離子濃度條件下對所述抗原的結(jié)合活性比在高鈣離子濃度條件下對所 述抗原的結(jié)合活性低。
6. 權(quán)利要求1~3中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為對所述抗原的結(jié)合活 性隨pH條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
7. 權(quán)利要求6的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為結(jié)合活性以下述方式變化的抗原 結(jié)合結(jié)構(gòu)域：在pH酸性范圍條件下對所述抗原的結(jié)合活性比在pH中性范圍條件下的結(jié)合 活性低。
8. 權(quán)利要求1~7中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為抗體的可變區(qū)。
9. 權(quán)利要求1?8中任一項的使用，其中，所述Fc區(qū)為在SEQ ID NO: 14、15、16或17的 任一個中含有的Fc區(qū)中以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨基酸為Gly 的Fc區(qū)。
10. 權(quán)利要求1~8中任一項的使用，其中，所述Fc區(qū)在pH酸性范圍條件下的FcRn結(jié)合 活性與SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一個中含有的Fc區(qū)的FcRn結(jié)合活性相比增強。
11. 權(quán)利要求10的使用，其中，所述增強的Fc區(qū)為在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任 一個中含有的Fc區(qū)的氨基酸序列中選自以EU編號表示的下述位置的至少一個以上的氨基 酸被取代的Fc區(qū)：244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439 位、440 位、442 位或447位。
12. 權(quán)利要求11的使用，其中，所述增強的Fc區(qū)在SEQ ID NO: 14、15、16或17中含有 的Fc區(qū)的氨基酸序列中含有選自以EU編號表示的下述位置的氨基酸中的至少一個以上的 氨基酸： 244位的氨基酸為Leu， 245位的氨基酸為Arg， 249位的氨基酸為Pro， 250位的氨基酸為Gin或Glu中的任一個，或者 251位的氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個， 252位的氨基酸為Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一個， 254位的氨基酸為Ser或Thr中的任一個， 255位的氨基酸為Arg、Gly、lie或Leu中的任一個， 256 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個， 257位的氨基酸為Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一個， 258位的氨基酸為Asp， 260位的氨基酸為Ser， 262位的氨基酸為Leu， 270位的氨基酸為Lys， 272位的氨基酸為Leu或Arg中的任一個， 279 位的氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任 一個， 283 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Trp或Tyr中的任一個， 285位的氨基酸為Asn， 286位的氨基酸為Phe， 288位的氨基酸為Asn或Pro中的任一個， 293位的氨基酸為Val， 307位的氨基酸為Ala、Glu、Gin或Met中的任一個， 308位的氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個， 309位的氨基酸為Pro， 311 位的氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一個， 312位的氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個， 314位的氨基酸為Ala或Leu中的任一個， 316位的氨基酸為Lys， 317位的氨基酸為Pro， 318位的氨基酸為Asn或Thr中的任一個， 332 位的氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個， 339位的氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個， 341位的氨基酸為Pro， 343位的氨基酸為Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr或Tyr中的任一個， 375位的氨基酸為Arg， 376位的氨基酸為Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一個， 377位的氨基酸為Lys， 378位的氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一個， 380位的氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個， 382 位的氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個， 385 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一個， 386 位的氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個， 387位的氨基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一個， 389位的氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個， 423位的氨基酸為Asn， 427位的氨基酸為Asn， 428位的氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個， 430 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個， 431位的氨基酸為His或Asn中的任一個， 433位的氨基酸為Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro或Ser中的任一個， 434位的氨基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一個， 436 位的氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一個， 438位的氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個， 440位的氨基酸為Lys，或者， 442位的氨基酸為Lys。
13. 權(quán)利要求1~12中任一項的使用，其中，所述抗原結(jié)合分子為抗體。
14. 藥物組合物，其包含含有下述結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合分子：對抗原的結(jié)合活性隨離子濃 度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、且271位的氨 基酸為Gly的Fc區(qū)。
15. 權(quán)利要求14的藥物組合物，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至 少一個以上的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、 267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、 355 位、356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位。
16. 權(quán)利要求15的藥物組合物，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基 酸中的任一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為lie， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gin中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gin中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gin中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu。
17. 抗原結(jié)合分子的制備方法，其包括以下（a)~(e)的步驟： (a)獲得對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟， (b) 獲得編碼在所述步驟（a)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因的步驟， (c) 將在所述步驟（b)中獲得的基因與編碼以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、 且271位的氨基酸為Gly的Fc區(qū)的基因有效連接的步驟， (d) 培養(yǎng)含有在所述步驟（c)中有效連接的基因的宿主細胞的步驟， (e) 從在所述步驟（d)中獲得的培養(yǎng)液分離抗原結(jié)合分子的步驟。
18. 權(quán)利要求17的制備方法，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少 一個以上的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356位、358位、396位、409位和419位。
19. 權(quán)利要求18的制備方法，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸 中的任一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為lie， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gin中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gin中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gin中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu。
20. 包含抗原結(jié)合分子的藥物組合物的制備方法，其包括以下（a)~(e)的步驟： (a) 獲得對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟， (b) 獲得編碼在所述步驟（a)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因的步驟， (c) 將在所述步驟（b)中獲得的基因與編碼以EU編號表示的238位的氨基酸為Asp、 且271位的氨基酸為Gly的Fc區(qū)的基因有效連接的步驟， (d) 培養(yǎng)含有在所述步驟（c)中有效連接的基因的宿主細胞的步驟， (e) 從在所述步驟（d)中獲得的培養(yǎng)液分離該抗原結(jié)合分子的步驟。
21. 權(quán)利要求20的制備方法，其中，所述Fc區(qū)為選自以EU編號表示的下述位置的至少 一個以上的氨基酸進一步被取代的Fc區(qū)：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356位、358位、396位、409位和419位。
22. 權(quán)利要求21的制備方法，其中，所述Fc區(qū)含有以EU編號表示的下述位置的氨基酸 中的任一個以上： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Tyr， 237位的氨基酸為Asp， 264位的氨基酸為lie， 265位的氨基酸為Glu， 266位的氨基酸為Phe、Met或Leu中的任一個， 267位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Gin中的任一個， 268位的氨基酸為Asp、Glu或Gin中的任一個， 269位的氨基酸為Asp， 272位的氨基酸為Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gin中的任一個， 274位的氨基酸為Gln， 296位的氨基酸為Asp或Phe中的任一個， 326位的氨基酸為Ala或Asp中的任一個， 327位的氨基酸為Gly， 330位的氨基酸為Lys或Arg中的任一個， 331位的氨基酸為Ser， 332位的氨基酸為Thr， 333位的氨基酸為Thr、Lys或Arg中的任一個， 355位的氨基酸為Gln， 356位的氨基酸為Glu， 358位的氨基酸為Met， 396 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一個， 409位的氨基酸為Arg， 419位的氨基酸為Glu。
【文檔編號】C12P21/02GK104244980SQ201380021594
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月24日
【發(fā)明者】井川智之, 前田敦彥, 巖柳有起, 原谷健太, 堅田仁, 門野正次郎, 味元風太 申請人:中外制藥株式會社